Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório
July 26th, 2010
Protocolos SELEX compreendem várias rodadas de seleção, cada um dos que exigem a regeneração de ligantes vinculado, que por sua vez requerem seqüências de primers que flanqueiam as regiões fixo biblioteca aleatória. Essas seqüências de primers fixo pode interferir com o processo de seleção (falsos positivos e negativos). Aqui apresentamos um primer sem protocolo.
O objetivo geral deste procedimento é identificar abers de uma biblioteca aleatória, que se liga especificamente a uma proteína alvo neste caso, a proteína S 100 B. Isso é feito primeiro digerindo a biblioteca com endonuclease de restrição para liberar sequências aleatórias de sequências de primers fixos flanqueadores. A segunda etapa do procedimento é ligar as sequências aleatórias da biblioteca à proteína S 100 B purificada e recuperá-las.
A terceira etapa do procedimento é reunir sequências ligadas com sequências de primers fixas por hibridização e ligação. A etapa final do procedimento consiste em transcrever os produtos ligados para permitir a reamplificação R-T-P-C-R do grupo de candidatos vinculados, seguida de rodadas adicionais deste processo de seleção. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a ligação específica de abers selecionados à proteína S 100 B.
Por exemplo, aqui, os ensaios de ligação em sanduíche são realizados usando microarrays e os ensaios de segundo abers marcados com fluorescência também são realizados usando nanofios funcionalizados e o segundo abers acoplado a nanopartículas de ouro de 15 nanômetros. Hoje mostraremos um procedimento para selecionar o ótimo, que se liga à proteína S hundred B da biblioteca aleatória de sequências D. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para uma variedade de propósitos, incluindo o desenvolvimento de uma plataforma de sensores para a detecção precoce do câncer.
Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, gere uma biblioteca de DNA PF ou sem primer, conforme descrito anteriormente. A clivagem da biblioteca de DNA de fita dupla seguida de purificação em gel com um gel de poliacrilamida desnaturante a 10% resultará em um fragmento de 32 nucleotídeos de cinco fosfatos primários em 30 cc e um fragmento de 30 nucleotídeos de cinco fosfatos primários em 30, designados fragmentos de 32 mais e 30 mais, respectivamente.
O fragmento de mais de 32 contém o domínio aleatório de 30 nucleotídeos com a sequência de flanqueamento mínima CC na extremidade de três primos, enquanto o fragmento de mais de 30 consiste apenas na sequência de domínio aleatório de 30 nucleotídeos. Para preparar os fragmentos de DNA da biblioteca PF para seleção aptr, resus suspenda cada um dos fragmentos 32 plus e 30 plus em 40 microlitros de 20 mili tris, HCL pH 7,4. Em seguida, aqueça as amostras por três minutos a 85 graus Celsius após a incubação.
Resfrie, as amostras desçam por três minutos em uma incubadora de banho-maria de 37 graus Celsius, em seguida a 760 microlitros de seleção, tampone e incube por três minutos a 37 graus Celsius. Após três minutos, manter a amostra à temperatura ambiente durante 10 minutos. Após a incubação, passar a solução através de uma coluna contendo grânulos de níquel NTA agro pré-lavados com tampão de seleção.
Para remover o DNA inespecífico, colete os fragmentos de DNA da biblioteca PF que não se ligam à coluna e reserve para mais tarde. Para preparar os grânulos encadernados S 100 B, primeiro gire 400 microlitros de grânulos NDA de níquel por três segundos em uma microcentrífuga e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as contas com 400 microlitros de tampão de ligação pipetando suavemente cinco vezes.
Em seguida, gire as contas e descarte o sobrenadante. Repita isso. Lave duas vezes.
Em seguida, a pobre proteína previamente purificada com histidina marcada sobre as contas. Aqui, ligação de cálcio S 100 humano. A proteína B é usada suavemente pipetando a solução para cima e para baixo cinco vezes a cada três minutos por um total de 15 minutos.
Após 15 minutos, gire as contas e descarte o sobrenadante. Por fim, lave o S 100 B encadernado com 400 microlitros de tampão de seleção suavemente, acariciando para cima e para baixo três vezes. Mais uma vez, gire as contas para baixo e descarte o sobrenadante.
Repita esta etapa duas vezes para um total de três lavagens finais para selecionar para abers encadernados S 100 B. Recupere os fragmentos de mais de 32 e mais de 30 que foram deixados de lado anteriormente. Adicione os fragmentos ao cordão encadernado S 100 B.Em seguida, incube a amostra por 15 minutos.
