Name: Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a diferenciar células estaminais embrionárias humanas in vivo através de enxerto na cápsula renal de camundongos imunocomprometidos. Este método permite rastrear o destino tecidual das células marcadas geneticamente por 8 a 12 semanas.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa de pesquisa abrangente do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RC1-00104), um Serviço de Saúde Pública Grant (HL085377) de NHLBI, e um presente da Fundação Pollin para HSB

O protocolo escrito abaixo é baseada em parâmetros publicados relatado pelos autores, com algumas modificações. O protocolo é realizada com a aprovação do Animal Care UCSF Institucional e Use (IACUC) e Supervisão Stem Cell Research (SCRO) Comités. I. Cultura de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) <ol><li> HESCs crescer no padrão 6-bem (3,5 cm de diâmetro poços) placas. </li><li> Pelo menos 12 horas antes da passaging células, fibroblastos de sementes embrionárias de rato (MEF; obtido a partir de camundongos CF1 dia e12.5 timed-acoplado, irradiados em 1000 Ci) alimentador de células em placas revestidas com gelatina 1% (6,7). MEFs deve ser banhado em 50-60 confluência%, ou 4 x 10 5 células por 3,5 cm de diâmetro bem (Figura 1). </li><li> Células passagem quando colônias atingiram confluência ~ 70% (Figura 2). </li><li> A passagem das células, o crescimento médio aspirar KSR (6) dos poços e substituir com 0,5 ml de meio contendo colagenase IV em KSR em uma concentração de 1 mg / ml. </li><li> Incubar as placas com colagenase IV a 37 ° C / 5% CO 2 por 5 minutos ou até que as bordas de colônias começam a levantar a partir da placa. </li><li> Remover colagenase IV da placa, adicionar 0,5 ml de KSR a cada poço, e manualmente raspar células para remover completamente a partir da placa. </li><li> Recolher a suspensão de células de cada lugar, bem em um tubo de 15 ml cônico, e permitem que as células de resolver pela força da gravidade por 5 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante do tubo, deixando as células e médias empresas em um volume total de ~ 300 ul. </li><li> Usando um conjunto de 200 micro-pipetador mL no volume máximo, gentilmente pipeta suspensão de células 5-6 vezes para acabar com as colônias. </li><li> Traga a suspensão de célula para um volume total de 9 ml por poço original de células usando KSR médio (ou seja, se um bem é colhida, o tubo deve conter 9 ml). Suplementar o meio com recombinante fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (bFGF) a uma concentração de 12,5 ng / ml. </li><li> Depois de lavar a novos poços contendo células MEF (consulte a etapa 2) com fosfato de Dulbecco solução salina tamponada (DPBS) para remover todos os soro, adicionar 3 ml de suspensão de células para cada poço e incubar as placas a 37 ° CO C / 5% 2. </li><li> Alterar médio KSR com bFGF 24 horas após a passagem, e cada 24-48 horas até que as células estão prontas para serem várias passagens novamente. </li></ol> II. Preparação de CTEh pellet para enxertia <ol><li> Menos 24 horas antes de enxertia, adicione inibidor ROCHA ao meio KSR para uma concentração final de 10μM de aumentar a viabilidade celular (8). Um poço de células em confluência ~ 70% (5 x 10 5 células) vai criar dois pellets, com dois pellets inserido por cápsula renal. </li><li> Para preparar pellets de células para enxertia (9), incubar a ROCHA inibidor tratados com culturas com colagenase IV por 5 minutos a 37 ° CO C / 5% 2. </li><li> Aspirar o IV colagenase do poço e substituir por um DPBS ml com 10% de penicilina / estreptomicina (pen / strep). </li><li> Manualmente raspar as colônias da placa, lavar bem com um adicional de 1 ml DPBS com caneta / strep, e transferência de cada alíquota de 1ml de suspensão celular para um microtubo de 1,5 ml. </li><li> Girar tubos de microcentrífuga brevemente a 8.000 x g, aspirar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em DPBS 500μl com caneta / strep. </li><li> Para ajudar a vincular a células juntas para transplante, adicionar 100μl 1 mg / ml de lectina de Phaseolus vulgaris (PHA) em DPBS a cada tubo. </li><li> Incubar a célula / suspensão PHA em temperatura ambiente por 5 minutos, em seguida, girar durante 2 minutos a 8.000 x g. Girar os tubos de 180 ° dentro de seus poços de rotor e girar novamente por 2 minutos a 8.000 x g. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante deixando o pellet intacta. </li><li> Desalojar os pellets de células dos tubos com cuidado pipetando KSR 200μl junto à borda da pelota até que lentamente se levanta. </li><li> Uma vez deslocada, transferir imediatamente as pelotas de 0.4μm insere MILLICELL colocados em poços 3,5 cm de diâmetro contendo 3 ml KSR, e incubar por 2 horas durante a noite a 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> III. Cápsula renal enxertia <ol><li> Executar todos os procedimentos animal, em conformidade com as diretrizes institucionais, utilizando técnica asséptica apropriada. </li><li> Anestesiar ratos SCID bege (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / Crl), com idades entre 8-12 semanas, usando uma combinação de O2 inalado 3% isoflurane/0.5% e tribromoetanol intraperitoneal (Avertin; 25 mg / kg preparada na hora). Dois pellets por célula do rato será enxertada usando técnicas descritas (10). </li><li> Depois de colocar o mouse sobre uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia, raspar a área da incisão, em seguida, desinfectá-la com clorexidina. Faça uma incisão de 2,5 cm através da pele apenas fora do centro, mas paralelo à coluna vertebral. </li><li> Mantendo a área úmida incisão com salin estérile, fazer uma pequena incisão através do músculo, logo abaixo das costelas e ~ 1 cm da coluna vertebral. A incisão deve ser grande o suficiente para puxar o rim através, mas pequeno o suficiente para que o rim não vai escorregar de volta para dentro da cavidade abdominal sem força. </li><li> Puxe delicadamente o rim através da incisão do músculo através de um vidro Pasteur pipeta que tem sido puxado para dentro da forma de um gancho, sem corte ligeiramente curvada. </li><li> Molhar o rim com DPBS estéril para evitar a cápsula de secar. Isto pode ser necessário repetir todo o procedimento, como a cápsula é muito frágil. </li><li> Utilizando uma pinça Dumont # 5, puxe a cápsula a partir do rim e fazer uma incisão 2 milímetros usando uma tesoura primavera Vannas. </li><li> Com outra pipeta de vidro que foi colocado em uma sonda muito fina, embotado, faça uma pequena bolsa entre a cápsula eo rim. </li><li> Usando uma ponteira de grande orifício colocado em uma pipeta de transferência descartável, tomar uma única célula pellet a partir da inserção MILLICELL. Certifique-se de ter tão pouco de mídia extra junto possível, como a mídia em excesso pode interferir com a transferência da pelota. </li><li> Segurando na borda da incisão para criar o bolso, coloque delicadamente o sedimento ao lado da abertura e empurre-o no bolso em direção a um pólo do rim com a pipeta puxado. </li><li> Repita o processo com uma pelota segundo. Coloque este sob a cápsula do rim mesmo, mas em direção ao pólo oposto. </li><li> Cuidadosamente coloque a cápsula de volta para a pellets. As pelotas deve ficar dentro do bolso, e sem suturas são necessárias para fechar a cápsula. </li><li> Com cuidado, empurre o rim de volta para a cavidade abdominal e fechar a parede muscular utilizando fio de seda 4-0 (ou menor) com agulha de corte reverso ligado. A incisão deve ser pequeno o suficiente para que apenas uma única sutura é necessário. </li><li> Feche a pele com uma série de 4-5 pontos interrompidos, utilizando o mesmo material de sutura. </li><li> Antes de colocar o mouse de volta em sua gaiola, administrar 0,05 mg / kg de buprenorfina (11,12) e 5 mg / kg de cetoprofeno (12,13) ​​como analgésicos de curto prazo e longo prazo, respectivamente. Substâncias controladas só deve ser utilizado de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Transferir os animais de volta para sua gaiola e permitir que ele se recupera da anestesia em uma almofada de aquecimento. Isso deve levar cerca de 20-30 minutos. </li><li> Uma vez que o mouse é totalmente ambulatorial, ele pode ser devolvido para a instalação de habitação animal. </li></ol> IV. Colheita teratoma fixação, e secção <ol><li> Em 8-12 semanas após a cirurgia, deve haver um teratoma quase palpável perto do rim. Grande, cheio de líquido cistos, muitas vezes, desenvolver, bem como, a partir de 6-8 semanas. Estes podem necessitar de uma colheita mais cedo, se eles causam sofrimento ao animal. Desde teratomas crescer a taxas mais lentas do que cistos, no entanto, você vai querer esperar tanto tempo quanto possível para obter um teratoma de tamanho suficiente para a análise (ou seja, pelo menos 8 semanas). </li><li> Remover o rim, teratoma, e qualquer cistos em torno de um bloco de tecido da cavidade abdominal utilizando a mesma abordagem cirúrgica pela qual o rim foi originalmente acessado (consulte a Seção III, os passos 1-4 acima). </li><li> Coloque todo o bloco de tecido excisado em um tubo contendo formol tamponado 