Name: Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprenda a medir a atividade das calpaínas em células fixas e vivas por citometria de fluxo usando o substrato fluorescente BUC, LMC MAC. Este método auxilia pesquisadores em estudos de leucemia e linfoma.

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Suportada por concessões do Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society do Canadá e da Fundação Linfoma do Canadá.

Prepare Reagentes Nota: Todos os PBS contém Ca 2 + e Mg 2 + <ol><li> Reagente de detecção Adicionar 20Hm 7-amino-4-clorometil cumarina, t-BOC-Leucina-metionina amida (BOC-LM-CMAC) a temperatura ambiente PBS. Cada suspensão de células exigirá reagente de detecção 2 ml. </li><li> Paraformaldeído 1% (células fixas) Diluir solução stock 4% paraformaldeído em PBS à temperatura ambiente. Paraformaldeído 1mL alíquota de 1% a cada tubo FACS. Três tubos FACS são necessários para cada condição experimental (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 precisará de 9 tubos FACS) </li><li> PD150606 (inibidor da calpaína) Reconstituir PD150606 em DMSO para uma concentração final de 100mM. Proteger este reagente e todas as células tratadas com da luz para a duração do experimento. </li><li> PD98059 (MEK1 inibidor) Reconstituir PD98059 em DMSO para uma concentração final de 50mM. </li></ol> Prepare Células <ol><li> Cultivar células 32Dkit menos 5 x 10 5 a 1 x 10 6 células por ml em Opti-MEM meio suplementado com 5% de soro fetal bovino, WEHI-3 sobrenadante como fonte de IL-3 (ou qualquer outra fonte de IL-3, tais como a proteína recombinante), 0,1% 2-mercaptoetanol e antibióticos. </li><li> Coletar 12 x 10 6 células 32Dkit em três tubos de 15mL Falcon (4 x 10 6 células por tubo). </li><li> Agregar as células a 1000 RPM por 5 minutos a 15 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 2 mL PBS à temperatura ambiente. </li><li> Tratar uma suspensão de células com 50 ìm PD150606. Certifique-se a amostra é protegido da luz, cobrindo o tubo Falcon com papel alumínio. Vortex brevemente, em seguida, incubar por 20-30 minutos em temperatura ambiente no escuro. </li><li> Tratar da suspensão de células em segundo lugar com 20Hm PD98059. Placa de células em um prato de 35 milímetros de cultura de tecidos e incubar por 2 horas a 37 ° C. </li></ol> Calpaína Ensaio em células fixas <ol><li> Enquanto as amostras são incubadas com PD150606, começa o ensaio calpaína nas amostras não tratadas. Comece por adicionar o reagente de detecção de 2 ml para cada suspensão de células. Imediatamente adicionar 1mL da suspensão de células / mistura de reagentes de detecção para os tubos previamente preparado FACS com paraformaldeído 1% (0 ponto tempo minutos). </li><li> Incubar suspensões de células com o reagente de detecção por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 1 mL da suspensão de células para um tubo com 1 mL FACS paraformaldeído 1%. </li><li> Continue a incubar a suspensões de células com a mistura de detecção para um adicional de 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 1 mL da suspensão de células para um tubo com 1 mL FACS paraformaldeído 1%. </li><li> Repita ensaio calpaína em células 32Dkit que foram tratados com inibidores. </li><li> Corrigir as células durante a noite no escuro a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, agregar as células a 1800 RPM por 5 minutos a 15 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 750uL PBS. Coloque as células no gelo e manter no escuro. </li></ol> Aquisição de dados para células fixas <ol><li> Analisar as células usando um LSR II (BD Bioscience). Os filtros são definidos para o Xcyte Lightwave (UV) laser, linha de excitação 355nm e potência do laser 25mW, emissão de 405 e 450 nm para substrato e produto, respectivamente. Filtros de banda passante para substrato e produto são 405/20 e 450/50. Filtros de passe longo para substrato e produto são 405 e 450. A tensão PMT foi fixado em 350-375 para o substrato e 325-350 para o produto. </li><li> Set-up um experimento FACSDiva BD com os seguintes parâmetros: dispersão para a frente; dispersão lateral; Indo-1 Blue (log); Indo-1 Violet (log). Na planilha configurar os seguintes gráficos: dispersão frente vs lado gráfico de pontos de dispersão com um portão de células vivas (Figura 1a), Indo-1 histograma Azul, Indo-1 histograma Violet, Indo-1 Blue vs Violet Indo-1 gráfico de pontos. </li><li> Calibrar o II LSR com AlignFlow e AlignFlow mais partículas fluorescentes (Invitrogen). A tensão PMT deve ser ajustada para colocar o pico do histograma talão de fluorescência no mesmo canal antes de cada experimento. </li><li> Começar a adquirir os dados usando as células 32Dkit no ponto de tempo 0 minuto. Ajustar tensões parâmetro como necessário. Adquirir e registrar 10 mil eventos por amostra. </li><li> Repita aquisição para cada amostra, enxaguar a máquina com tampão FACS entre cada tubo. </li><li> Exportar os dados. Garantir LSR II é limpo de acordo com as diretrizes do instituto. </li></ol> Calpaína Ensaio em células vivas <ol><li> Prepare as suspensões de células como acima, sem PD150606. Trazer as