Name: Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a selecionar aptâmeros sem primer para a proteína S100B usando uma biblioteca de DNA aleatório. Este método elimina interferências de sequências fixas e melhora a especificidade do protocolo SELEX para aplicações em biossensores.

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Agradecemos a Paul Craig no Centro de Núcleo Microarray por sua ajuda. Este trabalho foi financiado pelo NIH CA118591 # / NCI bolsa do Programa IMAT. SLD também reconhece um Pennsylvania Espaço Grant Fellowship Consórcio de apoio financeiro. Esta publicação foi também apoiada pela Pennsylvania State University Materials Research Institute Nano Fabricação de rede e da National Science Foundation Acordo de Cooperação n º 0335765, Rede Nacional de Infra-estrutura de Nanotecnologia, com Cornell University.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotMaster TAQ DNA Polimerase</td><td>5 PRIME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mistura de dNTPs</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão UltraPure 10X TBE</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX174 DNA/Marcador de DNA Hinf I</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-dCTP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol:ChCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de Restrição</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filme Fotográfico</td><td>ECE Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perlas de Agarose Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coluna de Polipropileno</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células Detroit-551</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células SK-MEL-31</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligase de DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissulfóxido de Dimetila</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de RNA Sp6</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I Isenta de RNase</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase Reversa SensiScript</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetor pCR-2.1-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células Competentes DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit Mini de Plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector NTI</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinase de Polinucleotídeo T4</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#947;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primer-free seleção aptamer usando uma biblioteca de dna aleatório

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptâmeros são oligonucleotides altamente estruturado (DNA ou RNA) que pode vincular a metas, com afinidades comparáveis ​​aos anticorpos 1. Eles são identificados através de um processo de seleção in vitro chamada Evolução Sistemática de Ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) para reconhecer uma grande variedade de alvos, a partir de pequenas moléculas para proteínas e outras macromoléculas 2-4. Aptâmeros têm propriedades que são adequados para diagnóstico in vivo e / ou aplicações terapêuticas: Além de boa especificidade e afinidade, eles são facilmente sintetizado, sobreviver a condições de processamento mais rigoroso, eles estão pouco imunogênico, e seu tamanho relativamente pequeno pode resultar na penetração de fácil tecidos. Aptâmeros que são identificados através do processo SELEX padrão geralmente compreendem ~ 80 nucleotídeos (nt), uma vez que normalmente são selecionados a partir de bibliotecas de ácido nucléico com ~ 40 nt longo randomizado regiões mais sites de cartilha fixa de ~ 20 nt em cada lado. As seqüências de primers fixo, assim, pode compreender cerca de ~ 50% das seqüências de biblioteca, e, portanto, pode positiva ou negativamente compromisso identificação de aptâmeros no processo de seleção 3, embora abordagens bioinformática sugerem que as seqüências fixas não contribuem significativamente para aptamer estrutura após cinco seleção . Para resolver esses problemas em potencial, seqüências de primers foram bloqueadas por oligonucleotídeos complementares ou mudado para diferentes seqüências no meio do caminho durante as rodadas de SELEX 6, ou elas foram aparadas para 6-9 nt 7, 8. Wen e Gray 9 desenhado um primer sem método SELEX genômica, em que as seqüências de primers foram completamente removido da biblioteca antes da seleção e, em seguida, foram regenerados para permitir a amplificação dos fragmentos do genoma selecionado. No entanto, a empregar a técnica, uma biblioteca genômica único tem que ser construída, que possui diversidade limitada, e regeneração após rodadas de seleção depende de um passo reamplificação linear. Alternativamente, os esforços para contornar problemas causados ​​por seqüências de primers fixa usando o particionamento de alta eficiência são atendidas com problemas em relação a amplificação 10. Nós desenvolvemos uma cartilha livre método de seleção (PF) que simplifica significativamente os procedimentos SELEX e elimina eficazmente cartilha interferência de problemas 11, 12. Os protocolos de trabalhar de uma forma simples. A região central aleatórios da biblioteca é purificada sem seqüências estranhas de acompanhamento e está vinculado a um destino adequado (por exemplo, para uma proteína purificada ou misturas complexas, tais como linhas de células). Em seguida, as seqüências são obtidos ligado, se reuniu com seqüências de acompanhamento e re-amplificado para gerar selecionado sub-bibliotecas. Como exemplo, aqui nós selecionamos aptâmeros a S100B, uma proteína marcadora de melanoma. Ensaios de ligação mostrou Kd s na 10 -7 - 10 -8 M gama após algumas rodadas de seleção, e demonstramos que a aptâmeros funcionar efetivamente em um formato sanduíche vinculativo.

Protocolos SELEX compreendem várias rodadas de seleção, cada um dos que exigem a regeneração de ligantes vinculado, que por sua vez requerem seqüências de primers que flanqueiam as regiões fixo biblioteca aleatória. Essas seqüências de primers fixo pode interferir com o processo de seleção (falsos positivos e negativos). Aqui apresentamos um primer sem protocolo.

Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório

Aptâmeros são oligonucleotídeos (DNA ou RNA) altamente estruturados que podem se ligar a alvos com afinidades comparáveis às dos anticorpos 1. Eles são identificados ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar abers a partir de uma biblioteca aleatória, que se ligam especificamente a uma proteína alvo, neste caso, a proteína S 100 B. Isso é realizado primeiramente digerindo a biblioteca com endonuclease de restrição para liberar sequências aleatórias das sequências fixas de iniciadores adjacentes. O segundo passo do procedimento consiste em ligar as sequências da biblioteca aleatória à proteína S 100 B purificada e recuperá-las.O terceiro passo do procedimento é reunir as sequências ligadas com as sequências de iniciadores fixas por hibridização e ligação. O passo final do procedimento é transcrever os produtos ligados para permitir a reamplificação por R-T-P-C-R do grupo de abers candidatos ligados, seguida por rodadas adicionais desse procedimento de seleção. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a ligação específica dos abers selecionados à proteína S 100 B.Por exemplo, aqui, ensaios de ligação em sanduíche são realizados utilizando microarranjos e segundos anticorpos marcados com fluorescência; outros ensaios também são realizados utilizando nanofios funcionalizados e segundos anticorpos conjugados a nanopartículas de ouro de 15 nanômetros. Hoje demonstraremos um procedimento para selecionar sequências ótimas, que se ligam à proteína S100B, a partir de uma biblioteca aleatória de sequências D. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para diversas finalidades, incluindo o desenvolvimento de uma plataforma sensorial para a detecção precoce de câncer.Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, gere uma biblioteca de DNA livre de primer ou PF conforme descrito anteriormente. A clivagem da biblioteca de DNA de dupla fita seguida pela purificação em gel com um gel desnaturante de poliacrilamida a 10% resultará em um fragmento de 32 nucleotídeos com fosfato em cinco primas em 30 cc e um fragmento de 30 nucleotídeos com fosfato em cinco primas em 30, denominados respectivamente fragmentos 32 mais e 30 mais.O fragmento 32 mais contém o domínio aleatório de 30 nucleotídeos com a sequência flanqueadora mínima CC na extremidade três prima, enquanto o fragmento 30 mais consiste apenas na sequência do domínio aleatório de 30 nucleotídeos. Para preparar os fragmentos de DNA da biblioteca PF para a seleção de aptr, ressuspenda cada um dos fragmentos 32 mais e 30 mais em 40 microlitros de tris 20 milimolar, HCl pH 7,4. Em seguida, aqueça as amostras por três minutos a 85 graus Celsius após a incubação.Resfrie as amostras por três minutos em um banho-maria incubador a 37 graus Celsius, em seguida, adicione 760 microlitros de tampão de seleção e incube por três minutos a 37 graus Celsius. Após três minutos, mantenha a amostra à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, passe a solução por uma coluna contendo microesferas de níquel-NTA previamente lavadas com tampão de seleção.Para remover o DNA inespecífico, colete os fragmentos de DNA da biblioteca PF que não se ligam à coluna e reserve-os para uso posterior. Para preparar as esferas ligadas ao S 100 B, primeiro centrifugue 400 microlitros de esferas de NDA com níquel por três segundos em uma microcentrífuga e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as esferas com 400 microlitros de tampão de ligação pipetando suavemente cinco vezes.Em seguida, centrifugue para sedimentar as microesferas e descarte o sobrenadante. Repita este procedimento. Lave duas vezes.A seguir, adicione a proteína previamente purificada com marcação de histidina sobre as microesferas. Aqui, utiliza-se a proteína B de ligação ao cálcio S100 humana. Pipete suavemente a solução para cima e para baixo cinco vezes a cada três minutos, durante um total de 15 minutos.Após 15 minutos, centrifugue as microesferas e descarte o sobrenadante. Por fim, lave as microesferas com S 100 B ligado com 400 microlitros de tampão de seleção, pipetando suavemente para cima e para baixo três vezes. Novamente, centrifugue as microesferas e descarte o sobrenadante.Repita este passo duas vezes, perfazendo um total de três lavagens finais para selecionar os anticorpos ligados à S 100 B. Recupere os fragmentos 32 plus e 30 plus que foram previamente separados. Adicione os fragmentos às esferas ligadas à S 100 B. Em seguida, incube a amostra por 15 minutos.Após 15 minutos, misture a cada três minutos pipetando suavemente para cima e para baixo; em seguida, centrifugue brevemente as microesferas, despreze o sobrenadante e lave o complexo S 100 BDNA com 800 microlitros de tampão de seleção pipetando suavemente. Em seguida, centrifugue as microesferas e despreze o sobrenadante. Repita este passo de lavagem duas vezes.Para recuperar o S 100, selecione os abers adicionando 200 microlitros de tris 20 milimolar, HCl pH 7,4 às perlas. Em seguida, aqueça a suspensão por três minutos a 85 graus Celsius. Após a incubação.Vortexe as esferas por um minuto e centrifugue. Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo novo. Repita este passo uma vez e combine os sobrenadantes.Por fim, purifique os fragmentos de DNA selecionados. Extraia os produtos de PCR duas vezes com um volume equivalente de cloreto de fenila, álcool isopropanólico. Precipite-os com cloreto de sódio 250 milimolar e 2,5 vezes o volume de etanol 100% a menos 70 graus Celsius por 15 minutos.Centrifugar a 21.000 ×g a quatro graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, desprezar o sobrenadante. Lavar o pellet com etanol 75% de forma eficiente.Centrifugue a 21.000 ×g a quatro graus Celsius durante cinco minutos e descarte o sobrenadante. Seque o pellet em um evaporador a vácuo durante três minutos após 10 rodadas de seleção. Clone os fragmentos de DNA amplificados por PCR resultantes no vetor PCR 2.1 topo obtido de um kit da Invitrogen.Em seguida, realize o sequenciamento entre 40 e 50 colônias simples para cada um dos fragmentos N 30 cc e N 30 selecionados com o iniciador M 13 forward. Alinhe as sequências selecionadas utilizando o software infomax vector NTI. Em seguida, determine as sequências consenso com base nos alinhamentos.Uma vez identificadas as sequências consenso, adquira os aptâmeros consenso conforme descrito no protocolo escrito. Suspenda o primeiro aptâmero sintetizado com um grupo Amin C seis na extremidade cinco prima em tampão de impressão até uma concentração final de 15 micromolar. Em seguida, aplique a solução de aptâmero em lâminas ativadas com CodeLink usando um microarranjo MicroGrid da Apogen Discoveries.Siga os protocolos recomendados no link do código. Imprima cada lâmina com 12 matrizes. Utilize um formato dois por oito.Cassete de hibridização para microarranjo para hibridização. Dilua a proteína S100B até a concentração apropriada em 70 microlitros de PBS. Em seguida, aplique a solução aos poços do cassete de microarranjo.Selar a cassete de microarranjo usando folha adesiva livre de nucleases para prevenir evaporação. Deixe a proteína ligar-se aos abers impressos no link de código. Incubar individualmente por uma hora em temperatura ambiente.Lave as cavidades da cassete três vezes com PBS contendo cloreto de magnésio cinco milimolar ou PBSM. Em seguida, dilua os segundos anticorpos marcados com fluoróforo até 0,125 micromolar em 70 microlitros de PBSM. Aqueça a mistura por três minutos a 85 graus Celsius.Em seguida, deixe os ABERS marcados esfriarem no gelo. Aplique os ABERS aos poços da cassete de microarranjo por três minutos. Sobreponha novamente a cassete com a folha adesiva e incube por uma hora à temperatura ambiente.Novamente, individualmente. Lave as cavidades três vezes com PBSM após a lavagem. Desmonte o cassete e enxágue toda a lâmina com PBSM.Em seguida, seque completamente a lâmina por centrifugação. Por fim, escaneie a lâmina utilizando um scanner Packard Biosciences ScanArray. 4,000 XL foi determinada a ligação de aptâmeros marcados na extremidade 5' com gama P 32 A TP à proteína S 100 B e plotada em função da concentração para determinação de KD.Kds representativos após aproximadamente sete rodadas de seleção geralmente estão na faixa de 10 elevado a menos sete molar. Aptâmeros DERT direcionados à extremidade 5' foram acoplados a microarranjos CodeLink; a proteína S100B purificada foi ligada ao primeiro optímero e um segundo optímero marcado com LOR 5 46 foi ligado aos complexos do primeiro optímero com S100B.A fluorescência foi quantificada utilizando um leitor de matriz. A linha do meio mostra ligação em sanduíche com caracterização por ligação aditiva em ensaios de KD nas linhas acima e abaixo. Não há ligação em sanduíche para abers com derivatização tiol na extremidade cinco prima; os primeiros abers foram acoplados a nanofios de ouro utilizando química tiol padrão.Os segundos aptâmeros foram conjugados a 50 NMO ou nanopartículas de ouro da mesma maneira. A proteína S100B purificada foi então ligada primeiramente aos nanofios derivatizados; posteriormente, os aptâmeros secundários de 50 nanomolares de nanopartículas de ouro foram ligados aos complexos de nanofios com S100B e o primeiro aptâmero. Os complexos sanduíche formados foram visualizados usando F FE ME. Aqui.Um controle negativo pode ser observado para um ensaio de ligação realizado com a proteína HTRA1 no lugar da proteína S100B. Bem, uma das coisas mais importantes sobre o procedimento é que estamos utilizando uma abordagem livre de iniciadores, na qual não temos sequências fixas que possam causar resultados falsos positivos e falsos negativos com base nas próprias sequências, que podem dominar a região aleatória. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que o molde de DNA seja destruído antes de cada reação de transcrição reversa e ter cuidado para isolar o produto específico de RT-PCR após cada reamplificação.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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