10%. </li><li> Permitir que o teratoma para corrigir durante a noite a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, retire o teratoma do tubo. Dissecar fora qualquer cistos nos rins e, tanto quanto possível sem danificar o teratoma si (Figura 3). Teratomas maiores podem ser cortados ao meio para facilitar a dissecção e incorporação. </li><li> O processo de teratoma usando uma técnica de fixação de parafina padrão. Unidades automáticos estão disponíveis (por exemplo, hipercentro Shandon): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> 80% de álcool Flex </td><td> 2 horas </td></tr><tr><td> II. </td><td> 80% de álcool Flex </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> III. </td><td> 85% de álcool Flex </td><td> 1,5 horas </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 95% de álcool Flex </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> V. </td><td> 100% de álcool Flex </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 100% de álcool Flex </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> VII. </td><td> 100% de álcool Flex </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> X. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Parafina (TissuePrep) </td><td> 2 horas </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Parafina (TissuePrep) </td><td> 2 horas </td></tr></tbody></table></li></ol> V. Imunohistoquímica e análise <ol><li> Uma vez incorporado na seção de parafina, o teratoma em 5m cortes seriados usando um micrótomo rotativo, e as seções flutuam em slides. </li><li> Antes de coloração, cozer os slides por pelo menos uma hora. </li><li> Mancha as lâminas com hematoxilina e eosina usando métodos padrão para identificar estruturas de tecidos representante de cada um dos três folhetos embrionários (Figura 4): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Lavagem de xileno </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> II. </td><td> Xileno </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> III. </td><td> Álcool 100% </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> IV. </td><td> Álcool 100% </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> V. </td><td> Álcool a 95% </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 80% de álcool </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> VII. </td><td> Lavagem com água (diversas alterações) </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Hematoxilina de Gill # 3 </td><td> 2-5 minutos </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Lavagem com água (diversas alterações) </td><td> até que a água corre claro </td></tr><tr><td> X. </td><td> Água Scott (para núcleos azul) </td><td> 3 minutos ou mais </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Lavagem com água (diversas alterações) </td><td> 1-2 minutos </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Eosina Y </td><td> Um minuto </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> Lavagem com água (diversas alterações) </td><td> 30 segundo </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> 80% de álcool </td><td> Um minuto </td></tr><tr><td> XV. </td><td> Álcool a 95% </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> Álcool a 95% </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> Álcool 100% </td><td> 3 minutos </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> 100% de álcool (limpo) </td><td> 3 minutos </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> Xileno </td><td> 2 minutos ou mais </td></tr><tr><td> XX. </td><td> Xileno </td><td> 2 minutos ou mais </td></tr></tbody></table></li><li> Montar uma lamela em cada slide com Permount. </li></ol> VI. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Chapeamento de fibroblastos irradiados CF1 embrionárias de rato como uma camada de alimentação para hESCs cultura indiferenciada. MEFs são banhados em ~ confluência de 50%, como mostrado aqui, ou 4 x 10 5 células por 3,5 cm de diâmetro bem em uma placa de cultura de 6 bem. Bar, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. HESCs exemplo da cultura confluentes de hESCs indiferenciados em uma camada de alimentação MEF. São cultivadas em camadas alimentador MEF até confluentes ~ 70%, como mostrado aqui, então várias passagens como descrito. Bar, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Exemplo de teratomas explantado. Seguindo explante, o teratoma, rim e qualquer tecido acessório são fixos como um bloco em formalina, em seguida, o rim e tecido acessório são cuidadosamente aparado antes de inclusão em parafina. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Teratomas derivado hESCs indiferenciada conter tecidos representativos de todos os três camadas germinativas in vivo. Um teratoma, como um representado na Figura 3, foi seccionado e corado com hematoxilina e eosina para identificar tecidos embrionários. hESCs dar origem a tecidos derivados dos três folhetos embrionários (ectoderma (A, B), mesoderma (C), endoderme (D). (A) estrutura do tubo neural Nascente. (B) epitélio escamoso primitivo. (C) Cartilagem rodeado por cápsula de mesênquima condensado. (D) estrutura glandular intestinal. Bar, 100 mm. Imagens reproduzidas com permissão do autor. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Análise teratoma pode ser usado para mapear o destino do tag, hESCs indiferenciada. Como já publicados (9), uma mistura de hESCs especificamente marcados com hESCs untagged pode ser usado para mapear o destino das células marcado em um ensaio de formação de teratomas. Como mostrado aqui, hESCs indiferenciada expressando o marcador de superfície, CD133, e marcou com a proteína verde fluorescente melhorada (eGFP), foram misturados com untagged, hESCs indiferenciada. Estes foram usados ​​para formar teratomas pela cápsula renal enxertia. Análise imunohistoquímica de hematoxilina e eosina seções manchadas de teratoma com anticorpo anti-eGFP demonstra o destino neuroectodérmico da CD133 hESCs +. Teratomas foram processados ​​como na Figura 4 e contrastado com anticorpo anti-eGFP (marrom) para localizar os derivados de células CD133 + + GFP dentro dos tecidos. CD133 + células derivadas (setas) foram observadas nos tecidos decorrentes da ectoderma embrionário, especificamente epitélio neural (esquerda) e nascente do tubo neural estruturas semelhantes (à direita). Bar, 100 mm. Imagens reproduzidas com permissão do autor. Gelatina <ul><li> 0,1% de gelatina Porcina </li><li> DPBS 99,9% <ul><li> Adicione a gelatina para DPBS, incubar a 37 ° C por uma hora ou até que todos gelatina entra em solução, e filtro de esterilizar (0.22μm) antes do uso. </li></ul></li></ul> MEF médio <ul><li> 10% de soro fetal bovino (Qualificado) </li><li> Dulbecco 90% do Modified Meio Essencial (D-MEM) </li><li> 1x L-Glutamina </li><li> 1x Pen / Strep <ul><li> Filtro de esterilizar antes do uso. </li></ul></li></ul> KSR médio (substituição Knockout Serum) <ul><li> Substituição de soro de 20% KnockOut </li><li> 80% KnockOut D-MEM </li><li> 1x L-Glutamina </li><li> 1x aminoácidos não essenciais </li><li> 0,1 mM β-mercaptoetanol / </li><li> 12,5 ng / ml bFGF <ul><li> Filtro de esterilizar. </li><li> Armazenar a 4 ° C, mas quente a 37 ° C antes de adicionar às células. </li><li> Adicionar bFGF imediatamente antes da utilização. </li></ul></li></ul> Colagenase IV <ul><li> Dissolver 1 mg / ml em meio KSR, colocando a 37 ° C por 1-2 horas ou até todo o pó entra em solução. </li><li> Filtro de esterilizar. </li></ul> Avertin <ul><li> 0,25 g 2,2,2-tribromoetanol </li><li> 0,25 ml 2-metil-2-butanol <ul><li> Incubar a 37 ° C durante a noite para formar uma solução 100%. </li><li> Várias horas antes da cirurgia, diluir a 2,5% solução de trabalho usando DPBS e incubar a 37 ° C durante pelo menos 1 hora. </li><li> Filtro de esterilizar e alíquota. </li><li> Tribromoetanol é altamente sensível à luz, de modo a proteger da luz em todas as fases de preparação e uso. </li><li> Prepare não mais de 12-24 horas antes de usar. </li></ul></li></ul> Buprenorfina <ul><li> 1 mg / ml solução estoque em metanol <ul><li> Diluir a 0,015 mg / ml solução estéril de trabalho usando H 2 O. </li><li> Armazenar a -20 ° C por até 1 mês. </li></ul></li></ul> Cetoprofeno <ul><li> 0,5 mg / ml solução de trabalho na DPBS <ul><li> Adicionar DPBS, incubar overnight a 37 ° C por 1-2 horas ou até todo o pó entra em solução. </li><li> Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li></ul></li></ul>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Nós adaptamos um ensaio de formação altamente eficiente teratoma com a finalidade de mapear o destino de diferenciar hESCs em um ambiente em vivo. Um pequeno número de hESCs especificamente selecionados é misturado com indiferenciada hESCs tipo selvagem e lectina Phaseolus vulgaris para formar um pellet de células. Este é enxertada embaixo da cápsula renal em um mouse imunodeficientes. O destino do hESCs originalmente selecionado pode então ser determinada por imuno-histoquímica (Figura 5), conforme relatado anteriormente (9). Este método fornece uma valiosa ferramenta para identificar e gerar tecidos específicos reagentes para celular baseado em terapia.