amostras para o II LSR e configurar filtros e parâmetros acima. Configure a planilha como acima. Incluir um gráfico de pontos grande mostrando Indo-1 Blue vs tempo. Definir o programa para adquirir o máximo de númerosmero de eventos (sem portão stop). </li><li> Adicionar 50 ìm suspensão de células PD150606 a uma das células 32Dkit. Manter a amostra no escuro e incubar a temperatura ambiente por 20-30 minutos. </li><li> Começar a adquirir dados sobre a suspensão de células 32Dkit sem PD150606. Use uma baixa taxa de fluxo de 200-300 eventos por segundo. Após 30 segundos a 1 minuto retire o tubo da máquina. Adicionar 20Hm BOC-LM-CMAC para as células. Vortex brevemente em seguida, continuar a aquisição dos dados. </li><li> Aquisição de dados por 10-20 minutos ou até os planaltos atividade calpaína. </li><li> Repita os passos 3 e 4 com as células tratadas com 32Dkit PD150606. </li><li> Exportar os dados. Garantir LSR II é limpo de acordo com as diretrizes do instituto. </li></ol> Calpaína Assay no Complexo Populações (Mixed) Célula * Esta experiência vai identificar as células 32Dkit em uma suspensão de células colhidas de um baço mouse. <ol><li> Colheita do baço de cada rato. Lisar as células vermelhas do sangue com NH 4 Cl por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Preparar suspensões única célula em 2 mL de PBS. </li><li> Divida cada suspensão de células em dois. Tratar uma suspensão de células com 50 ìm PD150606 por 20-30 minutos em temperatura ambiente no escuro. </li><li> Proceda como acima para o ensaio calpaína em células Fixo (Passos 1-6) </li><li> Aspirar o sobrenadante. Lavar as células em 500μL de PBS. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em tampão coloração 200μL com BSA 2%. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Prepare o anticorpo primário (anti-camundongo FITC CD117). O anticorpo deve ser utilizada na diluição de 1:200 na coloração buffer. Certifique-se o anticorpo é mantido no escuro. </li><li> Adicionar 200μL anticorpo primário para as células. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 400μL de PBS para aumentar o volume de citometria de fluxo. Coloque as células no gelo e manter no escuro. </li><li> Proceda conforme descrito em adquirir dados para Células Fixo. Adicionar FITC aos parâmetros e incluem um histograma para FITC na planilha. </li></ol> Análise e Resultados Representante <ol><li> Analisar os dados usando programa FlowJo (Treestar). Portão em células vivas com base no perfil de dispersão para a frente e lateral (Figura 1a). Determinar a fluorescência significa para Indo-Azul a partir do portão de células viáveis ​​(Figura 1b). </li><li> a) Para a população mista de células <ul><li> uso de fluorescência FITC em parcelas de histogramas e de ponto para identificar a população 32Dkit </li><li> Determinar a fluorescência significa para Indo-Azul da população 32Dkit </li></ul></li><li> Use Microsoft Excel para o gráfico de fluorescência média (Figura 2a). Calcule a inclinação da linha entre 5 e 10 minutos. Inclinação do gráfico como um gráfico de barras para determinar a atividade calpaína nas células (Figura 2b). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> Figura 1a. Determinação de células vivas com base no perfil de dispersão para a frente e lateral. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> Figura 1b. Variação média de fluorescência mais de 10 minutos curso de tempo. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Figura 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2a"> Figura 2a gráfico. Representante da fluorescência média. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Figura 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2b"> Figura 2b. Calpaína atividade em células 32Dkit com inibidores.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A atividade de calpaína em células 32Dkit fixa e vivendo foi determinado neste protocolo de vídeo. Tratamento da linhagem de células com o inibidor de calpaína PD150606 resultou em inibição total da atividade calpaína nas células. Além disso, o tratamento com o inibidor MEK1 PD98059 resultou em inibição total da atividade calpaína nas células. ERK é um ativador principal de calpaína-2 3. Estes resultados sugerem que calpaína-2 é a atividade predominante nas células 32Dkit. Trabalhos em curso em nosso laborató...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldeído</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Dissolva 4 g de paraformaldeído em 100 mL de PBS. Em capela, aqueça a amostra com agitação até ficar transparente.&lt;br/&gt;Deixe esfriar, depois armazene a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Use PD150606 recém-reconstituído para inibição máxima da calpaína.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow, AlignFlow mais esferas fluorescentes, tubos FACS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;O sobrenadante de células WEHI-3 é utilizado como fonte de IL-3 nestes experimentos. Cada coleta de sobrenadante de WEHI-3 é titulada para determinar a concentração ótima utilizada para o crescimento de células 32Dkit. </td></tr></tbody></table>

