Ensaio de transplante subcutâneo: um método para transplantar células de melanoma de um doador para um modelo receptor de peixe-zebra

- Durante o ensaio de transplante de melanoma, as células cancerígenas do peixe-zebra portador de tumor são transplantadas para um modelo de receptor imunocomprometido para estudar o desenvolvimento do tumor. Comece pegando um peixe-zebra doador portador de tumor sacrificado e ressece cirurgicamente o tumor de seu corpo. Transfira o tumor para uma placa de Petri contendo um tampão adequado e pique-o em pedaços pequenos.

Em seguida, triture os fragmentos tumorais usando uma pipeta. Isso dissocia os pedaços do tumor em células individuais. Agora, carregue a suspensão de células tumorais em uma seringa. Posteriormente, prepare um receptor imunocomprometido Casper zebrafish em um papel de filtro. Esta variante mutante e deficiente em pigmentação do peixe-zebra não possui melanócitos e iridóforos, tornando-a transparente e versátil para experimentos de imagem e transplante.

Em seguida, injete a suspensão de células de melanoma pré-carregadas por via subcutânea na região acima da cavidade peritoneal, a meio caminho entre o rombencéfalo e a barbatana dorsal do peixe-zebra Casper. Agora, transfira o peixe receptor para a água e monitore-o para observar o desenvolvimento do tumor. O corpo transparente do peixe-zebra ajuda na fácil visualização dos tumores desenvolvidos.

No protocolo a seguir, mostraremos o transplante de células de melanoma de um doador de peixe-zebra portador de tumor transgênico para um modelo de peixe Casper receptor imunocomprometido.

- Depois de irradiar o receptor de 2 a 3 meses de idade com 25 Gy de irradiação gama um dia antes do transplante, permita que o peixe se recupere na água dos peixes. Use tricaína para sacrificar um peixe portador de tumor. Corte o tumor e coloque-o em uma placa de Petri com aproximadamente 5 mililitros de filtro esterilizado 0,9x PBS com 5% FPS. Com uma navalha, corte o tumor em cubos enquanto estiver em solução.

Trabalhando em temperatura ambiente e com uma pipeta P1000, triturar para produzir células únicas. Aumente o volume para 25 mililitros. Filtrar a solução através de um filtro de malha de 40 micrómetros e centrifugar numa centrifugadora de mesa a 453 rcf durante 10 minutos. Ressuspenda o pellet em 0,9% PBS 5% FBS até a concentração desejada.

Usando um hemocitômetro, calcule o número exato de células e dilua a suspensão celular de modo que o volume final da injeção seja de aproximadamente 5 microlitros. Por exemplo, se 50.000 células forem injetadas, a suspensão celular deve ser diluída até uma concentração final de 10.000 células por microlitro. Agite o tubo que contém a suspensão celular a cada poucos minutos para evitar a aglomeração das células.

Com etanol 100% e PBS 0,9x, lave uma seringa Hamilton de calibre 26s (ponta chanfrada) 701 N 10 microlitros 2 a 3 vezes antes de carregar a seringa com 5 microlitros da suspensão celular. Depois de anestesiar o peixe receptor irradiado em tricaína, coloque-o de lado em um Kimwipe úmido

Estabilize o peixe com uma mão e insira a agulha com o chanfro voltado para cima em um ângulo de 45 graus no flanco do peixe acima da cavidade peritoneal, a meio caminho entre o limite posterior do rombencéfalo e a borda interna da barbatana dorsal. Pressione suavemente o êmbolo. Permita que os peixes se recuperem em água doce e observe os peixes diariamente quanto ao enxerto de tumor. Se o enxerto ocorreu, o crescimento contínuo e o desenvolvimento da doença também podem ser observados.