<table><tbody><tr><td>2-Metil-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromo&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>Suturas de seda 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>641G</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233FB</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7536</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046-341</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dupont #5</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500233</td><td>Cápsula renal</td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-658</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (qualificado)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Flex</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046344</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina Gill&amp;rsquo;s #3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-204</td><td></td></tr><tr><td>Hemostato, reto</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501241</td><td>Cirurgia geral</td></tr><tr><td>Pinceta de íris</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15914</td><td>Cirurgia geral</td></tr><tr><td>Cetoprofeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Substituto de soro KnockOut</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25020-081</td><td></td></tr><tr><td>Insertos MILLICELL</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501754</td><td>Cirurgia geral</td></tr><tr><td>Parafina (TissuePrep)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8002-74-02</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1668</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor ROCK</td><td>Calbiochem</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos SCID beige</td><td>Charles River Laboratories</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Scott&amp;rsquo;s Wash</td><td>Fisher Scientific</td><td>6697-32</td><td>Ricca Chemicals</td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14003</td><td>Cápsula renal</td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr></tbody></table>

mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm uma capacidade ilimitada de auto-renovação ea capacidade de se diferenciar em células derivadas de todos os três folhetos embrionários (1). Diferenciação dirigida de hESCs em tipos específicos de células tem gerado muito interesse no campo da medicina regenerativa (por exemplo, (2-5)), e métodos para determinar o<em&gt; In vivo</em&gt; Destino de hESCs selecionados ou manipulados são essenciais para este esforço. Nós adaptamos um ensaio de formação altamente eficiente teratoma para esta finalidade. Um pequeno número de hESCs especificamente selecionados é misturado com indiferenciada hESCs tipo selvagem e lectina Phaseolus vulgaris para formar um pellet de células. Este é enxertada embaixo da cápsula renal em um mouse imunodeficientes. Sómente 2,5 x 10<sup&gt; 5</supHESCs&gt; são necessários para formar um 16 cm<sup&gt; 3</sup&gt; Teratoma dentro de 8-12 semanas. O destino do hESCs originalmente selecionado pode então ser determinado por imunohistoquímica. Este método fornece uma ferramenta valiosa para a caracterização de tecidos específicos reagentes para celular baseado em terapia.

