Name: Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda o método OLIMP para análise rápida e sensível de glicoestruturas em paredes celulares de plantas usando digestão enzimática e espectrometria de massa MALDI-TOF.

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Este trabalho foi financiado pela concessão do Energy Biosciences Institute OO0G01.

O método é exemplificado OLIMP na hemicelulose principais presentes nas paredes celulares das plantas dicotiledôneas, xiloglucano, usando uma endoglucanase como o glycosylhydrolase. O método é demonstrado com toda mudas Arabidopsis como fonte de tecidos de plantas. Material de matriz extracelular de enzimas e pode ser substituído em função da análise desejada usando o mesmo procedimento. 1. Isolamento da parede celular <ol><li> Colheita cinco 5 dias de idade, todo mudas Arabidopsis ou a quantidade equivalente de seu material desejado e transferi-los em um tubo de reação 1,5 ml. Certifique-se que o material é colocado no fundo do tubo. </li><li> Adicione duas bolas de metal 3 milímetros ao tubo de reação em cima da amostra e encaixe-congelamento em nitrogênio líquido. </li><li> Moer a amostra congelada usando um moinho de bolas (2:30 min, 25Hz). </li><li> Adicione 1 ml de etanol 70% aquoso para a amostra. Retire as bolas de metal usando um ímã. Vortex completamente. </li><li> Centrífuga de amostra a 14.000 rpm por 10 min para sedimentar o resíduo de álcool insolúvel contendo o material da parede celular. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. </li><li> Adicione 1 ml de clorofórmio / metanol (1:1 v / v). Vortex cuidadosamente para ressuspender o sedimento. </li><li> Centrífuga de amostra a 14.000 rpm por 10 minutos e retire com cuidado o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. </li><li> Secar a amostra usando um concentrador. </li></ol> 2. Solubilização de oligossacarídeos <ol><li> Para a solubilização do polissacarídeo particular sob a forma de sua oligossacarídeos ressuspender o sedimento seco em 25μl de um tampão apropriado. Para o formiato de amônio 50 mM endoglucanase, pH4.5, é usado. Adicionar 0.2U da endoglucanase. Suspensão do Vortex e líquido de spin para baixo. </li><li> Incubar a amostra para 16h a 37 ° C em uma incubadora, agitando a 300rpm. </li><li> Remover o solvente da digestão (água), utilizando um concentrador. </li></ol> 3. MALDI-TOF análise dos oligossacarídeos liberados <ol><li> BioRex MSZ cação 501 contas resina de troca são usados ​​para remover sais e enzimas a partir da amostra digerida. Condição de as contas, colocando uma alíquota em uma coluna vazia e lavar as contas com grandes quantidades de água. </li><li> Adicionar contas de 10/05 BioRex para a amostra digerida e secas. Em seguida, adicione água 10μl, para pequenas quantidades de material de 5μl de água pode ser usada. Mergulhe as contas na solução por breves instantes, girando o tubo. Incubar por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Local 2μl matriz (2,5-dihydroxybenzoic ácido (DHB), 10mg/ml em água) sobre uma placa de MALDI-alvo. Evaporar o solvente sob vácuo matriz levando a cristais químicos homogêneo matriz. </li><li> 2μl local da solução da amostra dessalinizada em cima dos cristais da matriz na placa-alvo. Se você quiser detectar um grande número de amostras apenas manter a mancha para um máximo de 3min. Este prazo garanta que a amostra spotted primeiro ainda não secou. Esperar por uma 2min adicionais para assegurar uma mistura completa de re-dissolvido matriz e moléculas da amostra de oligossacarídeos na amostra manchado passado. Em seguida, secar a placa-alvo sob um vácuo. A mistura amostra / matriz deve se cristalizar em menos de 1min para habilitar cristalização homogênea. </li><li> Coloque placa de alvo em um espectrômetro de massa MALDI-TOF. A máquina deve ser definida para o modo reflectron positiva com uma tensão de aceleração de 20000V e um atraso de 350 nm, a faixa de massa devem ser selecionados 500-3000 Da (pode mudar depende da oligômeros esperado). Começar a disparar o laser e recolher 100-200 espectros por exemplo, que são compilados para gerar um espectro médio representativo (Figura 2A). Íons representando oligossacarídeos específicos podem ser identificados pela sua massa mais razão de carga (m / z). As intensidades de íons (altura do pico) de todos os íons de interesse devem ser adicionados até 100%, resultando na abundância relativa de cada oligossacarídeo na amostra (Figura 2B). </li></ol> 4. Na análise OLIMP situ OLIMP também pode ser usado diretamente sobre o tecido omitindo qualquer etapas de preparação da parede. Como um exemplo de hipocótilos estiolados Arabidopsis como fonte de tecidos de plantas são usados. Mais uma vez, uma