Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Devido ao córion duro e macio embriões, manipulação de embriões medaka está mais envolvido do que em zebrafish. Este vídeo mostra passo-a-passo os procedimentos de como manipular embriões medaka, incluindo dechorionation, montagem em agarose para a imagem latente e transplante de células para a produção de quimeras. Estes procedimentos são essenciais para a utilização medaka zebrafish e em um laboratório para tirar o máximo proveito de seus recursos complementares para a análise genética de funções genoma dos vertebrados.

O objetivo geral deste procedimento é produzir clones em um embrião com o objetivo de examinar a autonomia de um gene ou proteína de interesse. Isso é feito marcando embriões de doadores com dextrano Rod Domine por microinjeção no estágio de uma célula, conforme mostrado no acompanhamento deste vídeo, microinjeção de embriões Maka. A segunda etapa do procedimento é desenvolver os embriões do doador e do receptor até o estágio correto.

A terceira etapa do procedimento é revestir os embriões do doador e do receptor. A etapa final do procedimento é transplantar células dos embriões de doadores marcados para os embriões do receptor. Em última análise, os resultados podem ser obtidos analisando a distribuição, proliferação e diferenciação de clones, de células transplantadas através da detecção de células transplantadas por seus traçadores de fluorescência ou linhagem.

Olá, sou Sean Brazinski, do laboratório do Dr. Makoto Fki no Departamento de Biologia e Bioquímica da Universidade de Bath. Eu também sou wan do laboratório Zeki. Hoje vamos mostrar um procedimento para transplante de células em embriões de peixes escuros.

Usamos este procedimento em nosso laboratório para estudar com um gene ou mutação de interesse, tem uma função autônoma celular ou não celular. Então vamos começar. Ao revestir os ovos de maka, use soluções e ferramentas estéreis para aumentar o sucesso da observação e cultura de longo prazo.

Coloque um pedaço de lixa impermeável de grão P 2000 na tampa de uma placa de Petri não aderente de nove centímetros. Use uma boca larga para disparar a pipeta de macarrão polido para transferir até 10 ovos recém-desagrupados, limpos e rotulados de um prato de ovo. Médio para a lixa.

Retire o excesso de meio, deixando apenas o suficiente no prato para evitar que os ovos sequem. Use a ponta do dedo enluvada para rolar suavemente 10 ovos de cada vez sobre a lixa por 45 a 60 segundos. Para remover os pelos da superfície externa e marcar a superfície do Corian, aplique pressão mínima e mantenha a ponta do dedo paralela à lixa.

Transfira os ovos para o prato original do meio. Retire o meio, cubra os ovos com uma solução de 20 miligramas por mililitro de prona. Cubra o prato e incube a 27 graus Celsius por 60 minutos.

Certifique-se de colocar o prato em um ângulo para que os embriões fiquem suficientemente imersos em enzima. Para minimizar a enzima necessária, use uma pipeta de transferência de plástico para recuperar a pronase para reutilização e coloque-a no gelo. Lave os ovos cinco vezes por meio embrionário para remover todos os vestígios de propensão para evitar que ele digere a enzima de eclosão.

Adicione enzima de incubação suficiente para cobrir os ovos lavados. Certifique-se de que os ovos permaneçam em uma única camada no fundo do prato para evitar esmagamento à medida que o Corian se dissolve. Incube os ovos a 27 graus Celsius.

Certifique-se de colocar o prato em um ângulo para que os embriões fiquem suficientemente imersos em enzima. A fim de minimizar o progresso da verificação necessária da enzima sob um microscópio estéreo de dissecação, crie-se que orifícios semelhantes aparecerão na camada interna do Corian antes que ele se dissolva completamente. O processo pode levar até 60 minutos, dependendo da atividade enzimática.

Quando uma pequena parte do Corian estiver dissolvida, aspire imediatamente o ovo individual com uma pipeta para evitar a digestão do embrião pela enzima de eclosão. Transfira para um prato limpo de uma vez BSS tocando suavemente a ponta da pipeta em um prato limpo de uma vez BSS e deixando o ovo rolar para minimizar a transferência da enzima de eclosão. Use uma pinça para remover o resto do Corian quando todos os ovos tiverem sido transferidos da enzima de eclosão.