Diferenciação dirigida de hESCs em células específicas tem gerado muito interesse na medicina regenerativa. Nós fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para determinar a<em&gt; In vivo</em&gt; Destino de hESCs selecionados que proporciona uma ferramenta valiosa para a caracterização de tecidos específicos reagentes para celular baseado em terapia.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) possuem uma capacidade ilimitada de autorrenovação e a habilidade de se diferenciarem em células derivadas dos três...

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células-tronco embrionárias humanas in vivo e determinar seus destinos específicos em tecidos. Isso é realizado primeiramente criando um pellet a partir de células de interesse geneticamente marcadas. O segundo passo do procedimento consiste em colocar cirurgicamente o pellet sob a cápsula renal de um camundongo imunocomprometido.O terceiro passo do procedimento é permitir que o pellet celular se diferencie por oito a doze semanas sob a cápsula do rim de camundongo. O passo final do procedimento é coletar o teratoma resultante, fixá-lo em formalina e analisar o destino das células marcadas por meio de imunohistoquímica. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram as células marcadas se desenvolvendo em uma ou mais das três camadas germinativas, por meio de histologia e imunohistoquímica dos teratomas resultantes.Olá, sou Carissa Ritner do laboratório do Dr. Harold Bernstein no Instituto de Pesquisa Cardiovascular da Universidade da Califórnia em São Francisco. Hoje vamos mostrar um procedimento para desenvolver teratomas por enxerto na cápsula renal. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a diferenciação de células-tronco embrionárias, tanto para garantir que cada linhagem com a qual trabalhamos possa se desenvolver em cada uma das três camadas germinativas quanto para acompanhar o destino de células-tronco marcadas geneticamente in vivo.Todos os procedimentos que mostraremos a vocês são realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF. Além disso, todos os trabalhos com células-tronco embrionárias humanas são realizados com a aprovação do Comitê de Supervisão de Pesquisa com Células-Tronco da UCSF. Então, vamos começar.Para preparar culturas de células-tronco embrionárias humanas, consulte a parte textual deste protocolo. Para observações em capela de fluxo laminar, trate as culturas de células-tronco embrionárias humanas tratadas com inibidor de rock com um miligrama por mililitro de colagenase quatro e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Aspire a colagenase quatro do poço. Substitua-a por um mililitro de DPBS à temperatura ambiente suplementado com 10% de penicilina-estreptomicina.Use um espátula plana para desprender as colônias da placa e transfira 0,5 mililitros da suspensão celular para cada um dos dois tubos de microcentrífuga. Lave o poço com um mililitro de DPBS e transfira 0,5 mililitros da lavagem para cada tubo. Centrifugue os tubos por 20 segundos a 8.000 vezes a gravidade, aspire o sobrenadante e reconstitua cada pellet em 500 microlitros de DPBS fresco contendo 100 microlitros de um miligrama por mililitro.Lectina de Fasi vulgaris em DPBS em cada tubo para ajudar a ligar as células entre si para o transplante. Incube a suspensão celular à temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugue as células a 8.000 vezes a gravidade por dois minutos para uniformizar o pellet.Gire os tubos 180 graus dentro das cavidades do rotor. Em seguida, centrifugue novamente a 8.000 vezes a gravidade por dois minutos.Aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando os pellets intactos para desalojá-los do tubo. Pipete suavemente 200 microlitros de meio KSR ao lado da borda do pellet até que este se solte lentamente. Uma vez que o pellet esteja desalojado, aspire imediatamente o meio para uma célula milimétrica de 0,4 micrômetro.Inocule em uma placa contendo três mililitros de meio KSR. Incube por duas horas até a noite toda a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Coloque um camundongo imunodeficiente anestesiado sobre uma plaqueta aquecida para prevenir hipotermia.Use uma tesoura cirúrgica e uma pinça de íris para fazer uma incisão de 2,5 centímetros através da pele paralelamente à coluna vertebral, mas ligeiramente fora do centro. Faça uma incisão menor através do músculo logo abaixo das costelas e a aproximadamente um centímetro