endoglucanase é usado para determinar a estrutura do xiloglucano hemiceluloses. Enzima e material de tecido pode ser substituído em função da análise desejada usando o mesmo procedimento. <ol><li> Colheita um mudas estioladas e coloque-a um prato vazio MALDI-alvo e deixe a seca das plântulas. </li><li> Adicionar 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, dissolvido em formiato de amônio 50 mM, pH4.5) na mudas secas na posição desejada. Certifique-se que a gota toca enzima parcialmente a placa de alvo. </li><li> Coloque a placa de MALDI-alvo em um recipiente fechado com umidade de saturação, para evitar que a queda da enzima seca. Incubar a placa na câmara para um6h a 37 ° C. </li><li> Secar a placa MALDI-alvo com o tecido vegetal ea queda das enzimas sob vácuo. </li><li> Adicionar 0.5μl matriz (DHB; 10mg / l) em cima de cada ponto da enzima secas. Deixe descansar por 2 minutos. </li><li> Secar a placa-alvo MALDI sob vácuo. </li><li> Analisar amostras com o MALDI-TOF. Coloque a placa com o tecido-alvo eo local da enzima / matriz (s) em um espectrômetro de massa MALDI-TOF. A máquina deve ser definida para o modo reflectron positiva com uma tensão de aceleração de 20000V e um atraso de 350 nm, a faixa de massa devem ser selecionados 500-3000 Da (pode mudar depende da oligômeros esperado). </li><li> Começar a disparar o laser para os cristais da matriz / amostra NEXT para o tecido. Certifique-se de não acertar o tecido em si, como no caso, o tempo de vôo das moléculas será desligado. Coletar cerca de 20-50 espectros por spot, que são compilados para gerar um espectro médio representativo (Figura 3). Íons representando oligossacarídeos específicos podem ser identificados pela sua massa mais razão de carga (m / z). As intensidades de íons (ion altura) pode ser relatado e todos os íons de interesse devem ser adicionados até 100%, resultando na abundância relativa de cada oligossacarídeos na amostra. </li></ol> 5. Resultados representante Um exemplo de uma análise OLIMP da xiloglucano hemiceluloses presentes em mudas de Arabidopsis é mostrado na Figura 2. Devido às diferenças de massa dos íons e da enzima conhecida bem caracterizado especificidade (endoglucanase) os íons podem ser atribuídos a estruturas específicas de oligossacarídeos (Figura 2A). Obviamente, isômeros estruturais não podem ser distinguidos. O pressuposto básico para a determinação da abundância relativa dos vários oligossacarídeos (Figura 2B) é que sua massa factor de resposta de especificações é muito semelhante para os oligossacarídeos. Como mostrado aqui, a quantificação OLIMP é altamente reprodutível. No entanto, observe que a robustez do método é altamente dependente do sinal para relações de ruído dos vários íons oligossacarídeo. Por exemplo a contaminação com sais ou menor quantidade de oligossacarídeos pode diminuir essa relação. A análise OLIMP sobre o tecido em si (na análise de situ) permite o estudo de áreas muito pequenas e definido e envolve a preparação da amostra muito pouco. No exemplo aqui apresentado (Figura 3) não qualitativa (íons mesma), mas diferenças quantitativas (variação nas intensidades ion) foram observadas entre parte aérea e raiz-tecido da plântula Arabidopsis. Permutações da OLIMP método, poderia, assim, levar a "imagem" do tecido. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma do procedimento OLIMP utilizando mudas Arabidopsis inteiro como uma fonte de planta. Primeiro, o tecido é macerado e material da parede celular está preparado (foto modificada de Fujino et al. 10). Então oligossacarídeos de um polissacarídeo de parede especial são liberados através de um hidrolase específica. Finalmente, a abundância relativa dos oligossacarídeos solúveis são determinados utilizando MALDI-TOF espectrometria de massa. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Abundância relativa de oligossacarídeos xiloglucano em plântulas estioladas de Arabidopsis, conforme determinado pelo OLIMP. A) Representante xiloglucano espectro de massa oligossacarídeo; cada íon representa uma estrutura específica de oligossacarídeos, isômeros estruturais não podem ser distinguidos. B) diagrama de barras correspondentes para a determinação da abundância relativa de oligossacarídeos. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Na análise OLIMP situ utilizando mudas estioladas de Arabidopsis como exemplo. Cada gota de enzima / digestão (círculos coloridos) podem ser analisados ​​de forma independente e um espectro de massa correspondente podem ser obtidas e analisadas. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. OLIMP espectro da xilana hemicelulose obtidos por digestão Miscanthus material da folha com uma xilanase (Megazyme).