Faça uma transferência final para um novo prato de um vezes BBSS. Adicione antibióticos se os embriões forem levados a um estágio posterior de desenvolvimento embrionário Após a decoração para este procedimento, comece a revestir os embriões do estágio 12 1,5 horas antes do transplante. Use uma ponta de pipeta para adicionar uma pequena quantidade de 3% de metilcelulose ao centro de um microscópio de cavidade.

Deslize em uma placa de Petri de nove centímetros. Espalhe o líquido sobre a superfície da depressão. Seque a metilcelulose por dois minutos.

Encha a depressão da lâmina com 350 microlitros de BSS estéril uma vez sob um microscópio de dissecação. Use uma pipeta de vidro polido de boca larga para transferir um doador e até quatro embriões receptores para a lâmina. Use um laço de cabelo para orientar os embriões de modo que a derme blaster fique voltada para cima.

Incline os embriões uns contra os outros para estabilidade, se necessário. Insira suavemente uma microagulha no blaster doador. Derme. Absorva lentamente 10 a 20 células.

Agora insira suavemente a agulha na área relevante do receptor do derme blaster do embrião e expulse lentamente as células doadoras. Não perturbe o limite do saco de violoncelo. Encha cuidadosamente a placa de Petri com aproximadamente 30 mililitros de BSS estéril uma vez para imergir os embriões e soltá-los da metilcelulose.

Despeje contra a lateral do prato para não atrapalhar os embriões. Adicione 100 microlitros de penicilina estreptomicina no prato para uma concentração aproximada de 0,3%Cubra o prato. Observe os embriões periodicamente, conforme necessário.

Para estudos de imagem mais longos, como lapso de tempo e observações detalhadas, incorpore embriões vivos revestidos em aros anestesiar embriões vivos para evitar o movimento, adicionando um anestésico apropriado ao meio que contém os embriões derreter aproximadamente um mililitro de 3%Baixo ponto de fusão surgiu em um BSS de uma vez e mantê-lo a 37 graus Celsius. Se necessário, adicione uma quantidade adequada de anestésico ao aros para evitar espasmos trabalhando rapidamente para evitar a solidificação, use uma pipeta de macarrão de boca larga para encher a tampa. Depressão de um tubo de microcentrífuga com aros.

Use uma pipeta de boca larga para mover um embrião revestido e anestesiado para o aros na tampa. Transfira o mínimo de meio possível com o embrião. Atualize imediatamente o aros e o embrião e mova-os para uma placa de Petri com fundo de vidro de 3,5 centímetros.

Transfira o prato para um prato de 14 centímetros cheio de um terço do caminho com uma mistura de gelo e água. Segure o prato menor firmemente no fundo do prato maior sob um microscópio estéreo de dissecação. Use um laço de cabelo para orientar rapidamente o embrião conforme desejado.

Segure o embrião imóvel até que o agro solidifique. O embrião agora pode ser visualizado. A imagem A mostra um embrião de doador e receptor imediatamente após o transplante.

O embrião doador é mostrado à direita com uma derme de gesso completamente vermelha. O embrião receptor é mostrado à esquerda e é facilmente identificado pela pequena massa de células vermelhas transplantadas visível na imagem do derme blaster B mostra dois embriões receptores aproximadamente sete horas após o transplante. Observe que as células transplantadas migraram do local do transplante e agora estão dispersas pelo blaster.

A imagem dermatológica C mostra o embrião de um receptor no estágio 29. Observe a pigmentação no olho e a presença de mefor no tronco e na região do cérebro. As células marcadas com domina de bastonete podem ser vistas colonizando muitas das estruturas embrionárias, indicando a produção bem-sucedida de uma quimera.

Acabamos de mostrar como comer embriões de peixes meca e realizá-los transplante de células em um estágio embrionário inicial. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de transplantar as células do doador para a área correta do receptor explodido. Isso permitirá que as células do doador se diferenciem no tipo de célula correto.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.