Name: Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a gerar vírus Influenza recombinante a partir de DNA plasmidial usando transfecção em células 293T e MDCK. Este método viabiliza estudos de virologia e desenvolvimento de vacinas.

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Os autores querem agradecer aos membros do passado e presente na Adolfo García-Sastre e Peter Palese laboratórios para o desenvolvimento de técnicas de genética e reverter influenza plasmídeos. Pesquisa em laboratórios AG-S é parcialmente financiado pelo CRIP, um Centro de NIAID-financiado de Excelência para Pesquisa e Vigilância da Influenza (HHSN266200700010C) e por doações NIAD R01AI046954, U01AI070469 e P01AI058113. Pesquisa em LM-S laboratório é parcialmente financiado pelo NIAID conceder RO1AI077719.

1. Influenza transfecção de resgate de vírus Vírus influenza A pertence à família Orthomyxoviridae de vírus de RNA de fita negativa envolvido. A influenza A genoma do vírus é composto por oito genes diferentes de RNA de polaridade negativa que codificam, pelo menos, 11 proteínas virais (Figura 1) 4. Vamos nos concentrar, neste relatório, sobre o resgate de um dos cepa de laboratório mais comum, a influenza A/PR/8/34, 5 usando plasmídeos ambisense (PDZ), contendo os 8 influenza A/PR/8/34 segmentos viral ( Figura 2). Para o resgate de vírus de influenza recombinante de DNA plasmídeo, recomendamos 3 transfections independentes por cada vírus recombinante. Se mais de um resgate vírus recombinante é tentada, escala os seguintes passos accordantly ao número de vírus para ser resgatado. A transfecção seguinte e protocolo de infecção é estabelecida para 6-bem-pratos. Uma representação esquemática do protocolo é ilustrada na Figura 3. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mistura: Prepare 250 L de mídia OptiMEM e 6-8 mL de LPF2000 por transfecção. Incubar por 5-10 minutos em temperatura ambiente (RT). Enquanto isso, prepare a mistura de transfecção do plasmídeo. </li><li> Mistura de transfecção do plasmídeo: Prepare o coquetel de transfecção do plasmídeo em 50 ul de mídia OptiMEM. Nós usamos geralmente 1 mg de cada DNA influenza plasmídeo por socorro. Adicionar 1 ml de os plasmídeos PDZ (a 1 mg / mL) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M e NS para um tubo contendo 50 mL dos meios de comunicação OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA plasmídeo mistura: Adicionar 250 L a partir do passo 1,1 na mistura de transfecção influenza DNA plasmídeo (passo 1.2). Incubar a mistura por 20-30 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, preparar suspensões de células MDCK 293T e de transfecção. </li><li> Preparação de 293T/MDCK co-cultura: Antes de começar, trazer a 1X PBS, DMEM 10% FBS 1% PS mídia e EDTA-tripsina mistura a 37 ° C. A densidade das células deve ser a confluência de 80-90% no dia da transfecção. Geralmente, um prato milímetros confluentes 100 de 293T e um prato milímetros confluentes 100 de células MDCK pode ser usado por 10-12 resgates. Nós vamos usar 250 L de células por poço. Ambas as linhas de células será ressuspenso em um total de 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1%. <ul><li> Ressuspender cuidadosamente cada linha de células em 10 ml de DMEM 10% FBS PS 1% em um tubo de centrifugação de 15 ml. Você terá um tubo de células 293T e um tubo de células MDCK. </li><li> Ressuspender as células 293T em 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1% e quando ressuspenso, entregar a 3 ml para as células MDCK para ressuspender as células. Isto lhe dará a mistura de células MDCK 293T e para ser usado para o seu co-cultura. </li><li> Adicionar 250 mL das células 293T/MDCK por poço (10-12 junho bem-poços). </li></ul></li><li> Após 20-30 minutos de incubação RT (passo 1.3), adicionar 1 ml de DMEM 10% FBS PS 1% para a mistura de DNA OptiMEM-LPF2000-influenza plasmídeo. </li><li> Adicione o ml 1.3 (passo 1.5) para os poços com a 250 mL de células 293T/MDCK (passo 1.4). </li><li> Agite suavemente o 6-bem-placa e deixar a incubar transfecção