Name: Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda a dechorionar embriões de medaka e realizar transplante de células para gerar quimeras em estudos de biologia do desenvolvimento. Este método permite analisar a autonomia celular de genes e proteínas em vertebrados.

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Este trabalho é suportado por uma concessão do MRC de M. FS.

1. Desenvolvimento dos embriões <ol><li> Quando eles são postos, os ovos são agrupados por causa de filamentos penhora sobre o córion. Para permitir que os embriões se desenvolvem normalmente, é necessário separar os ovos. Emaranhado de filamentos e cortar anexo mantendo os filamentos anexo com duas pinças. </li><li> Depois de desagrupamento, os ovos são separados a partir de fezes e algas e transferidos para o meio do embrião fresco a uma densidade máxima de 40 ovos por seis centímetros placa de Petri. </li><li> Embriões Medaka desenvolver um pouco mais lento que o peixe-zebra a 27 ° C. O tempo de incubação é diferente entre as duas espécies; embriões medaka hatch do córion em 7 dias e iniciar imediatamente a nadar e comer, enquanto embriões zebrafish eclodem em dois dias, mas começar a nadar e comer em 5-6 dias. Desenvolvimento de medaka é encenado de acordo com a 4 Iwamatsu do teste. </li><li> O desenvolvimento de embriões medaka pode ser convenientemente ajustado para planos experimentais, selecionando a temperatura adequada. Desenvolvimento de embriões medaka pode ser interrompido a 4 ° C no início do desenvolvimento. Após a fase 24, quando começa a batida do coração, o desenvolvimento pode ser retardado com uma temperatura mínima de 18 ° C. </li><li> O tempo de aparecimento de órgãos / tecidos é um pouco diferente em comparação com medaka zebrafish, ou seja, somitogenesis medaka ocorre após o início do desenvolvimento do cérebro enquanto que em somitegenesis zebrafish precede o desenvolvimento do cérebro. </li></ol> 2. Remoção do córion Córion de medaka consiste em duas camadas de proteção com uma camada dura interna e uma superfície macia exterior. Assim, um tratamento de protease de duas etapas empregando pronase e enzima incubação é necessário eliminar essa córion. Uma vez dechorionated, os embriões devem ser mantidos em 1X BSS. Semi-estéril condições irão reforçar a cultura de embriões dechorionated sucesso, especialmente quando períodos mais longos de observação são necessários. Estes incluem o uso de soluções estéreis (por exemplo, esterilizados 1X BSS com antibióticos) e ferramentas esterilizadas com etanol 70% seguido de lavagem com 1X BSS. Como embriões dechorionated medaka são mais suaves e mais frágil do que embriões zebrafish dechorionated, cuidados extras devem ser tomados para garantir que eles não entrem em contato com o ar ou bolhas na pipeta, pois isso irá causar colapso imediato. Para garantir o mínimo dano aos embriões, um de boca larga calor pipeta de vidro polido com bomba pipeta deve ser usado para a transferência de embriões e um laço do cabelo deve ser utilizado para orientar os embriões para a observação. Pratos não aderente Petri deve ser usado para evitar embriões de fixação em superfícies. <ol><li> Antes de dechorionation deve ser verificado que os ovos foram suficientemente separados e limpos-up. </li><li> Uma vez que ambos pronase e enzimas de incubação são proteinases, eles devem ser mantidos em gelo e minimizar a exposição de embriões para estas enzimas. </li><li> Transferência de ovos para lixa (P2000 tamanho do grão, à prova d'água) colocado na tampa de uma placa de Petri nove centímetros. Remova o meio de excesso, mas garantir um volume suficiente permanece como para evitar a secagem de embriões. </li><li> Rolo delicadamente embriões por cerca de 45-60 segundos para remover alguns dos cabelos superfície externa e levemente marcar a superfície do córion (Figura 1). Transferência de embriões de volta para placa de Petri original e examinar. Quando os embriões rolando no lixa usar o dedo indicador, aplicando o mínimo de pressão e manter paralelo dedo para a superfície de papel de areia. Não enrole mais de embriões 5-7 ao mesmo tempo. Esta precaução irá minimizar o risco de esmagamento embriões um embaixo do outro. </li><li> Substituir médio do ovo no prato com pronase 20mg/ml e embriões incubar por 40-60 minutos a 27 ° C. Garantir os embriões são suficientemente cobertos pela pronase e uma tampa está presente no prato. Pronase não utilizados devem ser mantidos em gelo durante esta etapa para minimizar auto-digestão e pode ser reutilizado até que a atividade é perdido (cerca de 1-2 semanas). </li><li> Recuperar pronase para reutilização e embriões lavar 5X em meio embrião para remover traços de pronase como isso irá inativar a enzima incubação a ser adicionado. </li><li> Remova o meio de embriões e embriões cobrir com a enzima incubação, garantindo embriões sentar-se como uma monocamada no