Misturando a cada três minutos pipetando suavemente para cima e para baixo após 15 minutos, gire brevemente as contas, descarte o sobrenadante e, em seguida, lave o complexo S 100 BDNA com 800 microlitros de tampão de seleção pipetando suavemente. Em seguida, gire as contas para baixo e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem duas vezes.
Para recuperar o S 100, ser selecionado abers a 200 microlitros de 20 milimolares tris, HCL pH 7,4 para os grânulos. Em seguida, aqueça a pasta por três minutos a 85 graus Celsius. Após a incubação.
Vortex as contas por um minuto e gire-as para baixo. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Repita esta etapa uma vez e combine os sobrenadantes.
Finalmente, purifique os fragmentos de DNA selecionados. Extrair os produtos da PCR duas vezes com um volume equivalente de clorofórmio fenilo e álcool isopropílico. Precipite-os com cloreto de sódio 250 milimolares e 2,5 vezes o volume de etanol a 100% a menos 70 graus Celsius por 15 minutos.
Gire para baixo a 21.000 GS a quatro graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante. Enxágue o pellet com 75% de etanol de forma eficiente.
Gire a 21.000 GS a quatro graus Celsius por cinco minutos e descarte o sobrenadante. Seque o pellet em vácuo rápido por três minutos Após 10 rodadas de seleção. Clone os fragmentos de DNA amplificados por PCR resultantes no vetor topo PCR 2.1 obtido de um núcleo vitrogênico.
Em seguida, sequencie entre 40 e 50 colônias simples para cada um dos fragmentos selecionados de N 30 cc e N 30 com o primer direto M 13. Alinhe as sequências selecionadas usando o software infomax vector NTI. Em seguida, determine as sequências de consenso com base nos alinhamentos.
Uma vez que as sequências de consenso tenham sido identificadas, compre o consenso conforme descrito no protocolo escrito. Suspenda o primeiro aptâmero sintetizado com uma porção de cinco primos Amin C seis em tampão de impressão até uma concentração final de 15 micromolares. Em seguida, localize a solução aptâmero em lâminas ativadas por link de código usando uma matriz de microrrede de descobertas de apogen.
Seguindo os protocolos recomendados do link de código. Imprima cada slide com 12 matrizes. Use um formato dois por oito.
de hibridização de microarray para hibridização. Diluir a proteína S 100 B até a concentração apropriada em 70 microlitros de PBS. Em seguida, aplique a solução nos poços do de microarray.
Sele o de microarray usando folha de teto adesiva sem nuclease para evitar a evaporação. Permita que a proteína se ligue aos abers impressos no link do código. Deslize por uma hora em temperatura ambiente após a incubação individualmente.
Lave os poços do três vezes com cloreto de magnésio PBS de cinco milimolares ou PBSM. Em seguida, dilua o segundo aber marcado com fluorescência para 0,125 micromolar em 70 microlitros de PBSM. Aqueça a mistura por três minutos a 85 graus Celsius.
Em seguida, deixe o ABERS rotulado esfriar no gelo. Por três minutos, aplique os abers nos poços do de microarray. Novamente, sele o com a folha adesiva e incube-os por uma hora em temperatura ambiente.
Novamente, individualmente. Lave os poços três vezes com PBSM após a lavagem. Desmonte o e enxágue toda a lâmina com PBSM.
Em seguida, seque completamente a lâmina por centrifugação. Por fim, digitalize a lâmina usando uma matriz de varredura da Packard Biosciences. A ligação de 4.000 XL foi determinada para a gama P 32 A TP cinco aptâmeros marcados com extremidade primária à proteína S 100 B e plotada em relação à concentração para determinação de KD.
Os kds representativos após aproximadamente sete rodadas de seleção estão tipicamente na faixa de 10 a sete molares negativos. Cinco primeiros aptâmeros primários foram acoplados a microarrays de link de código purificados, a proteína S 100 B foi ligada ao primeiro otimizador e LOR 5 46 rotulado em segundo. A optimer foi vinculada aos primeiros complexos optimer S 100 B.
A fluorescência foi quantificada usando um scanner de matriz de varredura. A linha do meio mostra a cernelha de ligação em sanduíche caracterizada por ligação aditiva em ensaios de KD nas linhas acima e abaixo. Não há ligação sanduíche para abers cinco primeiros abers derivatizados de tiol primário foram acoplados a nanofios de ouro usando química de thile padrão.
