Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório
26 de julho de 2010
Protocolos SELEX compreendem várias rodadas de seleção, cada um dos que exigem a regeneração de ligantes vinculado, que por sua vez requerem seqüências de primers que flanqueiam as regiões fixo biblioteca aleatória. Essas seqüências de primers fixo pode interferir com o processo de seleção (falsos positivos e negativos). Aqui apresentamos um primer sem protocolo.
O objetivo geral deste procedimento é identificar abers a partir de uma biblioteca aleatória, que se ligam especificamente a uma proteína alvo, neste caso, a proteína S 100 B. Isso é realizado primeiramente digerindo a biblioteca com endonuclease de restrição para liberar sequências aleatórias das sequências fixas de iniciadores adjacentes. O segundo passo do procedimento consiste em ligar as sequências da biblioteca aleatória à proteína S 100 B purificada e recuperá-las.
O terceiro passo do procedimento é reunir as sequências ligadas com as sequências fixas do iniciador por hibridização e ligação. O passo final do procedimento é transcrever os produtos ligados para permitir a reamplificação por R-T-P-C-R do grupo de abers candidatos ligados, seguida por rodadas adicionais desse procedimento de seleção. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a ligação específica dos abers selecionados à proteína S 100 B.
Por exemplo, aqui, ensaios de ligação em sanduíche são realizados utilizando microarranjos e segundos anticorpos marcados com fluorescência; ensaios também são realizados utilizando nanofios funcionalizados e segundos anticorpos conjugados a nanopartículas de ouro de 15 nanômetros. Hoje demonstraremos um procedimento para selecionar sequências ótimas que se ligam à proteína S hundred B a partir de uma biblioteca aleatória de sequências D. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para diversas finalidades, incluindo o desenvolvimento de uma plataforma sensorial para a detecção precoce de câncer.
Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, gere uma biblioteca de DNA livre de primer ou PF conforme descrito anteriormente. A clivagem da biblioteca de DNA de dupla fita seguida pela purificação em gel com um gel desnaturante de poliacrilamida a 10% resultará em um fragmento de 32 nucleotídeos com fosfato no extremo cinco primo em 30 cc e um fragmento de 30 nucleotídeos com fosfato no extremo cinco primo em 30, denominados respectivamente fragmentos 32 mais e 30 mais.
O fragmento 32 mais contém o domínio aleatório de 30 nucleotídeos com a sequência flanqueadora mínima CC na extremidade três prima, enquanto o fragmento 30 mais consiste apenas na sequência do domínio aleatório de 30 nucleotídeos. Para preparar os fragmentos de DNA da biblioteca PF para a seleção aptr, ressuspenda cada um dos fragmentos 32 mais e 30 mais em 40 microlitros de tris 20 milimolar, HCl pH 7,4. Em seguida, aqueça as amostras por três minutos a 85 graus Celsius após a incubação.
Resfrie as amostras por três minutos em um banho-maria incubador a 37 graus Celsius, depois adicione 760 microlitros de tampão de seleção e incube por três minutos a 37 graus Celsius. Após três minutos, mantenha a amostra à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, passe a solução através de uma coluna contendo microesferas de níquel NTA pré-lavadas com tampão de seleção.
Para remover o DNA inespecífico, colete os fragmentos de DNA da biblioteca PF que não se ligam à coluna e reserve-os para uso posterior. Para preparar as microesferas ligadas à S 100 B, primeiro centrifugue 400 microlitros de microesferas de NDA com níquel por três segundos em uma microcentrífuga e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as microesferas com 400 microlitros de tampão de ligação pipetando suavemente cinco vezes.
Em seguida, centrifugue para sedimentar as esferas e descarte o sobrenadante. Repita este procedimento. Lave duas vezes.
A seguir, adicione cuidadosamente a proteína previamente purificada com marcação de histidina sobre as esferas. Aqui, utiliza-se a proteína B de ligação ao cálcio S100 humana, pipetando suavemente a solução para cima e para baixo cinco vezes a cada três minutos, durante um total de 15 minutos.
Após 15 minutos, centrifugue as microesferas e descarte o sobrenadante. Por fim, lave as microesferas com S 100 B ligado com 400 microlitros de tampão de seleção, pipetando suavemente para cima e para baixo três vezes. Novamente, centrifugue as microesferas e descarte o sobrenadante.
Repita este passo duas vezes, perfazendo um total de três lavagens finais para selecionar os anticorpos ligados à S 100 B. Recupere os fragmentos 32 plus e 30 plus que foram previamente separados. Adicione os fragmentos às esferas ligadas à S 100 B. Em seguida, incube a amostra por 15 minutos.
Após 15 minutos, misture a cada três minutos pipetando suavemente para cima e para baixo; em seguida, centrifugue brevemente as esferas, despreze o sobrenadante e lave o complexo S 100 BDNA com 800 microlitros de tampão de seleção pipetando suavemente. Em seguida, centrifugue as esferas e despreze o sobrenadante. Repita este passo de lavagem duas vezes.
