Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células-tronco embrionárias humanas in vivo e determinar seus destinos específicos de tecido. Isso é feito primeiro criando um pellet a partir de células geneticamente marcadas de interesse. A segunda etapa do procedimento é colocar cirurgicamente o pellet sob a cápsula renal de um camundongo imunocomprometido.

A terceira etapa do procedimento é permitir que o pellet celular se diferencie por oito a 12 semanas sob a cápsula do rim do camundongo. A etapa final do procedimento é colher o teratoma resultante, fixá-lo em formalina e analisar o destino das células marcadas por imuno-histoquímica. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as células marcadas se desenvolvendo em uma ou mais das três camadas germinativas por meio de histologia e imuno-histoquímica dos teratomas resultantes.

Olá, sou Carissa Ritner, do laboratório do Dr. Harold Bernstein no Instituto de Pesquisa Cardiovascular da Universidade da Califórnia em San Francisco. Hoje mostraremos um procedimento para desenvolver teratomas por meio de enxerto de cápsula renal. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a diferenciação de células-tronco embrionárias, tanto para garantir que cada linha com a qual trabalhamos possa se desenvolver em cada uma das três camadas germinativas e atrair o destino de células-tronco geneticamente marcadas in vivo.

Todos os procedimentos que mostraremos são feitos com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF. Além disso, todo o trabalho com células-tronco embrionárias humanas é realizado com a aprovação do Comitê de Supervisão de Pesquisa com Células-Tronco da UCSF. Então vamos começar.

Para preparar culturas de células-tronco embrionárias humanas, consulte a parte do texto deste protocolo. Para notas em uma capa de fluxo de lâmina, trate as culturas de células-tronco embrionárias humanas tratadas com inibidor de rocha com um miligrama por mililitro de colagenase quatro incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono aspirar a colagenase quatro do, bem. Substitua-o por um mililitro de DPBS à temperatura ambiente suplementado com 10% de penicilina estreptomicina.

Use um elevador de células de cabeça chata para raspar as colônias da placa e transfira 0,5 mililitros da suspensão celular para cada um dos dois tubos de microcentrífuga. Enxágue o poço com um mililitro de DPBS e transfira 0,5 mililitros do enxágue para cada pulso do tubo. Gire os tubos por 20 segundos a 8.000 vezes a gravidade, aspire o supinato e ressuspenda cada pellet em 500 microlitros de DPBS fresco a 100 microlitros de um miligrama por mililitro.

Lectina Fasi vulgaris em DPBS para cada tubo para ajudar a unir as células para transplante. Incubar a suspensão celular à temperatura ambiente durante cinco minutos. Gire as células a 8.000 vezes a gravidade por dois minutos para uniformizar o pellet.

Gire os tubos 180 graus dentro de seus poços de rotor. Em seguida, gire novamente em 8.000 vezes. Gravidade por dois minutos.

Aspire cuidadosamente a nasina do SUP, deixando os pellets intactos para desalojar os pellets do tubo. Pipete suavemente 200 microlitros de meio KSR próximo à borda do pellet até que ele se levante lentamente. Assim que o pellet for desalojado, puxe imediatamente o meio para uma célula de 0,4 micrômetro.

Insira em um poço conter três mililitros de KSR. Média. Incube por duas horas durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Coloque um camundongo imunodeficiente anestesiado em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia.

Use uma tesoura cirúrgica e uma pinça de íris para fazer uma incisão de 2,5 centímetros através da pele paralela à coluna. Mas apenas fora do centro. Faça uma incisão menor através do músculo logo abaixo das costelas e a aproximadamente um centímetro da coluna.

A incisão deve ser grande o suficiente para puxar o rim, mas pequena o suficiente para que o rim não escorregue de volta para a cavidade abdominal sem força. Usando uma pipeta de macarrão que foi puxada na forma de um gancho rombudo, puxe suavemente o rim através da incisão muscular. Umedeça periodicamente o rim com DPBS estéril para evitar que a cápsula frágil seque com uma pinça fina.

Puxe suavemente a cápsula para longe do rim. Use a tesoura de mola de Veneza para fazer uma incisão de dois milímetros na cápsula. No centro do rim, insira uma pipeta de macarrão que foi puxada para uma sonda embotada muito fina entre a cápsula no rim e mexa suavemente para fazer uma pequena bolsa se repetir do outro lado do rim para que haja duas bolsas.

Um em cada pólo do rim. Usando uma ponta de pipeta de grande diâmetro em uma transferência descartável. Pipeta levante um único pellet da inserção de células milimétricas.

Tome o mínimo de meio possível, pois o excesso de meio pode interferir na transferência de pellets. Use uma pinça para segurar a borda da bolsa no rim. Coloque suavemente o pellet próximo à abertura e use a sonda de pipeta puxada para empurrá-lo para dentro da bolsa em direção a um pólo do rim.

Coloque um segundo pellet no bolso em direção ao pólo oposto. Coloque cuidadosamente a cápsula de volta nos pellets. Não são necessárias suturas para fechar a cápsula.

Use uma pipeta em forma de gancho para empurrar suavemente o rim de volta para a cavidade abdominal. A incisão muscular deve ser pequena o suficiente para que possa ser selada com uma única sutura de seda. Feche a pele com uma série de quatro a cinco pontos interrompidos e permita que o animal se recupere da cirurgia antes de devolvê-lo ao biotério oito a 12 semanas após a cirurgia.

Remova o teratoma renal e quaisquer cistos circundantes da cavidade abdominal como um bloco de tecido. Coloque todo o bloco de tecido de excise em um tubo de polipropileno de 50 mililitros contendo 10% de fórmula tamponada. Deixe o teratoma se fixar em quatro graus Celsius durante a noite.

Remova o teratoma do tubo e coloque-o em um tapete. Use um bisturi para dissecar quaisquer cistos e o máximo de rim possível sem danificar o próprio teratoma. Teratomas maiores podem ser cortados ao meio para facilitar a dissecção e a incorporação.

Processe o teratoma usando a técnica padrão de fixação em parafina e seções de montagem de manchas em lâminas para análise e imagem. Consulte as notas na parte de texto do protocolo para obter detalhes. Aqui mostraremos seções de tecido de um teratoma típico.

Este teratoma foi corado com hemat e eoin para identificar tecidos embrionários, representativos de todas as três camadas germinativas e mostra uma estrutura nascente do tubo neural representativa da derme vetorial. Esta seção fornece outro exemplo de derme vetorial, neste caso epitélio escamoso primitivo. Aqui, a cartilagem cercada por uma cápsula de mesênquima condensado representa tecidos derivados do mesoderma embrionário.

Finalmente, esta seção mostrando uma estrutura intestinal glandular demonstra o tecido dérmico final dentro do teratoma para mapear o destino de células-tronco geneticamente marcadas, os teratomas foram semeados com uma mistura de células-tronco embrionárias humanas do tipo selvagem e CD 1 33 positivas. As células derivadas positivas CD 1 33 indicadas por setas foram observadas em tecidos decorrentes do heder embrionário, especificamente neuro epitélio e estruturas nascentes semelhantes a tubos neurais. Eu sou o Dr. Harold Bernstein.

Carissa acaba de mostrar como formar teratomas a partir de culturas de células-tronco embrionárias humanas para fornecer um ensaio de desenvolvimento in vivo. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de ter cuidado com suas células e observar sua técnica asséptica. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.