overnight (ON) na incubadora a 37 ° CO C e 5% 2. </li><li> No dia seguinte, cerca de 16-24 horas após a transfecção, alterar a mídia de transfecção e incubar as células transfectadas em DMEM BA 0,3% a 1% PS contendo 1 mg / ml de TPCK-tripsina por 48 horas. </li><li> Após 48 horas de mudar a mídia, transferir o sobrenadante das células transfectadas em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar o sobrenadante de cultura de tecidos em microcentrífuga por 1-2 minutos, 13.000 rpm. </li><li> Infectar novas células MDCK em 6 bem-placas (banhado no dia anterior) ou ovos de 10 dias de idade embrionados de galinha com 200 mL do sobrenadante centrifugado cultura de tecidos a partir do passo 1.10. Incubar as células e / ou ovos a 37 ° C por 2-3 dias. <ol><li> Infecção de ovos de 10 dias de idade embrionados de galinha: Todos os procedimentos para infectar os ovos de galinha embrionados são realizados em condições estéreis. <ol><li> Vela os ovos de 10 dias de idade, usando uma caixa de luz candling para ver a interface entre o saco de ar e na cavidade alantóide. Faça uma marca de lápis na fronteira interface. </li><li> Com uma agulha de seringa de 5 ml fazer um buraco na casca de ovo. </li><li> Com uma seringa de 1 ml, infectar cada ovo com 200 mL do sobrenadante de cultura de tecidos a partir do passo 1.10. </li><li> Cobrir o buraco na casca de ovo com cera derretida usando um cotonete. </li><li> Incubar os ovos infectados em 37οC por 2-3 dias. </li></ol></li><li> Infecção de novas células MDCK: O dia antes da passagem do sobrenadante de cultura de tecidos a partir da 293T/MDCK co-culturas, prépare de 6 pratos bem placa com células MDCK para alcançar confluência de 80-90% no dia seguinte. Geralmente, um confluentes 100 milímetros placa de cultura de tecidos pode ser dividida em 6-8 poços. Lavar as células, duas vezes, com PBS 1X, trypsinize e preparar as placas de 6 poços. Agite suavemente com a mão as placas, a fim de ter uma distribuição uniforme das células. Cultura das células, ON, na 37 ° C incubadora, 5% CO 2. Antes da infecção, verifique as células ao microscópio para confirmar uma monocamada, então, prosseguir com a infecção: <ul><li> Lave as células, duas vezes, com 1 ml de PBS 1X. </li><li> Infectar com o 200 mL do sobrenadante da cultura de tecidos centrifugada por 1 hora em temperatura ambiente. Não deixe que as células secas. Rock the 6-bem-placa a cada 10 minutos. </li><li> Após uma hora de absorção viral, remova a mídia infecção das células MDCK e adicionar 2 ml de DMEM BA 0,3% a 1% PS contendo 1 mg / ml de TPCK-tripsina. </li><li> Em 48-72 horas após a passagem, dependendo da eficiência de transfecção e da carga de vírus, um efeito citopático (CPE) será observado nas células MDCK infectados. CPE sugere um resgate bem sucedido. No entanto, um ensaio HA (seção 2) deve ainda ser realizados para confirmar a presença do vírus no sobrenadante de cultura de tecidos. </li></ul></li></ol></li><li> Colheita de fluido alantóide de ovos embrionados de galinha infectados: Todos os procedimentos para colher o fluido alantóide de ovos infectados são realizados em condições estéreis. Cerca de 8-12 ml de líquido alantóico podem ser colhidos de cada ovo de 10 dias de idade infectadas. Antes da colheita do líquido alantóico, incubar os ovos de galinha para 2 horas (ou ON) a 4 ° C para matar o embrião de galinha e coagular o sangue. <ul><li> Lavar os ovos com etanol 70% para estabelecer condições estéreis. </li><li> Abra o ovo, com cuidado, sobre a cavidade do ar batendo com uma colher. Remova a casca quebrada com a ajuda de fórceps. </li><li> Com uma agulha de 1 ml, retire a membrana alantóide, sem quebrar a gema do ovo. </li><li> Estabilizar o embrião de galinha com uma espátula como você guia uma pipeta de 10 ml para o líquido alantóide. Recolher o líquido alantóico tanto quanto possível, em um tubo de centrífuga de 15 ml de gelo em um balde de gelo sem quebrar ou recolher qualquer gema do ovo. Use um tubo de centrifugação de 15 ml para cada ovo. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 4 ° C e transferir o líquido alantóico (sem ter peletizada células vermelhas do sangue) para um novo 15 tubos de centrífuga ml. </li><li> Armazenar os tubos contendo o líquido alantóide centrifugadas a 4 ° C até que eles são verificados para a presença do vírus resgatado com um ensaio de hemaglutinação (HA). </li></ul></li></ol> 2. HA ensaio para confirmar o resgate de vírus influenza recombinantes Ensaio de hemaglutinação (HA) é rotineiramente usado para detectar a presença do vírus resgatados em sobrenadantes tecido MDCK cultura e / ou o fluido alantóide de ovos colhidos. Alternativamente, imunofluorescência (IFA) também pode ser realizada. Uma vez um ensaio identifica a presença do vírus resgatado, o vírus deve ser purificado e placa a composição genética do vírus será confirmada por RT-PCR e seqüenciamento. A presença do vírus no tecido MDCK sobrenadantes de cultura e / ou no fluido alantóide de ovos infectados pode ser determinada macroscopicamente usando HA de frango (ou outra fonte) glóbulos vermelhos (RBC). A presença do vírus induz a hemaglutinação da RBC, enquanto a ausência de vírus permite a formação de uma pelota vermelha no fundo do poço (Figura 4). No caso do vírus da gripe, acredita-se que cerca de 10 3 -10 4 unidades formadoras de placa (UFP) são obrigados a dar um sinal positivo no teste de HA e, portanto, um IFA pode ser realizada em paralelo com o ensaio de HA para confirmar um resultado verdadeiro negativo. IFA com primário anti-influenza anticorpos é mais sensível que o ensaio HA porque menos de 103-104 vírus podem ser detectados com esta técnica. É possível que sobrenadantes ou líquidos alantóide que são HA-negativos são positivos pelo IFA. Neste caso, o vírus deve ser amplificada por passaging, novamente, em células MDCK ou em ovos. Líquido alantóico e / ou sobrenadantes de cultura de tecidos a partir da segunda passagem deve agora ser claramente positivo no ensaio HA. HA ensaios são realizados em placas de 96 poços V-bottom. Negativo (por exemplo, PBS 1X) e positivo (sobrenadante de cultura de tecidos e / ou líquido alantóico de uma infecção pelo vírus influenza) amostras de controle deve sempre ser incluídos em qualquer ensaio de HA para validá-lo. <ul><li> Dispensar 50 ul de PBS 1X em cada poço da V bottom-96 poços da placa. </li><li> Adicionar 50 ul deos sobrenadantes tecido MDCK cultura e / ou líquido alantóico dos ovos infectados para o primeiro poço e, fazer 2 diluições de série para os poços seguinte. Descartar a 50 mL extra do bem passado. </li><li> Adicionar 50 ul de 0,5% -1,0% frango células vermelhas do sangue (preparado em PBS 1X) a cada poço. </li><li> Incubar a V-bottom 96 poços da placa por 30-45 minutos (até um ponto vermelho é visível na parte inferior de uma amostra de controlo negativo PBS) no gelo. Ler e interpretar os resultados, conforme indicado na Figura 4. </li></ul> 3. Passagem de sobrenadantes de cultura de tecidos Um resultado negativo no ensaio de HA pode ser um resultado da eficiência de transfecção baixa com baixos níveis de vírus presente estar no sobrenadantes de cultura de tecidos e / ou líquido alantóico. Passagem destas amostras em ovos frescos MDCK e / ou embrionados permitirá a amplificação do vírus (como indicado na Figura 3) As infecções são realizados conforme descrito anteriormente na seção 1.11.2. 4. Resultados representante Resgate de vírus influenza sucesso será confirmada pela presença de um ensaio de HA positivo (Figura 4). Além disso, a existência de CPE em células infectadas com o sobrenadante de cultura de tecido ou com o fluido alantóide de ovos irá sugerir um resgate positivo viral. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Influenza estrutura Virus: vírus Influenza é cercada por uma bicamada lipídica que contém as duas glicoproteínas viral (HA, NA) e, também, a proteína canal iônico, M2. HA é a proteína viral anexo, responsável pela ligação com ácido siálico contendo receptores. NA é responsável pela libertação viral a partir de células hospedeiras. Debaixo da bicamada lipídica, é uma camada de proteína composta pelo interior de proteínas da matriz superfície do envelope 1, M1, que desempenha um papel no virion montagem e brotamento ea proteína nuclear de exportação (NEP), exigido para a exportação nuclear da ribonucleocapsids viral. O núcleo do vírus é feita de um complexo ribonucleoproteína (RNP), composto de 8 de single-stranded RNA viral negativa genes encapsidated pela nucleoproteína viral, NP. Associadas com o complexo RNP são as viral RNA polimerase dependente de RNA subunidades PA, PB1, PB2 e. As proteínas não estruturais NS1 e PB1-F2, codificada pelos segmentos de RNA NS e PB1, respectivamente, não são parte da estrutura do virion. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Plasmídeos de resgate de vírus influenza: A oito genes da influenza vírus clonados no PDZ ambisense plasmídeo são indicados. PDZ plasmídeo 6, derivado da expressão da proteína plasmídeo pCAGGs 7, é um vetor plasmídeo bidirecional com uma RNA polimerase humana Eu promotor e um rato uma sequência de terminador que codifica o RNA genômico sentido negativo, em orientação oposta à polimerase I unir, uma polimerase II cassete de transcrição (promotor de frango β-actina e poli) codifica as proteínas virais do mesmo gene viral. cDNAs de cada segmento viral são gerados por RT-PCR com primers frente e verso contendo o Sapi site de endonuclease de restrição e as regiões não-codificadoras de cada segmento (caixas-pretas no final dos genes virais). O produto da PCR é clonado no PDZ digerido com Sap-I. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Oito plasmídeo baseado em sistema de resgate influenza: PDZ plasmídeos contendo os genes 8 influenza viral são co-transfectadas, em suspensão, em 293T-MDCK células co-culturas (dia 1). Vinte e quatro horas após a transfecção, mídia sem FBS, mas contendo TPCK / tripsina é substituído (dia 2). Quarenta e oito horas após mudar a mídia, o sobrenadante de cultura de tecidos é colhida e utilizada para infectar células MDCK ou 10 dias de idade, ovos de galinha embrionados (dia 4). 48-72 horas pós-amplificação, sobrenadantes de cultura de tecidos de células infectadas ou MDCK líquido alantóico de ovos são colhidas e analisadas para a presença do vírus por HA (dia 6). Se nenhum vírus é detectado, os sobrenadantes mesmo e / ou líquidos alantóico podem ser re-frescos várias passagens em células MDCK e / ou ovos embrionados. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Hemaglutinina ensaio (HA): Hemaglutinação da RBC por partícula do vírus é visível macroscopicamente e é a base para detectar partículas virais em sobrenadante de cultura de tecidos e / ou líquidos alantóide. Embora o ensaio de HA não discrimina entre as partículas virais que são infecciosas e partículas que estão degradadas e não é capaz de infectar as células, o ensaio é um bom indicador da presença de vírus em amostras. A) Ausência (parte superior) da presença (em baixo) do vírus nas amostras biológicas é determinado pela presença de glóbulos vermelhos no fundo do prato ou a sua ausência, respectively. B) Um resultado representante de um ensaio HA sem níveis detectáveis ​​de vírus (superior) ou presença (parte inferior) do vírus é mostrado.

<ol><li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li>
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<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
</ol>

Mount Sinai School of Medicine tem direitos de propriedade intelectual na área de vírus influenza recombinante, e AG-S é um inventor nesta propriedade intelectual.

Resgate de vírus influenza recombinante de DNA plasmídeo é um processo simples e direta uma vez que o protocolo é realizada rotineiramente no laboratório, mas no início, várias coisas podem dar errado. É imperativo ter boa preparação plasmídeo para gerar o vírus. Manutenção adequada das linhas celulares (293T e MDCK) é crucial para um resgate bem sucedido viral. Tradicionalmente, uma marca genética é inserido em um gene que codifica a gripe-plasmídeo, por mutagênese em silêncio. Introdução desta mutação silenciosa (s) e...