Para recuperar o S 100, adicione 200 microlitros de tris 20 milimolar, HCl pH 7,4 aos grânulos. Em seguida, aqueça a suspensão por três minutos a 85 graus Celsius. Após a incubação.
Vortexe as esferas por um minuto e centrifugue. Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo novo. Repita este passo uma vez e combine os sobrenadantes.
Por fim, purifique os fragmentos de DNA selecionados. Extraia os produtos de PCR duas vezes com um volume equivalente de cloreto de fenila e álcool isopropílico. Precipite-os com cloreto de sódio 250 milimolar e 2,5 vezes o volume de etanol 100% a menos 70 graus Celsius por 15 minutos.
Centrifugue a 21.000 ×g a quatro graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante. Lave eficientemente o pellet com etanol 75%.
Centrifugue a 21.000 ×g a quatro graus Celsius durante cinco minutos e descarte o sobrenadante. Seque o pellet em um evaporador a vácuo durante três minutos após 10 rodadas de seleção. Clone os fragmentos de DNA amplificados por PCR resultantes no vetor PCR 2.1 topo obtido de um kit da Invitrogen.
Em seguida, sequencie entre 40 e 50 colônias individuais para cada um dos fragmentos N 30 cc e N 30 selecionados com o iniciador M 13 forward. Alinhe as sequências selecionadas utilizando o software infomax vector NTI. Em seguida, determine as sequências consenso com base nos alinhamentos.
Uma vez que as sequências consenso tenham sido identificadas, adquira os aptâmeros consenso conforme descrito no protocolo escrito. Suspenda o primeiro aptâmero sintetizado com um grupo Amin C seis na extremidade 5' em tampão de impressão até uma concentração final de 15 micromolar. Em seguida, aplique a solução de aptâmero em lâminas ativadas com CodeLink usando um microarranjo MicroGrid da Apogen Discoveries.
Siga os protocolos recomendados no link do código. Imprima cada lâmina com 12 matrizes. Utilize um formato dois por oito.
Cassete de hibridização para microarranjo. Dilua a proteína S100B até a concentração apropriada em 70 microlitros de PBS. Em seguida, aplique a solução aos poços do cassete de microarranjo.
Selar a cassete de microarranjo usando folha adesiva livre de nucleases para prevenir evaporação. Deixe a proteína ligar-se aos abers impressos no código de ligação. Incubar individualmente por uma hora à temperatura ambiente.
Lave as cavidades da cassete três vezes com PBS contendo cloreto de magnésio cinco milimolar ou PBSM. Em seguida, dilua os segundos anticorpos marcados com fluoróforo até 0,125 micromolar em 70 microlitros de PBSM. Aqueça a mistura por três minutos a 85 graus Celsius.
Em seguida, deixe os ABERS marcados esfriarem no gelo. Aplique os ABERS aos poços da cassete de microarranjo durante três minutos. Novamente, feche a cassete com a folha adesiva e incube por uma hora à temperatura ambiente.
Novamente, individualmente. Lave as cavidades três vezes com PBSM após a lavagem. Desmonte o cassete e enxágue toda a lâmina com PBSM.
Em seguida, seque completamente a lâmina por centrifugação. Por fim, escaneie a lâmina utilizando um scanner Packard Biosciences ScanArray 4000 XL. A ligação foi determinada para aptâmeros marcados na extremidade 5' com gama P 32 A TP, direcionados à proteína S 100 B, e representada graficamente em função da concentração para a determinação de KD.
Kds representativos após aproximadamente sete rodadas de seleção são tipicamente na faixa de 10 elevado a menos sete molar. Aptâmeros DERT com alvo na extremidade 5' foram acoplados a microarranjos CodeLink; a proteína S 100 B purificada foi ligada ao primeiro optímero e um segundo optímero marcado com LOR 5 46 foi ligado aos complexos do primeiro optímero com S 100 B.
A fluorescência foi quantificada utilizando um leitor de matriz de varredura. A linha do meio mostra ligação tipo sanduíche com caracterização por ligação aditiva em ensaios de KD nas linhas acima e abaixo. Não há ligação tipo sanduíche para abers com derivatização de tiol na extremidade cinco prima; os primeiros abers foram acoplados a nanofios de ouro utilizando química de tiol padrão.
Os segundos aptâmeros foram acoplados a 50 NMO ou nanopartículas de ouro da mesma maneira. A proteína S100B purificada foi então ligada primeiramente aos nanofios derivatizados; em seguida, os aptâmeros secundários de 50 nanomolares de nanopartículas de ouro foram ligados aos complexos de nanofio-aptâmero-S100B. Os complexos sanduíche formados foram visualizados usando MEV de emissão de campo (F FE SEM). Aqui.