prato. Se os ovos se sentar em cima da outra no prato, aqueles na parte inferior será esmagado como o córion se dissolve. Mantenha enzima incubação não utilizados no gelo. </li><li> Incubar os embriões a 27 ° C e após 15 minutos verificar periodicamente o progresso da incubação utilizando um estereomicroscópio. Será visto que uma série de cratera lunar, como os buracos começam a aparecer na camada interna do córion, que logo se dissolve após esta deixando a camada externa macia do córion facilmente removido manually. Todo o processo de incubação pode levar 15-60 minutos. </li><li> Assim que os embriões saem do córion, a transferência de embriões para uma placa de Petri contendo 1X BSS. Garantir a não transferir para a incubação da enzima 1X BSS tocando a ponta da pipeta na superfície do BSS permitindo que os embriões gentilmente roll out. </li><li> Uma vez que todos os embriões são transferidos de incubação da enzima, fazer uma transferência definitiva para outro prato de doce de 1X BSS. Isso garante embriões não estão expostas a quaisquer vestígios de incubação da enzima, pois isso irá danificar embriões expostos. Uma vez neste prato final de qualquer embrião ainda possuir a camada externa do córion podem ser liberados manualmente usando micro-pinças esterilizadas sob o estereomicroscópio. Se os embriões precisam ser desenvolvidos dechorionation seguintes, de penicilina / estreptomicina deve ser adicionado ao BSS para prevenir o crescimento bacteriano. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Comparação de embriões laminados e desenrolou durante dechorionation. Observar como os embriões rolou no painel B falta os cabelos visto na embriões desenrolou no painel A. 3. Montagem embriões dechorionated Incorporação de agarose é útil para longos períodos de imagem (por exemplo, imagem em tempo-lapso) para embriões vivos, bem como para observações detalhadas dos embriões fixo. Durante a gastrulação e organogênese inicial (fase 14 para estágio 28), os embriões medaka apresentam ondas de movimentos rítmicos contrátil do outro lado da periderme, uma camada de tecido que cobre tanto embrião do desenvolvimento e da gema 5. Embriões são tratados com 3,5 mm 1-heptanol para parar os movimentos contráteis 6. Para interromper a circulação de embriões após a etapa 28 (64hpf), os embriões são anestesiados pela adição de gotas de tricaina mesilato (TMS), antes de incorporação. TMS também é adicionado à agarose (adicione apenas uma quantidade mínima, esta dose precisa ser otimizado, cerca de uma diluição de 1:25). <ol><li> Descongelar uma pequena quantidade de 3% de baixa temperatura de gelificação agarose (em 1X BSS) por aquecimento a 37 ° C e mantida a esta temperatura. </li><li> Os seguintes passos precisam ser realizadas rapidamente para garantir que a agarose não se solidifica antes de orientar o embrião. Usando um de boca larga transferência pipeta de vidro agarose derretida suficiente para preencher a depressão tampa de um tubo Eppendorf. </li><li> Transferência de um embrião dechorionated à depressão cap minimizando transportando mais de BSS com o embrião. Imediatamente a captação do agarose e embrião da depressão tampa e transfira para uma câmara de cultura de Petri. A placa de Petri 3,5 centímetros com uma janela de vidro no fundo é usado. Para geração de imagens usando um microscópio invertido, os embriões são viradas para baixo do corpo orientado e colocou perto da tampa de vidro. Para geração de imagens usando um microscópio na posição vertical, a espessura da agarose é minimizado. </li><li> Transferir a placa de Petri 3,5 centímetros em um prato de 14 centímetros de diâmetro Petri contendo gelo e água (água cheio até cerca de 1 / 3 da profundidade total de prato grande). Enquanto segura a câmara com firmeza na parte inferior da placa de Petri 14 centímetros, use um laço do cabelo suavemente para orientar o embrião como desejado na agarose derretida e mantenha o embrião até a agarose solidifica suavemente levantar e abaixar o prato menor para sua posição original na água gelada. </li></ol> 4. O transplante de células em embriões medaka O objetivo deste procedimento é determinar se o gene de interesse atos células autonomamente (dentro de uma célula) ou não de células-autônoma (entre as células). Células do doador podem ser rotulados com um corante como traçador rodamina-dextran antes do transplante (como descrito em 'microinjeção de embriões Medaka "o protocolo JOVE de acompanhamento) ou uma cepa transgênica com a expressão GFP pode ser utilizada, permitindo avaliação de transplante. Uma combinação de duas técnicas de rotulagem é frequentemente útil para superar auto-fluorescência, que pode ser encontrado. Por lapso de tempo de estudos após o transplante, a expressão GFP é particularmente útil. Use uma pipeta de vidro de boca larga com uma pipeta bomba de todo este procedimento e esterilizar todos os instrumentos (incluindo slides) de antemão com EtOH 70% seguido de enxaguamento com estéril 1X BSS. Embriões destinatário são normalmente desenvolvidas para cerca de estágio 12 como o que permite a discriminação dos pólos ventral e dorsal ao realizar o transplante. <ol><li> Início dechorionating embriões 1,5 horas antes do transplante e aparelhos de injeção de instalação durante as incubações enzima. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio cavidade em um prato de nove centímetros de diâmetro Petri. </li> Adicionar uma pequena quantidade de metilcelulose de 3% para o centro do slide cavidade usando uma ponteira de pipeta estéril e espalhada pouco. <li> Metilcelulose secar por cerca de 1-2 minutos. </li><li> Adicionar 350μl de 1X estéril BSS para preencher a depressão slide. </li><li> Transferência de um embrião doador e até quatro embriões destinatário para o slide com uma pipeta de vidro. </li><li> Embriões orientar usando um loop para que o cabelo blastoderma do embrião é voltado para cima. Embriões podem ser inclinou-se uns contra os outros para aumentar a estabilidade adicional. </li><li> Insira cuidadosamente o micro-agulha em blastoderma doador e, lentamente, a captação 10-20 células. </li><li> Suavemente inserir a agulha em área necessária de blastoderma embrião destinatário e expelir as células lentamente. Grande cuidado deve ser tomado quando da inserção de células no blastoderma destinatário de forma a não perturbar a célula-yolk sac fronteira como isso irá resultar em morte do embrião. </li><li> Despeje esterilizados 1X BSS em placa de Petri. Com cuidado, despeje o BSS no prato o mais próximo possível do lado do prato possível, de modo a não perturbar os embriões. Nunca despeje o BSS diretamente sobre os embriões e adicione BSS suficiente para que o slide e embriões são imersos. </li><li> Adicionar 100μl de penicilina estreptomicina / para o prato e cubra. Transferir cuidadosamente para um prato de 27 ° C incubadora para permitir o desenvolvimento normal. </li><li> Embriões podem ser observados periodicamente, conforme desejado. Ao usar o transplante para a realização de ganho de função e / ou experiências de resgate fenótipo, algumas mudanças morfológicas observadas podem ser devido aos efeitos do transplante. Assim transplantes múltiplos são necessários. Depois de 2-3 dias, melanóforos devem estar presentes no saco vitelino, cabeça, olhos e tronco. Se presente em embriões transplantados em seguida, uma quimera sucesso foi provavelmente produzido (Figura 3). </li></ol> Se necessário, embrião doador genótipo (s), transferindo a PCR tubo (s) contendo 25μl de proteinase K. 20mg/ml Incubar a 55 ° C por 4 horas seguido por 10 minutos a 94 ° C e realizar PCR. 5. Resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Posição Exemplo de um embrião agarose-embedded. Anterior é mostrado à direita e vista é dorsal. Painel B: células endoteliais pode ser visto em ambos os lados do corpo do embrião e são rotulados com GFP conduzido pelo promotor fli. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imagens de pós-transplante de embriões. A imagem mostra um embrião de doador e receptor imediato pós-transplante. O embrião doador é mostrado à direita com uma blastoderma completamente vermelho (seta). O embrião destinatário é mostrado do lado esquerdo e é facilmente identificado pela pequena massa de células transplantadas vermelho visível no blastoderma (seta). Imagem B mostra dois embriões destinatário aproximadamente 7 horas pós-transplante (incubados a 27 ° C). Observe as células transplantadas migraram do local de transplante e estão agora dispersos por todo o blastoderma (setas). Imagem C mostra um embrião destinatário, E-29 (aproximadamente 74hpf). Observe a pigmentação no olho ea presença de melanóforos na região do tronco e cérebro (setas). As células-rodamina rotulado pode ser visto para ser colonizar muitas das estruturas embrionárias indicando o sucesso da produção de uma quimera.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
<li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Sci%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li>
<li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste vídeo demonstramos como dechorionate e realizar transplanataion celular em embriões medaka. Esta é uma técnica poderosa para a produção de embriões quiméricos para o estudo do gene / proteína de função durante o desenvolvimento, bem como para elucidar a autonomia do gene / proteína em questão. Medaka são um sistema modelo útil vertebrados para esta técnica, devido aos mapas destino bem estabelecida e seus empréstimos a transparência los bem na imagem em tempo real, vivo. O transplante pode ser combinado com microinjeção (como descrito em &#39;microinjeção de embriões Medaka &quot;o protocolo JOVE de acompanhamento) de modo que o comportamento das células transplantadas podem ser facilmente observadas.