medir a atividade das calpaínas em células fixas e vivendo por citometria de fluxo

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpaínas são onipresentes intracelular, cálcio-sensíveis, cisteína proteases neutras<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas desempenham um papel crucial em muitos processos fisiológicos, incluindo a sinalização, remodelação do citoesqueleto, a regulação da expressão gênica da apoptose e progressão do ciclo celular<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas tem sido implicado em muitas patologias, incluindo distrofias musculares, câncer, diabetes, doença de Alzheimer e esclerose múltipla<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaína regulamentação é complexo e incompletamente compreendida. níveis de mRNA e proteína correlacionam mal com a atividade, limitando o uso de técnicas de expressão do gene ou proteína para medir a atividade calpaína. Esta detalhes protocolo de vídeo de um ensaio de citometria de fluxo desenvolvido em nosso laboratório para medir a atividade das calpaínas em células fixas e de viver. Este método usa o substrato fluorescente BOC-LM-CMAC, que é clivada especificamente pela calpaína, para medir a atividade calpaína.<sup&gt; 2</sup&gt; Neste vídeo, calpaína atividade em fixos e células vivas 32Dkit murine leukemia, sozinho ou como parte de uma população esplenócitos é medida usando um LSRII (BD Bioscience). Células 32Dkit mostraram que têm atividade elevada em comparação com esplenócitos normal.

Este artigo irá detalhar o protocolo para medir a atividade das calpaínas em células fixas e vivendo por citometria de fluxo.

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

As calpainas são proteases de cisteína neutras, intracelulares e sensíveis ao cálcio, onipresentes 1. As calpainas desempenham papéis cruciais em muitos processos fisiológicos, ...