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método apresentado aqui OLIMP permite uma análise muito sensível e rápida de polímeros presentes nas matrizes extracelulares. OLIMP combina a liberação enzimática de oligômeros com a análise de MALDI-TOF subseqüentes. A geração de um espectro de MALDI-TOF leva menos de um minuto, daí OLIMP é adequado para uma ampla gama de aplicações, incluindo estudos de alto rendimento, como telas de mutantes. OLIMP não se restringe a polissacarídeos vegetais, mas pode potencialmente ser aplicada a uma ampla gama de polímeros, apenas limitada pela disponibilidade de enzimas hidrolíticas específicas. No entanto, uma limitação da OLIMP é que uma abundância absoluta de o polímero não pode ser obtida. Como mencionado anteriormente OLIMP pode ser usado para estudar a estrutura de uma variedade de polissacarídeos presentes na matriz extracelular de uma diversidade de espécies. Como exemplo, a Figura 4 representa um espectro OLIMP da hemicelulose importante em espécies de gramíneas, xilana. Aqui, material da parede celular derivada da temperadas grama Miscanthus foi digerido utilizando uma xilanase.

<table><tbody><tr><td>ácido 2,5-dihidroxibenzóico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37550</td><td>10mg/mL em água</td></tr><tr><td>Resina BioRex MSZ 501(D)</td><td>Bio-Rad</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>Endoglucanase</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td></td></tr><tr><td>Xilanase M6</td><td>Megazyme</td><td>E-XYRU6</td><td></td></tr><tr><td>bolas de metal de 3 mm</td><td>Retsch</td><td>22.455.0011</td><td></td></tr><tr><td>moinho de impacto</td><td>Retsch</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>Axima Performance</td><td></td></tr><tr><td>placa-alvo MALDI</td><td>Kratos Analytical</td><td>DE4555TA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Vacufuge 5301</td><td></td></tr><tr><td>manifold a vácuo</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>bomba de vácuo</td><td>Welch Allyn</td><td>DryFast Ultra 2032</td><td></td></tr></tbody></table>

oligo profiling massa (olimp) de polissacarídeos extracelulares

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

O contato direto das células para o meio ambiente é mediada, em muitos organismos por uma matriz extracelular. Um aspecto comum de matrizes extracelulares é que eles contêm metades açúcar complexo em forma de glicoproteínas, proteoglicanos e / ou polissacarídeos. Exemplos incluem a matriz extracelular dos seres humanos e células animais que consiste principalmente de proteínas fibrilares e proteoglicanos ou o polissacarídeo paredes à base de células de plantas e fungos, e os proteoglicanos / glicolipídeo paredes à base de células de bactérias. Todos estes glycostructures desempenham um papel vital na célula-célula de comunicação e de células-to-ambiente e de sinalização. Um exemplo extraordinário complexo de uma matriz extracelular está presente nas paredes das células de plantas superiores. Sua parede é feito quase inteiramente de açúcares, até 75% do peso seco, e consiste dos biopolímeros mais abundantes presentes no planeta. Portanto, a pesquisa é conduzida como utilizar esses materiais melhores como um recurso de carbono neutro renováveis ​​para substituir derivados petroquímicos de combustíveis fósseis. O principal desafio para a conversão de combustível permanece a recalcitrância de paredes à degradação enzimática ou química, devido à glycostructures única presente neste biocomposite único. Aqui, apresentamos um método para a análise rápida e sensível da planta glycostructures parede celular. Este método Profiling Massa Oligo (OLIMP) baseia a liberação enzimática de oligossacarídeos a partir de materiais de parede facilitar glycosylhydrolases específica e posterior análise das misturas de oligossacarídeos solubilizada usando matrix-assisted laser de dessorção / ionização de tempo de vôo espectrometria de massa (MALDI-TOF/MS ) 1 (Figura 1). OLIMP exige paredes de apenas 5.000 células para uma análise completa, pode ser realizada no próprio tecido 2, e é passível de high-throughput análises 3. Embora a quantidade absoluta do oligossacarídeos solubilizados não pode ser determinado por OLIMP a abundância relativa dos íons vários oligossacarídeos pode ser delineada a partir dos espectros de massa dando insights sobre a substituição de padrões do polissacarídeo nativo presente na parede. OLIMP pode ser usado para analisar uma grande variedade de polímeros de parede, limitada apenas pela disponibilidade de enzimas específicas 4. Por exemplo, para a análise de polímeros presentes na planta enzimas da parede celular estão disponíveis para analisar o xiloglucano hemiceluloses usando um xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xilana usando uma endo-β 6,7 (1-4)-xilanase , ou para polissacarídeos pécticos utilizando uma combinação de uma poligalacturonase e um methylesterase 8. Além disso, usando os mesmos princípios de OLIMP glycosylhydrolase e até mesmo atividades glicosiltransferase podem ser monitorados e determinados 9.