<table><tbody><tr><td>Meio para embrião</td><td>Reagente</td><td>Preparado no laboratório</td><td>N/A</td><td>200 ml de solução estoque 50X, 1 ml de azul de metileno 1% em H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 litros de água RO (solução estoque 50X: NaCl 14,7 g, KCl 0,6 g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2,4 g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4,0 g/1 litro de água RO.)</td></tr><tr><td>Pinça de microdissecação</td><td>Ferramentas</td><td>55 INOX A.DUMONT&amp;FILS</td><td>N/A</td><td>Pontas muito finas e afiadas para remoção da coriônica.</td></tr><tr><td>Papel de lixa impermeável fino - granulometria p2000</td><td>Ferramentas</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td>N/A</td><td>Granulometria muito fina para rolar/limpar embriões com coriônicas.</td></tr><tr><td>Metilcelulose a 3%</td><td>Reagente</td><td>Sigma</td><td>M 0512</td><td>Alta viscosidade para manter os embriões fixos durante o transplante.</td></tr><tr><td>BSS 1X</td><td>Reagente</td><td>Preparado no laboratório</td><td>N/A</td><td>20XBSS: 130 g de NaCl, 8 g de KCl, 4 g de MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 4 g de CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O e 10 mg de vermelho de fenol em 1 L de água MilliQ e autoclavar; 500 mM de Hepes em água MilliQ autoclavada. Adicionar 25 ml de 20XBSS e 15 ml de 500 ml de Hepes pH 7,0, completar até 500 ml e filtrar para esterilização antes do uso.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Reagente</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Adicionado ao BSS durante a incubação de embriões descorionados.</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Reagente</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>Para descorionação.</td></tr><tr><td>Enzima de eclosão</td><td>Reagente</td><td>Preparado no laboratório</td><td>N/A</td><td>Para descorionação.</td></tr><tr><td>Mesilato de tricaina (TMS)</td><td>Reagente</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>400 mg de tricaina em 97,9 ml de água destilada e 2,1 ml de Tris 1 M, pH ajustado para 7; 4,2 ml dessa solução em 100 ml de água limpa de aquário.</td></tr><tr><td>Agarose com temperatura ultra-baixa de gelificação a 3%</td><td>Reagente</td><td>Sigma</td><td>A-2576</td><td>Tipo IX-A. Utilizada durante a inclusão de embriões para observação.</td></tr><tr><td>Câmara de cultura em placa de Petri</td><td>Ferramenta</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>11-004-008</td><td>Placa de vidro Iwaki de 35 mm com janela de 12 mm. Utilizada durante a inclusão de embriões para observação.</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Equipamento</td><td>Narishige</td><td>N/A</td><td>Modelo MN151. Para remoção e inserção de células durante o transplante.</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Ferramenta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10T</td><td>Para fabricação de agulhas de transplante.</td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Equipamento</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modelo P-97</td><td>Para fabricação de agulhas de transplante.</td></tr></tbody></table>