Os segundos abers foram acoplados a 50 NMO ou nps de ouro da mesma maneira. A proteína S 100 B purificada foi então ligada primeiro aos nanofios derivados, segundo aptâmero, 50 mps de ouro nano molar foram posteriormente ligados aos primeiros complexos de nanofios S 100 B de aptâmero. Complexos sanduíche ligados foram visualizados usando F FE SEM. Aqui.
Um controle negativo pode ser visto para um ensaio de ligação realizado com a proteína HTRA um no lugar da proteína S 100 B. Ok, então uma das coisas mais importantes sobre o procedimento é que estamos usando uma abordagem sem primer, onde não temos sequências fixas que podem causar falsos positivos e falsos negativos com base nas próprias sequências que sobrecarregam a região aleatória. Ao fazer este procedimento, é importante certificar-se de que o molde de DNA seja destruído antes de cada reação de transcrição reversa e ter o cuidado de isolar o produto RTPC específico após cada reamplificação.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo sem primer para selecionar aptâmeros que se ligam especificamente à proteína S100B de uma biblioteca de DNA aleatória. O método visa melhorar a eficiência dos protocolos SELEX ao eliminar a interferência de sequências de primer fixas.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Engenharia de Proteínas
- Biotecnologia
Fundo
- Protocolos SELEX geralmente requerem sequências de primer fixas que podem levar a falsos positivos e negativos.
- Identificar ligantes específicos a partir de bibliotecas aleatórias é crucial para várias aplicações, incluindo o desenvolvimento de sensores.
- A proteína S100B é um alvo de interesse devido à sua relevância na detecção de câncer.
- Métodos tradicionais podem dificultar o processo de seleção devido à presença de sequências fixas.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método sem primer para selecionar aptâmeros que se ligam à proteína S100B.
- Racionalizar o processo SELEX e melhorar a especificidade.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores na área.
Métodos Utilizados
- Digestão de uma biblioteca de DNA aleatória para remover sequências de primer fixas.
- Ligação da biblioteca à proteína S100B purificada.
- Hbridização e ligação para reunir sequências ligadas com sequências fixas.
- Transcrição e amplificação de aptâmeros selecionados através de R-T-P-C-R.
Principais Resultados
- Identificação bem-sucedida de aptâmeros que se ligam especificamente à proteína S100B.
- Demonstração da ligação por meio de ensaios sanduíche usando microarrays.
- Validação de aptâmeros selecionados usando nanofios funcionalizados e nanopartículas de ouro.
- Aplicações potenciais na detecção precoce de câncer destacadas.
Conclusões
- O protocolo sem primer melhora o processo SELEX reduzindo a interferência.
- Os aptâmeros selecionados mostram promessa para uso em aplicações de biossensores.
- Este método pode ser adaptado para vários alvos além da proteína S100B.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Primer-free aptamer selection addresses a critical bottleneck in early discovery by eliminating fixed sequence interference, enabling more accurate identification of high-affinity binders. This innovation enhances predictive confidence in target validation and supports robust assay development for protein targets such as S100B. The approach is strategically relevant for biopharma portfolios seeking reliable molecular recognition tools for diagnostics and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased interrogation of molecular interactions by removing primer-induced artifacts.
- Improves functional target validation by isolating aptamers with true specificity for the protein of interest.
- Supports predictive confidence in downstream biological assays and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated aptamer libraries for high-throughput screening platforms.
- Enhances assay reproducibility by minimizing sequence-related variability.
- Delivers quantitative binding data (e.g., Kd values) for reliable compound or biomarker evaluation.
- Enables scalable and reusable assay formats, including microarrays and nanowire-based sensors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns aptamer selection with disease-relevant protein targets such as S100B, supporting translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating robust molecular probes.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by ensuring aptamer specificity.
Pipeline & Workflow Integration
This primer-free selection method integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating aptamers with minimal sequence bias.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative binding outputs suitable for high-throughput and multiplexed assays.
- Analytics: Provides robust Kd measurements and consensus sequence identification for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment with disease biomarkers and supports continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for aptamer selection against diverse protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes aptamer selection, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of molecular diagnostics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid chemistry and protein biochemistry.
- Needs access to instrumentation for DNA purification, amplification, and microarray or nanowire assays.
- Demands cross-team standardization of selection and validation protocols.
- Adaptation may be needed for different protein targets or sample matrices.
- Careful control of template destruction and product isolation is essential to avoid false positives.
