Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

O perfil de massa oligo ou experimento olímpico mostrado aqui permite obter insights rápidos sobre a estrutura dos polímeros na matriz extracelular ou na parede celular de um organismo. No caso aqui, as paredes celulares são preparadas a partir de mudas de plantas, removendo primeiro os componentes celulares com etanol a 70%. O polímero da parede alvo é digerido em seguida com um laço hidro específico solubilizando componentes específicos da parede na forma de todos os ligamentos.

Uma abordagem alternativa é digerir a parede celular com a enzima em C dois diretamente no tecido. A abundância relativa da liberação de ligamentos é determinada por MALDI para espectrometria de massa e análise estatística. Olá, sou Marcus Polly, do Instituto de Biociências da Energia aqui na Universidade da Califórnia em Berkeley.

Olá, sou Marcus Re.E sou Asha Giller. Também do Instituto de Biociências da Energia. Os organismos são cercados por matrizes extracelulares que, dependendo do organismo, consistem em redes poliméricas complexas.

Uma maneira rápida e sensível de avaliar a matriz extracelular é um método que chamamos de oli mass profiling short oleum, que mostraremos hoje. Este procedimento também pode ser realizado diretamente no tecido vegetal. Então vamos começar.

Comece este procedimento isolando a matriz extracelular ou a parede celular dos tecidos vegetais. Colha cinco mudas de arabidopsis ou a quantidade equivalente de outro material vegetal e transfira-as para um tubo de reação de 1,5 mililitro. Certifique-se de que o material seja colocado na parte inferior do tubo.

Adicione duas bolas de metal de três milímetros ao tubo de reação e congele em nitrogênio líquido. Em seguida, triture a amostra congelada usando um moinho de bolas por 2,5 minutos a 25 hertz. Depois de moer o material, adicione um mililitro de etanol aquoso a 70% à amostra.

Remova as bolas de metal usando um ímã e vórtice completamente. Este tratamento solubiliza a maioria das proteínas e organelas celulares centrifuga a amostra a 14.000 RPM por 10 minutos para pellet o resíduo insolúvel em álcool. Representando o material da parede celular, aspire cuidadosamente o sobrenadante, certificando-se de não perturbar o pellet.

Adicione um mililitro de solução de clorofórmio metanol ao pellet restante no vórtice do tubo completamente. Para ressuspender o pellet e centrifugar o clorofórmio, o metanol extrai compostos hidrofóbicos, como lipídios. Após a centrifugação, remova o snat e seque completamente o pellet Usando uma centrífuga a vácuo, isso completa o isolamento do material da parede celular, que agora pode ser tratado com ligamentos específicos.

O exemplo aqui demonstrado é a solubilização do Xlo glucano, a principal hemicelulose presente nas paredes celulares de plantas dicotiledôneas como a Arabidopsis O Xlo glucano é um polímero constituído por uma estrutura de glucano que é fortemente substituída por outros resíduos de açúcar para a solubilização deste polímero. Um endo glucano fúngico é usado para solubilizar este Resus de hemicelulose suspende o pellet de parede celular isolado seco em 25 microlitros de formiato de amônio 50 milimolar pH 4,5 e adiciona 0,2 unidades de endo gluconato. Vortex a suspensão e gire o líquido para baixo.

Coloque o tubo em uma batedeira e deixe as paredes digerirem por 16 horas a 37 graus Celsius com agitação. a 300 RPM. Quando a digestão da parede celular isolada estiver completa, remova o solvente usando uma centrífuga a vácuo e prossiga para analisar os oligossacarídeos liberados por espectrometria de massa, sais e enzimas são removidos da amostra digerida usando os grânulos de resina de troca catiônica da Biox MSD 5 0 1.

As contas são primeiro condicionadas colocando a quantidade necessária em uma coluna vazia e lavando as contas com grandes quantidades de água. Adicione cinco a 10 grânulos de cátions biox condicionados à amostra digerida e seca. Em seguida, adicione 10 microlitros de água para quantidades menores de material.