Uma maneira rápida é descrito para obter insights sobre a estrutura de polissacarídeos em uma matriz extracelular. O método aproveita a especificidade do glycosylhydrolases ea sensibilidade da espectrometria de massa permitindo que pequenas quantidades de materiais a serem analisados. Esta técnica é adaptável para ser usada diretamente sobre o tecido em si.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

O contato direto das células com o ambiente é mediado, em muitos organismos, por uma matriz extracelular. Um aspecto comum das matrizes extracelulares é...

O perfil de massa de oligômeros ou experimento Olímpico mostrado aqui permite obter rapidamente informações sobre a estrutura de polímeros na matriz extracelular ou na parede celular de um organismo. No caso apresentado, paredes celulares são preparadas a partir de plântulas de plantas removendo-se primeiro os componentes celulares com etanol a 70%. O polímero da parede-alvo é então digerido com uma hidrolase específica, solubilizando componentes particulares da parede na forma de oligômeros.Uma abordagem alternativa é digerir a parede celular com a enzima em C dois diretamente no tecido. A abundância relativa dos ligamentos liberados é determinada por MALDI espectrometria de massas e análise estatística. Olá, sou Marcus Polly do Instituto de Ciências Biossustentáveis em Energia aqui na Universidade da Califórnia em Berkeley.Olá, sou Marcus Re. E eu sou Asha Giller. Também do Instituto de Ciências Biossustentáveis. Os organismos são cercados por matrizes extracelulares que, dependendo do organismo, consistem em redes complexas de polímeros.Uma maneira rápida e sensível de avaliar a matriz extracelular é um método que chamamos de perfilagem de massa oli, abreviação de oleum, que mostraremos a vocês hoje. Este procedimento também pode ser realizado diretamente no tecido vegetal. Então, vamos começar.Inicie este procedimento isolando a matriz extracelular ou a parede celular de tecidos vegetais. Colete cinco plântulas de arábide ou quantidade equivalente de outro material vegetal e transfira-as para um tubo de reação de 1,5 mililitro. Certifique-se de que o material seja colocado no fundo do tubo.Adicione duas esferas metálicas de três milímetros ao tubo de reação e congele rapidamente em nitrogênio líquido. Em seguida, triture a amostra congelada usando um moinho de bolas por 2,5 minutos a 25 hertz. Após a moagem do material, adicione um mililitro de etanol aquoso a 70% à amostra.Remova as esferas metálicas utilizando um ímã e vortexe completamente. Este tratamento solubiliza a maioria das proteínas e organelas celulares; centrifugue a amostra a 14.000 RPM por 10 minutos para formar um pellet do resíduo insolúvel em álcool. Representando o material da parede celular, aspire cuidadosamente o sobrenadante, certificando-se de não perturbar o pellet.Adicione um mililitro de solução de clorofórmio-metanol ao pellet restante no tubo e vortexe completamente para ressuspender o pellet. Em seguida, centrifugue para extrair compostos hidrofóbicos, como lipídios, com a mistura de clorofórmio-metanol. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e seque completamente o pellet utilizando um centrifugador a vácuo. Isso conclui o isolamento do material da parede celular, que agora pode ser tratado para obter ligantes específicos.O exemplo demonstrado aqui é a solubilização do xiloglucano, a principal hemicelulose presente nas paredes celulares de plantas dicotiledôneas, como a *Arabidopsis*. O xiloglucano é um polímero composto por uma cadeia principal de glicano que é fortemente substituída por outros resíduos de açúcares, o que dificulta a solubilização desse polímero. Uma endoglicanase fúngica é utilizada para solubilizar essa hemicelulose. Reconstitua o pellet de parede celular isolada e seca em 25 microlitros de formiato de amônio 50 milimolar, pH 4,5, e adicione 0,2 unidades de endoglicanase. Agite a suspensão em vórtex e centrifugue para recolher o líquido.Coloque o tubo em um agitador e deixe as paredes digerirem por 16 horas a 37 graus Celsius com agitação, a 300 RPM. Quando a digestão da parede celular isolada estiver completa, remova o solvente utilizando uma centrífuga a vácuo e prossiga para analisar os oligossacarídeos liberados por espectrometria de massas; sais e enzimas são removidos da amostra digerida utilizando as esferas de resina de troca catiônica da Biox MSD 5 0 1.Primeiramente, condicione as esferas colocando