dechorionation de embriões medaka e transplante de células de geração de quimeras

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka é um pequeno peixe de água doce do egg-laying que permite que ambas as análises genéticas e embriológicas e é um dos três organismos modelo vertebrados em que genome-wide-driven fenótipo mutante telas foram realizadas 1. Divergência de sobreposição funcional de genes relacionados entre medaka zebrafish e permite a identificação de fenótipos romance que não são identificáveis ​​em uma única espécie 2, assim medaka e peixe-zebra são complementares para a análise genética das funções genoma dos vertebrados. Manipulação de embriões medaka, como dechorionation, embriões de montagem para a imagem latente e transplante de células, são procedimentos essenciais para o trabalho em ambos os medaka zebrafish e em um laboratório. Transplante de células analisa autonomia de células de mutações medaka. Quimeras são gerados através do transplante de células marcadas a partir de embriões de doadores em embriões destinatário sem rótulo. Células do doador podem ser transplantadas para áreas específicas dos embriões destinatário com base no destino mapas 3 para que clones de células transplantadas podem ser integrados no tecido de interesse durante o desenvolvimento. Devido ao córion duro e macio embriões, manipulação de embriões medaka está mais envolvido do que em zebrafish. Neste vídeo, vamos mostrar os procedimentos detalhados para manipular embriões medaka.

Devido ao córion duro e macio embriões, manipulação de embriões medaka está mais envolvido do que em zebrafish. Este vídeo mostra passo-a-passo os procedimentos de como manipular embriões medaka, incluindo dechorionation, montagem em agarose para a imagem latente e transplante de células para a produção de quimeras. Estes procedimentos são essenciais para a utilização medaka zebrafish e em um laboratório para tirar o máximo proveito de seus recursos complementares para a análise genética de funções genoma dos vertebrados.