Cinco microlitros de água podem ser usados. Mergulhe as esferas na solução girando brevemente o tubo incubar por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente enquanto o digestor está incubando com as contas. Localize dois microlitros de matriz DHB em uma placa-alvo mal D.

Evapore o solvente da matriz sob vácuo, levando aos cristais químicos da matriz, agora detecte dois microlitros da solução de digestão dessalinizada. No topo dos cristais da matriz na placa alvo. O solvente do ponto da matriz da amostra é novamente evaporado sob vácuo.

É importante manter um período de tempo adequado para a mistura do líquido da matriz da amostra antes da cristalização, conforme descrito em detalhes no protocolo escrito que acompanha. Depois que a amostra secar, coloque a placa-alvo em um espectrômetro de maldi para massa. Defina a máquina para o modo positivo com uma tensão de aceleração de 20.000 volts e um atraso de 350 nanômetros.

A faixa de massa selecionada para esses ligamentos de hemicelulose é de 500 a 3000 Daltons. A faixa de massa deve ser modificada de acordo com o tamanho dos ligamentos esperados. Comece a disparar o laser e colete de 100 a 200 espectros por amostra, que são compilados para gerar um espectro médio representativo.

Este é o espectro de celulose Hemi. O método oly demonstrado neste vídeo também pode ser usado diretamente no tecido vegetal, omitindo quaisquer etapas de preparação da parede. Este procedimento de análise in situ é demonstrado em mudas de arabidopsis cultivadas escuras.

A amostra é colocada diretamente em uma placa-alvo e seca ao ar até a muda seca na placa. Adicione 0,5 microlitros da mistura tampão enzimática apropriada nas posições desejadas. Certifique-se de que a gota enzimática toque parcialmente o tecido e a placa-alvo.

Coloque a placa alvo maldi em um recipiente fechado com umidade saturada para evitar o ressecamento das gotas de enzima. Incube a placa por 16 horas a 37 graus Celsius. No final do período de incubação, seque o ponto enzimático sob vácuo e adicione 0,5 microlitros da matriz DHB líquida em cima de cada ponto enzimático seco.

Em seguida, seque a placa alvo MALDI sob vácuo. Para analisar o NC duas amostras. Coloque a placa alvo, incluindo os pontos da matriz enzimática da amostra de tecido em um espectro de massa de registro de espectrômetro múltiplo a de massa, usando as mesmas configurações da amostra de parede celular isolada.

Comece a disparar o laser na matriz. Cristais de amostra ao lado do tecido. Certifique-se de não atingir o próprio tecido, pois, nesse caso, o tempo de vôo das moléculas estará errado.

Colete cerca de 20 a 50 espectros por ponto e compile-os para gerar um espectro médio representativo. Este é um espectro médio representativo dos oligossacarídeos derivados do glucano HemosIL presente nas AOPs. As mudas, as intensidades de íons ou a altura dos íons de todos os íons de interesse são somadas até 100%, resultando na abundância relativa dos vários oligossacarídeos.

O resultado do método NC dois OMP dá resultados semelhantes. Cada gota de digestão enzimática marcada por um círculo colorido pode ser analisada independentemente e os espectros de massa correspondentes podem ser obtidos e analisados. Oola também pode ser realizado em outros polímeros da matriz extracelular se uma enzima hidrolisante apropriada estiver disponível.

Como exemplo, este é um espectro oola da hemocelulose cilina presente na cultura de bioenergia. Ms.Canus para obter os dados apresentados enquanto o material de uma folha de mecampus era digerido com o xin. Para a atribuição de estruturas aos íons, consulte o protocolo anexo.

Acabamos de mostrar o procedimento de perfil de massa oligo mar em métricas exocelulares. Polímeros, Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que os melhores resultados podem ser obtidos quando resultados de matriz homogênea são obtidos para a análise OV MS. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com os experimentos.