Um controle negativo pode ser observado para um ensaio de ligação realizado com a proteína HTRA1 no lugar da proteína S100B. Bem, uma das coisas mais importantes sobre o procedimento é que estamos utilizando uma abordagem livre de iniciadores, na qual não temos sequências fixas que possam causar resultados falsos positivos e falsos negativos com base nas próprias sequências, que podem dominar a região aleatória. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que o molde de DNA seja destruído antes de cada reação de transcrição reversa e ter cuidado para isolar o produto específico de RT-PCR após cada reamplificação.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo livre de iniciadores para seleção de aptâmeros que se ligam especificamente à proteína S100B a partir de uma biblioteca aleatória de DNA. O método tem como objetivo melhorar a eficiência dos protocolos SELEX ao eliminar interferências provenientes de sequências fixas de iniciadores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- bioquímica
- engenharia de proteínas
- biotecnologia
Contexto
- Os protocolos SELEX normalmente exigem sequências de iniciadores fixas que podem levar a resultados falsos positivos e negativos.
- A identificação de ligantes específicos a partir de bibliotecas aleatórias é crucial para diversas aplicações, incluindo o desenvolvimento de sensores.
- A proteína S100B é um alvo de interesse devido à sua relevância na detecção de câncer.
- Métodos tradicionais podem dificultar o processo de seleção devido à presença de sequências fixas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método livre de iniciadores para seleção de aptâmeros que se ligam à proteína S100B.
- Agilizar o processo de SELEX e aumentar a especificidade.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Digestão de uma biblioteca de DNA aleatória para remover sequências fixas de iniciadores.
- Associação da biblioteca à proteína S100B purificada.
- Hibridização e ligação para reunir as sequências ligadas com as sequências fixas.
- Transcrição e amplificação de aptâmeros selecionados por meio de R-T-P-C-R.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de aptâmeros que se ligam especificamente à proteína S100B.
- Demonstração da ligação por meio de ensaios sanduíche utilizando microarranjos.
- Validação dos aptâmeros selecionados utilizando nanofios funcionalizados e nanopartículas de ouro.
- Aplicações potenciais na detecção precoce de câncer destacadas.
Conclusões
- O protocolo livre de iniciadores melhora o processo de SELEX ao reduzir interferências.
- Os aptâmeros selecionados mostram potencial para uso em aplicações de biossensoriamento.
- Este método pode ser adaptado para diversos alvos além da proteína S100B.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A seleção de aptâmeros livre de iniciadores aborda um gargalo crítico na fase inicial de descoberta, eliminando interferências por sequências fixas e permitindo a identificação mais precisa de ligantes de alta afinidade. Essa inovação aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e apoia o desenvolvimento robusto de ensaios para alvos proteicos, como a S100B. A abordagem é estrategicamente relevante para portfólios de biofarmacêuticas que buscam ferramentas confiáveis de reconhecimento molecular para diagnósticos e pesquisas translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite interrogar interações moleculares sem viés, eliminando artefatos induzidos por iniciadores.
- Melhora a validação funcional de alvos ao isolar aptâmeros com especificidade real para a proteína de interesse.
- Oferece confiança preditiva em ensaios biológicos subsequentes e na triagem de portfólios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Facilita a preparação de bibliotecas de aptâmeros validadas para plataformas de triagem de alto rendimento.
- Aprimora a reprodutibilidade do ensaio ao minimizar a variabilidade relacionada à sequência.
- Fornece dados quantitativos de ligação (por exemplo, valores de Kd) para avaliação confiável de compostos ou biomarcadores.
- Permite formatos de ensaio escaláveis e reutilizáveis, incluindo microarranjos e sensores baseados em nanofios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a seleção de aptâmeros com alvos proteicos relevantes para doenças, como a S100B, apoiando estratégias translacionais de biomarcadores.
- Garante continuidade do descobrimento à validação pré-clínica mediante a geração de sondas moleculares robustas.
- Reduz a ambiguidade mecanicista em modelos pré-clínicos ao assegurar a especificidade do aptâmero.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de seleção livre de iniciadores integra-se na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de ensaios, apoiando fluxos de trabalho desde a validação de alvos até a pesquisa pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao isolar aptâmeros com viés mínimo de sequência.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis de ligação, adequados para ensaios de alto rendimento e multiplexados.
- Análises: Oferece medições robustas de Kd e identificação de sequência consenso para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Permite o alinhamento com biomarcadores de doenças e apoia a continuidade na validação pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para seleção de aptâmeros contra diversos alvos proteicos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a seleção de aptâmeros, melhorando a reprodutibilidade e a escalabilidade entre projetos.
- Valor Estratégico: Apoia decisões informadas de avançar/não avançar e o desenvolvimento eficiente em termos de capital de diagnósticos moleculares.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas de descoberta e translacionais.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em química de ácidos nucleicos e bioquímica de proteínas.
- Requer acesso a instrumentação para purificação, amplificação de DNA e ensaios com microarranjos ou nanofios.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de seleção e validação.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes alvos proteicos ou matrizes de amostras.
- É essencial um controle rigoroso da destruição do molde e do isolamento do produto para evitar falsos positivos.