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

O Medaka é um pequeno peixe de água doce ovíparo que permite análises genéticas e embriológicas, sendo um dos três organismos modelo vertebrados em ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir clones em um embrião com a finalidade de examinar a autonomia de um gene ou proteína de interesse. Isso é realizado marcando embriões doadores com rodamina dextrano por microinjeção no estágio de uma célula, conforme mostrado no vídeo complementar a este, microinjeção de embriões de Maka. O segundo passo do procedimento é desenvolver tanto os embriões doadores quanto os receptores até o estágio correto.O terceiro passo do procedimento é revestir tanto os embriões do doador quanto os do receptor. O passo final do procedimento é transplantar células dos embriões doadores marcados para os embriões receptores. Em última análise, os resultados podem ser obtidos analisando a distribuição, proliferação e diferenciação de clones de células transplantadas, detectando-se essas células por meio de sua fluorescência ou marcadores de linhagem.Olá, sou Sean Brazinski do laboratório da Dra. Makoto Fki, do Departamento de Biologia e Bioquímica da Universidade de Bath. Também sou do laboratório Zeki. Hoje vamos mostrar um procedimento para transplante celular em embriões de peixes escuros.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar se um gene ou mutação de interesse possui função autônoma ou não autônoma na célula. Então, vamos começar. Ao revestir ovos maka, utilize soluções e ferramentas estéreis para aumentar a probabilidade de sucesso na observação e cultura de longo prazo.Coloque um pedaço de papel de lixa impermeável de granulação P 2000 na tampa de uma placa de Petri não aderente de nove centímetros. Use uma pipeta de pasta com boca larga e polida a fogo para transferir até 10 ovos recém-desagregados, limpos e identificados de uma placa com meio de ovo para o papel de lixa.Remova o meio em excesso, deixando apenas o suficiente no recipiente para evitar que os ovos sequem. Use a ponta do dedo com luva para rolar suavemente 10 ovos por vez sobre o papel de lixa por 45 a 60 segundos. Para remover os pelos da superfície externa e riscar a superfície de Corian, aplique pressão mínima e mantenha a ponta do dedo paralela ao papel de lixa.Transfira os ovos para o prato original com meio. Remova o meio, cubra os ovos com uma solução de 20 miligramas por mililitro de prone. Cubra o prato e incube a 27 graus Celsius por 60 minutos.Certifique-se de posicionar a placa em um ângulo para que os embriões fiquem suficientemente imersos na enzima. Para minimizar a quantidade de enzima necessária, utilize uma pipeta plástica de transferência para recuperar a pronase para reutilização e coloque-a no gelo. Lave os ovos cinco vezes em meio para embriões para remover todos os vestígios de pronase e impedir que ela digira a enzima de eclosão.Adicione enzima de eclosão suficiente para cobrir os ovos lavados. Certifique-se de que os ovos permaneçam em uma única camada no fundo da placa para evitar esmagamento à medida que o Corian se dissolve. Incube os ovos a 27 graus Celsius.Certifique-se de posicionar a placa em um ângulo para que os embriões fiquem suficientemente imersos na enzima. A fim de minimizar a quantidade de enzima necessária, verifique o progresso ao microscópio estereoscópico de dissecação; orifícios semelhantes aparecerão na camada interna do Corion antes que ele se dissolva completamente. O processo pode levar até 60 minutos, dependendo da atividade da enzima.Quando uma pequena parte do córion for dissolvida, aspire imediatamente o ovo individual com uma pipeta para evitar a digestão do embrião pela enzima de eclosão. Transfira para um recipiente limpo contendo BSS uma vez, tocando suavemente a ponta da pipeta em um recipiente limpo com BSS uma vez e permitindo que o ovo role para fora, minimizando assim a transferência da enzima de eclosão. Use pinças para remover o restante do córion após todos os ovos terem sido transferidos da enzima de eclosão.Realize uma transferência final para um novo recipiente com BBSS uma vez. Adicione antibióticos se os embriões devem ser mantidos até um estágio posterior de desenvolvimento embrionário. Após a desovulação para este procedimento, inicie a desincubação de embriões no estágio 12, 1,5 hora antes do transplante. Use a ponteira de uma pipeta para adicionar uma pequena quantidade de metilcelulose a 3% ao centro de uma cavidade do microscópio.Deslize em uma placa de Petri de nove centímetros. Espalhe o líquido finamente sobre a superfície da depressão. Seque a metilcelulose por dois minutos.Preencha a depressão da lâmina com 350 microlitros de BSS estéril uma vez sob um microscópio estereoscópico. Use uma pipeta de vidro com boca larga e polida ao fogo para transferir um embrião doador e até quatro embriões receptores para a lâmina. Use um laço de cabelo para orientar os embriões de modo que a derme blástica fique voltada para cima.Incline os embriões uns contra os outros para estabilidade, se necessário. Insira suavemente uma micropipeta no blástula doador.Derm. Aspire lentamente 10 a 20 células.Agora, insira suavemente a agulha na área relevante da derme do embrião receptor e expulse lentamente as células doadoras. Não perturbe o limite do saco celômico. Encha cuidadosamente a placa de Petri com aproximadamente 30 mililitros de BSS estéril 1x para imergir os embriões e soltá-los da metilcelulose.Despeje ao longo da lateral da placa para não perturbar os embriões. Adicione 100 microlitros de penicilina-estreptomicina na placa para uma concentração aproximada de 0,3%. Tampe a placa. Observe os embriões periodicamente conforme necessário.Para estudos de microscopia mais longos, como imagens com lapso de tempo e observações detalhadas, incorpore embriões vivos revestidos em agarose e anestesie embriões vivos para evitar movimentos, adicionando um anestésico apropriado ao meio contendo os embriões. Derreta aproximadamente um mililitro de agarose a 3% com baixo ponto de fusão em BSS uma vez e mantenha-o a 37 graus Celsius. Se necessário, adicione uma quantidade apropriada de anestésico à agarose para evitar espasmos. Trabalhando rapidamente para evitar solidificação, use uma pipeta de boca larga para encher a cavidade de um tubo de microcentrífuga com agarose.Use uma pipeta de boca larga para transferir um embrião revestido e anestesiado para o aros na tampa. Transfira o mínimo possível de meio junto com o embrião. Atualize imediatamente o aros e o embrião e mova-os para uma placa de Petri de fundo de vidro de 3,5 centímetros.Transfira a placa para uma placa de 14 centímetros preenchida até um terço com uma mistura de gelo e água. Segure firmemente a placa menor contra o fundo da placa maior sob um microscópio estereoscópico de dissecação. Use um laço de cabelo para orientar rapidamente o embrião conforme desejado.Mantenha o embrião imóvel até que o agro se solidifique. O embrião pode agora ser visualizado. A imagem A mostra um embrião doador e um receptor imediatamente após o transplante.O embrião doador é mostrado à direita, com o derme do estilete completamente marcado em vermelho. O embrião receptor é mostrado à esquerda e é facilmente identificado pela pequena massa de células transplantadas vermelhas visível na imagem do derme do estilete. A figura B mostra dois embriões receptores aproximadamente sete horas após o transplante. Observe que as células transplantadas migraram do local do transplante e agora estão dispersas pelo estilete.A imagem dérmica C mostra um embrião receptor no estágio 29. Observe a pigmentação no olho e a presença de mefor na região do tronco e do cérebro. As células marcadas no domínio em bastonete podem ser vistas colonizando diversas estruturas embrionárias, indicando a produção bem-sucedida de uma quimera.Acabamos de mostrar como dissecar embriões de peixe meca e realizar o transplante celular em um estágio embrionário inicial. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de transplantar suas células doadoras na área correta do blastoderma do receptor. Isso permitirá que suas células doadoras se diferenciem no tipo celular correto.Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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Zebrafish transplante de células permite a combinação de genética e da embriologia para gerar quimeras tecidos específicos. Este vídeo demonstra gástrula encenado transplantes de células que têm permitido o nosso laboratório para investigar o papel das populações astroglial e pistas de orientação específica durante a formação da comissura no prosencéfalo.