As calpaínas são proteases intracelulares sensíveis ao cálcio, cisteína dependentes e de natureza neutra, que desempenham papéis cruciais em diversos processos fisiológicos, incluindo sinalização, remodelamento do citoesqueleto, regulação da expressão gênica, apoptose e progressão do ciclo celular. Para medir a atividade da calpaína em células fixadas e vivas, adiciona-se o substrato fluorescente BUC, LMC MAC. O Buc LMC MAC é especificamente clivado pela calpaína, resultando em um aumento da fluorescência. A variação da fluorescência é monitorada por citometria de fluxo, o que revela atividade aumentada da calpaína em células 30 2D kit em comparação com cítos normais.Olá, sou Christina Farr do laboratório do Dr. Stewart Berger na Universidade de Toronto, no Departamento de Imunologia e na Rede de Saúde da Universidade. Hoje vou mostrar como medir a atividade da calpaina em células fixadas e vivas utilizando um ensaio baseado em citometria de fluxo. Utilizamos este ensaio em nosso laboratório para analisar a atividade da calpaina em células de leucemia e linfoma.Então vamos começar. Antes de iniciar os experimentos, prepare os reagentes necessários, incluindo o reagente de detecção 1%PARAFORM aldeído cal pain inibidor PD 1 50 0 6 0 6 e o inibidor de MEC um PD 9 8 0 5 9. Para obter detalhes sobre a preparação desses reagentes, consulte o protocolo escrito acompanhante. Adicione um mililitro de paraformaldeído 1% a cada tubo fax.São necessários três tubos fax para cada condição experimental das células fixadas mostradas neste vídeo. São testadas três condições, portanto são necessários nove tubos fax. Inicie com 32 células dki a 0,5 a uma vez 10 elevado a seis células por mililitro cultivadas em meio ótimo.Suplementado com soro bovino fetal, IL três, etanol capto tumoral e antibióticos. Transfira quatro vezes 10 à sexta potência de células para cada um dos três tubos Falcon de 15 mililitros. Coloque os tubos na centrífuga e faça o pellet girando a 225 Gs durante cinco minutos a 15 graus Celsius.Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em dois mililitros de PBS à temperatura ambiente. Trate uma suspensão celular com inibidor de calpaína 50 micromolar PD 1500606. Certifique-se de que a amostra esteja protegida da luz cobrindo o tubo com papel alumínio. Vortexe brevemente e, em seguida, incube por 20 a 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.Trate a segunda suspensão celular com 20 micromolar do inibidor MEK PD 98059. Plaque as células em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros e incube-as por duas horas a 37 graus Celsius enquanto as amostras estão em incubação. Inicie o ensaio de calpaína nas amostras não tratadas.Inicie adicionando dois mililitros do reagente de detecção à suspensão celular. Adicione imediatamente um mililitro da mistura de suspensão celular com reagente de detecção aos tubos fax previamente preparados para gerar a amostra T igual a zero. Incube as suspensões celulares com o reagente de detecção por cinco minutos.À temperatura ambiente, adicione um mililitro da mistura de reagentes de detecção de suspensão celular ao tubo fax previamente preparado com um mililitro de paraformaldeído 1% para gerar a amostra T igual a cinco. Continue incubando as suspensões celulares restantes com a mistura de detecção por mais cinco minutos à temperatura ambiente. Após cinco minutos, transfira outro mililitro da suspensão celular para um tubo fax preparado com um mililitro de paraformaldeído 1%.Este é o ponto de tempo T igual a 10 minutos. Em seguida, repita o ensaio de calpaína em 30 células 2D do kit que foram tratadas com inibidores. Cubra o suporte com folha de alumínio.Fixe as células durante a noite no escuro a quatro graus Celsius no dia seguinte. Peline as células por centrifugação a 725 Gs durante cinco minutos a 15 graus Celsius. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda as células em 750 microlitros de PBS.Coloque as células sobre gelo e mantenha-as no escuro até o momento de realizar a citometria de fluxo. Aqui. A aquisição de dados é demonstrada para células fixadas. Realize a citometria de fluxo usando um LSR dois.Defina os filtros para a onda de luz ex excitar ou linha de excitação a laser UV em 355 nanômetros e a potência do laser em 25 miliwatts, com emissão de 405 e 450 nanômetros para o substrato e produto, respectivamente. Os filtros passa-banda utilizados para o substrato e produto devem ser 405/20 e 450/50. Os filtros longpass para o substrato e produto devem ser 405 e 450.Defina a voltagem do PMT em 350 a 375 para o substrato e 325 a 350 para o produto. Configure um experimento BD fax diva com os seguintes parâmetros. Dispersão frontal dispersão lateral Indo um azul utilizando escala logarítmica e um violeta.Utilizando também uma escala logarítmica na planilha. Configure os seguintes gráficos. Um gráfico de dispersão para frente versus dispersão