da coluna vertebral.O corte deve ser grande o suficiente para puxar o rim através dele, mas pequeno o suficiente para que o rim não escorregue de volta para a cavidade abdominal sem aplicação de força. Usando uma pipeta de pasta que foi moldada na forma de um gancho rombo, puxe suavemente o rim através do corte muscular. Umedeça periodicamente o rim com DPBS estéril para evitar que a cápsula frágil seque com pinças finas.Puxe suavemente a cápsula para longe do rim. Use uma tesoura de mola de Veneza para fazer uma incisão de dois milímetros na cápsula. No centro do rim, insira uma pipeta de pasta que foi puxada até formar uma sonda fina e romba entre a cápsula e o rim, movimentando suavemente para criar um pequeno bolso; repita do outro lado do rim para que haja dois bolsos.Um em cada polo do rim. Usando uma ponteira de pipeta de grande diâmetro em um transferidor descartável, pipete e levante um único pellet do inserto milicelular.Utilize o mínimo de meio possível, pois o excesso pode interferir na transferência do pellet. Use pin&ccedil;as para segurar a borda do bolsinho no rim. Coloque suavemente o pellet pr&oacute;ximo &agrave; abertura e use a ponteira de pipeta puxada para empurr&aacute;-lo para dentro do bolsinho, em dire&ccedil;&atilde;o a um dos polos do rim.Coloque um segundo pellet no bolsão em direção ao polo oposto. Posicione cuidadosamente a cápsula de volta sobre os pellets. Não são necessários pontos para fechar a cápsula.Use uma pipeta em gancho para empurrar suavemente o rim de volta para a cavidade abdominal. A incisão muscular deve ser pequena o suficiente para poder ser selada com um único ponto de seda. Feche a pele com uma série de quatro a cinco pontos separados e permita que o animal se recupere da cirurgia antes de devolvê-lo ao biotério oito a doze semanas após a cirurgia.Remova o teratoma renal e todos os cistos circundantes da cavidade abdominal como um bloco de tecido. Coloque todo o bloco de tecido excisado em um tubo de polipropileno de 50 mililitros contendo fórmula tamponada a 10%. Deixe o teratoma fixar a quatro graus Celsius durante a noite.Remova o teratoma do tubo e coloque-o sobre uma superfície. Use um bisturi para dissecar quaisquer cistos e a maior quantidade possível de tecido renal, sem danificar o próprio teratoma. Teratomas maiores podem ser cortados ao meio para facilitar a dissecação e a inclusão.Processe o teratoma utilizando a técnica padrão de fixação em parafina e cora cortes montados em lâminas para análise e imagem. Consulte as notas na seção de texto do protocolo para obter detalhes. Aqui mostraremos cortes de tecido de um teratoma típico.Este teratoma foi corado com hematoxilina e eosina para identificar tecidos embrionários, representativos dos três folhetos germinativos, e mostra uma estrutura inicial de tubo neural representativa do ectoderma. Esta seção fornece outro exemplo de ectoderma, neste caso um epitélio escamoso primitivo. Aqui, cartilagem cercada por uma cápsula de mesênquima condensado representa tecidos derivados do mesoderma embrionário.Por fim, esta seção que mostra uma estrutura intestinal glandular demonstra o tecido dérmico final dentro do teratoma para mapear o destino de células-tronco marcadas geneticamente; os teratomas foram semeados com uma mistura de células-tronco embrionárias humanas do tipo selvagem e positivas para CD133. As células derivadas positivas para CD133, indicadas por setas, foram observadas em tecidos originados da ectoderme embrionária, especificamente no neuroepitélio e em estruturas semelhantes ao tubo neural em formação. Sou o Dr. Harold Bernstein.Carissa acaba de mostrar como formar teratomas a partir de culturas de células-tronco embrionárias humanas para fornecer um ensaio de desenvolvimento in vivo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado com suas células e observar sua técnica asséptica. Assim sendo, é isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zebrafish transplante de células permite a combinação de genética e da embriologia para gerar quimeras tecidos específicos. Este vídeo demonstra gástrula encenado transplantes de células que têm permitido o nosso laboratório para investigar o papel das populações astroglial e pistas de orientação específica durante a formação da comissura no prosencéfalo.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Genética induzível Destino Mapping (GIFM) marcas e faixas de células com o controle espacial e temporal...