a quantidade necessária em uma coluna vazia e lavando-as com grandes quantidades de água. Adicione de cinco a dez esferas catiônicas Biox condicionadas à amostra digerida e seca. Em seguida, adicione 10 microlitros de água para quantidades menores de material.Pode-se usar cinco microlitros de água. Mergulhe as esferas na solução girando brevemente o tubo e incube por pelo menos 10 minutos à temperatura ambiente enquanto o digesto estiver incubando com as esferas. Aplique dois microlitros da matriz DHB sobre uma placa-alvo mal D.Evapore o solvente da matriz sob vácuo, levando à formação de cristais químicos da matriz; agora, adicione duas microlitros da solução do digesto dessaltingada sobre os cristais da matriz na placa-alvo. O solvente da amostra na mancha da matriz é novamente evaporado sob vácuo.É importante manter um tempo adequado para a mistura do líquido da matriz da amostra antes da cristalização, conforme descrito em detalhes no protocolo escrito que acompanha. Uma vez que a amostra tenha secado, coloque a placa alvo em um espectrômetro de massas maldi. Configure a máquina no modo positivo com uma tensão de aceleração de 20.000 volts e um atraso de 350 nanômetros.A faixa de massa selecionada para esses ligantes de hemicelulose é de 500 a 3000 Daltons. A faixa de massa deve ser modificada de acordo com o tamanho dos ligantes esperados. Inicie a emissão do laser e colete de 100 a 200 espectros por amostra, que são compilados para gerar um espectro médio representativo.Este é o espectro de hemicelulose. O método oly demonstrado neste vídeo também pode ser utilizado diretamente no tecido vegetal, omitindo quaisquer etapas de preparação da parede. Este procedimento de análise in situ é demonstrado em plântulas de arábidos cultivadas no escuro.O espécime é colocado diretamente sobre uma placa de alvo e seco ao ar até ficar na forma de plântula seca sobre a placa. Adicione 0,5 microlitros da mistura apropriada de tampão enzimático nas posições desejadas. Certifique-se de que a gota de enzima toque parcialmente o tecido e a placa de alvo.Coloque a placa alvo de MALDI em um recipiente fechado com umidade saturada para evitar a secagem das gotas de enzima. Incube a placa por 16 horas a 37 graus Celsius. Ao final do período de incubação, seque o ponto de enzima sob vácuo e adicione 0,5 microlitros da matriz DHB líquida sobre cada ponto de enzima seco.Em seguida, seque a placa alvo de MALDI sob vácuo. Para analisar as NC, dois amostras. Coloque a placa alvo, incluindo os pontos de matriz enzimática com o espécime de tecido, em um espectrômetro de massas para registrar espectros de massa, utilizando as mesmas configurações usadas para a amostra isolada de parede celular.Comece a disparar o laser sobre a matriz. Analise os cristais próximos ao tecido. Certifique-se de não atingir o tecido em si, pois, nesse caso, o tempo de voo das moléculas ficará incorreto.Colete cerca de 20 a 50 espectros por ponto e compile-os para gerar um espectro médio representativo. Este é um espectro médio representativo dos oligossacarídeos derivados do glucano HemosIL presente nos SOPs. As plântulas, as intensidades dos íons ou a altura dos íons de todos os íons de interesse são somadas a 100%, resultando na abundância relativa dos diversos oligossacarídeos.O resultado do método NC dois OMP fornece resultados semelhantes. Cada gota de digestão enzimática marcada por um círculo colorido pode ser analisada independentemente e os espectros de massa correspondentes podem ser obtidos e analisados. Oola também pode ser realizada em outros polímeros da matriz extracelular se uma enzima hidrolítica apropriada estiver disponível.Como exemplo, este é um espectro oola da cibusa de hemocelulose presente na cultura de bioenergia. Ms.Canus para obter os dados apresentados enquanto o material de uma folha de mecampus foi digerido com o xin. Para a atribuição de estruturas aos íons, consulte o protocolo acompanhante.Acabamos de mostrar a você o procedimento de perfilagem de massa de oligômeros em métricas extracelulares. Polímeros. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que os melhores resultados podem ser obtidos quando são alcançados resultados de matriz homogênea para a análise por OV MS. É isso então.Obrigado por assistir e boa sorte com os experimentos.

oligo-mass-profiling-olimp-of-extracellular-polysaccharides

Research

JoVE Journal

Biology

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