lateral com um gate sobre as células viáveis.Um histograma Indo um azul, um histograma Indo um violeta e um gráfico de pontos Indo um azul versus Indo um violeta calibram o LSR dois com um fluxo linear e um fluxo linear mais microesferas fluorescentes. A voltagem do PMT deve ser ajustada para posicionar o pico do histograma fluorescente das microesferas no mesmo canal antes de cada experimento. Inicie a aquisição de dados utilizando as células do kit 30 2D no ponto de tempo de zero minuto.Ajuste as tensões dos parâmetros conforme necessário. Adquira e registre 10.000 eventos por amostra. Lave a máquina com tampão fax e repita a aquisição para cada amostra.Exporte os dados após a aquisição dos mesmos. Certifique-se de que o LSR two foi limpo de acordo com as diretrizes do instituto. Prepare as suspensões celulares como anteriormente, sem adicionar o reagente de detecção ou o inibidor de calpaina.Leve as amostras para o LSR dois e configure os filtros e parâmetros como antes. Configure a planilha da mesma forma. Inclua um gráfico de dispersão grande mostrando Indo um azul versus tempo.Configure o programa para adquirir o número máximo de eventos. Sem porta de parada. Adicione 50 micromolar do inibidor de calpainas a uma suspensão celular de células do kit 32 G.Mantenha a amostra no escuro e incube-a à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos enquanto as células estão em incubação. Comece a adquirir dados na suspensão celular do kit 2D 30 sem o inibidor de calpaína. Utilize uma taxa de fluxo baixa de 200 a 300 eventos por segundo.Após 30 segundos a um minuto, retire o tubo da máquina. Adicione 20 micromolar de Bach LMC mac às células. Este é o reagente de detecção.É clivado especificamente pela calpaína e seu clivagem resulta em um aumento no vórtice de fluorescência do substrato. Em seguida, continue adquirindo os dados. Adquira dados por 10 a 20 minutos ou até que a atividade da calpaína atinja uma fase de platô.A seguir, repita a aquisição com 32 células gki tratadas com inibidor de calpaína. Ao finalizar, exporte os dados para análise. Inicie o ensaio com células mistas utilizando uma suspensão celular obtida de baço de camundongo.Divida cada suspensão celular em duas. Trate uma suspensão celular com 50 micromolar de inibidor de calpaína, cubra com papel alumínio e incube por 20 a 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após realizar o ensaio de calpaína conforme descrito anteriormente para células fixadas, cubra os tubos com papel alumínio e incube as células durante a noite a quatro graus Celsius no escuro.No dia seguinte, centrifugue a 725 Gs durante cinco minutos a 15 graus Celsius. Aspire o sobrenadante, lave as células em 500 microlitros de PBS e aspire o sobrenadante novamente; ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão de marcação com 2% de BSA e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, prepare o anticorpo primário aqui, ZI anti-US.CD um 17 é preparado em tampão de marcação de forma que a diluição final seja de um para 200. Certifique-se de que o anticorpo seja mantido no escuro. Adicione 200 microlitros do anticorpo primário às células, incube por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.Em seguida, adicione 400 microlitros de PBS para aumentar o volume para citometria de fluxo. Coloque as células no gelo e mantenha no escuro. Adquira os dados utilizando o mesmo procedimento de citometria de fluxo mostrado para células fixadas.Adicione ZI aos parâmetros e inclua um histograma para ZI na planilha após a aquisição dos dados no citômetro de fluxo. Analise utilizando o gate do FlowJo em células viáveis com base no perfil de dispersão para frente e dispersão interna. Determine a fluorescência média do Indo Blue a partir do gate de células viáveis.Neste gráfico, a linha vermelha indica a fluorescência média do substrato no tempo zero minutos, e as linhas azul e verde indicam a fluorescência média do substrato aos cinco e 10 minutos. Para a população mista de células, utilize a fluorescência FXI em histogramas e gráficos de dispersão para identificar a população 30 2D kip. Determine a fluorescência média de endo azul da população 30 2D kip.Por fim, utilize o Microsoft Excel para construir o gráfico da fluorescência média. Calcule a inclinação da reta entre cinco e dez minutos. Represente a inclinação em um gráfico de barras para determinar a atividade da calpaina nas células.Os dados apresentados aqui indicam que 30 células 2D possuem altos níveis de atividade da calpaína e que a atividade da calpaína pode ser inibida por inibidores da MEK. Acabamos de mostrar como medir a atividade da calpaína em células fixadas e vivas. Ao realizar esta técnica, é importante configurar corretamente o LSR dois e calibrar o equipamento utilizando esferas fluorescentes.Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

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