Uma Abordagem Prática para mapeamento genético induzível Fate: Um Guia Visual para Mark e Track Células In Vivo</em

As células pluripotentes humanas estaminais (hPSCs) têm o potencial para tratar uma miríade de diferentes doenças. A utilidade destas células reside no facto de que eles podem diferenciar-se em qualquer tipo de célula no corpo. Descrevemos aqui o ensaio teratoma, que é usado para demonstrar a pluripotência das hPSCs.

Geração Teratoma na Cápsula do Testículo

O destino de uma célula individual embrionário pode ser influenciado por moléculas hereditárias e / ou por sinais de células vizinhas. Utilizando mapas destino da clivagem embrionária fase Xenopus, blastômeros individuais podem ser identificados para a cultura de isolamento para avaliar as contribuições de moléculas herdados contra interações célula-célula.

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem a capacidade intrínseca de se diferenciar e se auto-organizam em padrões de tecidos distintos; embora isso exige a apresentação de gradientes ambientais espaciais. Apresentamos stencil micropatterning como um método simples e robusto para gerar gradientes bioquímicas e mecânicas para controlar os padrões de diferenciação HPSC.

Stencil micropatterning de células-tronco pluripotentes humana para sondar organização espacial de diferenciação Fates

Neste estudo, geramos células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células de líquido amniótico de camundongo, usando um sistema de transposon baseado em não vírus.

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.

Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

Os ligantes da matriz extracellular podem ser modelados em hidrogéis do poliacrilamida para permitir a cultura de pilhas de haste embrionário humanas em colônias confinadas em carcaças complacentes. Este método pode ser combinado com a microscopia da força da tração e os ensaios bioquímicos para examinar o interação entre a geometria do tecido, as forças pilha-geradas, e a especificação do Fate.

Padronização da geometria de colônias de células-tronco embrionárias humanas em substratos compatíveis para controlar a mecânica de nível de tecido

Neste estudo, apresentamos um ensaio celular in vitro para identificação de produtos químicos teratogênicos. A dinâmica da sinalização do fator de crescimento de fibroblastos (FGF)/fator de resposta sérica (SRF) foi medida em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS), e o risco de teratogenicidade foi avaliado quantificando a interrupção química dessa via de sinalização.<br...

Ensaio de toxicidade no desenvolvimento baseado no monitoramento em tempo real da interrupção do sinal do fator de crescimento de fibroblastos em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Aprenda a diferenciar células estaminais embrionárias humanas in vivo através de enxerto na cápsula renal de camundongos imunocomprometidos. Este método permite rastrear o destino tecidual das células marcadas geneticamente por 8 a 12 semanas.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

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