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Demonstramos um protocolo para gerar embriões quiméricos zebrafish para o comportamento imagens ao vivo do celular durante a embriogênese.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Medaka e peixe-zebra são complementares para análise genética de funções genoma dos vertebrados. Este protocolo destaca os pontos chave para a microinjeção de sucesso em embriões medaka, uma técnica importante para a análise embriológica e genética utilizando medaka zebrafish e em um laboratório.

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Uma abordagem para análise da migração e destino final dos aviários células da crista neural em codornas de-bico embriões quiméricos é descrito. Este método é uma técnica simples e direta para rastrear células da crista neural durante a migração e diferenciação que são de outra maneira difícil distinguir dentro de um embrião de galinha não-manipulado.

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Pequenos peixes de laboratório tornaram-se modelos populares para pesquisa óssea sobre os mecanismos subjacentes aos distúrbios ósseos humanos e para a triagem de drogas moduladoras ósseas. Neste relato, descrevemos um protocolo para avaliar o efeito do alendronato em células ósseas em larvas de medaka com lesões osteoporóticas.

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acompanhamento ao vivo de células progenitoras da retina WT individuais em fundos genéticos distintos permite a avaliação da contribuição das células de sinalização não autónomo durante a neurogênese. Aqui, uma combinação de silenciamento de genes, através de transplante de geração quimera embrião e na imagiologia de lapso de tempo in vivo confocal foi utilizada para este propósito.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

Aqui nós apresentamos um protocolo para aumentar a produção da Quimera sem o uso de novos equipamentos. Uma mudança de orientação simples do embrião para injeção pode aumentar o número de embriões produzidos e potencialmente reduzir a linha do tempo de transmissão da linha germinal.

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Este objetivo deste protocolo é produzir axolotos quiméricos com membros dianteiros haploides derivados de tecido doador mutagenizado de Cas9 usando técnicas de enxerto de tecido embrionário.

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Manipulações embriológicas como extirpação e transplante de células são ferramentas importantes para estudar o desenvolvimento precoce. Este protocolo descreve um dispositivo de transplante simples e eficaz para realizar essas manipulações em embriões de zebrafish.

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Aprenda a dechorionar embriões de medaka e realizar transplante de células para gerar quimeras em estudos de biologia do desenvolvimento. Este método permite analisar a autonomia celular de genes e proteínas em vertebrados.

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

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