Linhagens de células 293T (número de catálogo CRL-11268) e MDCK (número de catálogo CCL-34) linhas celulares são mantidos em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2 em DMEM 10% FBS, PS 1%. Células são formulário disponível a Coleção American Type Culture (ATCC, 10.801 University Boulevard Manassas, VA. 20110-2209 EUA). Ovos de galinha embrionados Embrionados ovos de 10 dias de idade de frango pode ser obtido a partir de Charles River Laboratories, Abastecimento aviária Specific Pathogen Fee (SPAFAS) Produtos e Serviços aviária. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 EUA. Os ovos são incubados a 37 ° C antes e após a infecção viral. Antes e após a infecção viral, os ovos são candled para determinar a viabilidade dos embriões. É muito importante olhar para os ovos mortos antes e após a infecção viral. Antes da infecção um ovo de mortos pode ser facilmente localizados pela ausência de vasos sanguíneos, bem como a ausência de mobilidade do embrião. Quando candled, embriões vivos movimento. Após a infecção viral um ovo morto (provavelmente relacionado à infecção pelo vírus influenza) vai ser facilmente localizados pela aparência ruim do ovo como visto pelo volume menor e mais sangrenta de líquido alantóico. Infectados de ovos são descartadas em dois sacos autoclaváveis ​​e autoclavada seguintes procedimentos padrão. Células vermelhas do sangue de galinha (RBC) Chicken RBC pode ser comprado de Fazendas Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21.620. Armazenar a 4 ° C. Para ensaios de HA, lavar 5 ml da RBC frango com 45 ml de PBS 1X em um tubo de centrífuga de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpms, RT. Descartar cuidadosamente o sobrenadante e use uma diluição 1:1000 da RBC peletizada em PBS 1X (concentração final de RBC 0,5-1,0%). Sobrenadantes de cultura de tecidos e fluidos alantóide Ambos, sobrenadantes de cultura de tecidos e fluidos alantóico podem ser armazenados a 4 ° C por um curto período de tempo. Após a confirmação de resgate de vírus, vírus de sobrenadantes de células ou líquido alantóico são armazenadas a -80 ° C. Plasmídeos Todos os plasmídeos são preparadas usando um plasmídeo recomendações maxi fabricante seguinte kit. Todos os plasmídeos são alíquota em concentrações de 1 mg / ml em DDH 2 O e armazenadas a -20 ° C. De curto prazo de armazenamento, o plasmídeo pode ser manter a 4 ° C. A concentração do DNA purificado plasmídeo é determinado por espectrofotometria a 260 nm, com pureza de ser estimada utilizando a proporção nm 260:280. Preparações com 1,8-2,0 nm 260:280 índices são considerados apropriados para fins de resgate de vírus. Além disso, concentração e pureza plasmídeo devem ser confirmados com agarose gel cromatografia. Ambisense PDZ plasmídeos (6) contendo os oito genes da influenza A/PR/8/34 viral (7) são ilustrados na Figura 2. Vírus O protocolo descrito de emergência da gripe A/PR/8/34 pode ser realizada sob nível de biossegurança (BSL) 2 condições. Material contaminado, incluindo sobrenadantes de cultura de tecidos e ovos embrionados, devem ser esterilizados antes da eliminação. Resgate de vírus da gripe pode exigir outras condições BSL maior e, portanto, condições especiais / medidas de segurança terão de ser seguidas. Tecido meios de cultura e soluções DMEM 10% FBS PS 1%: 445 ml meio modificado Dulbecco Águia (DMEM), 50 ml de soro fetal bovino (FBS), e 5 ml de 100X Penicilina / Estreptomicina (PS). Armazenar a 4 ° C. Essa mídia será usada para manter as células MDCK e 293T, bem como para a transfections. DMEM BA 0,3% a 1% PS: 495,7 ml de DMEM, 4,3 ml de 35% de albumina bovina (BA). Armazenar a 4 ° C. Pouco antes de usar, adicione TPCK tripsina tratada para uma concentração final de 1 mg / ml. Media infecciosas. Fosfato 10X solução salina tamponada (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g de KH 2 PO 4. Adicionar DDH 2 O até 1 litro. Ajustar o pH para 7,3. Esterilizar em autoclave. Conservar à temperatura ambiente. 1X PBS: Diluir 1:10 com PBS 10X DDH 2 O. Esterilizar em autoclave e armazenar em temperatura ambiente.

geração de recombinante do vírus influenza de dna plasmidial

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Esforços por um número de grupos de pesquisa da gripe têm sido fundamental no desenvolvimento e melhoria da influenza A genética reversa do vírus. Originalmente estabelecida em 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plasmídeo baseado em técnicas de genética reversa para gerar vírus recombinante revolucionaram o campo de pesquisa da gripe, porque determinadas questões foram respondidas por engenharia genética, infecciosa, vírus da influenza recombinante. Esses estudos incluem a replicação do vírus, a função de proteínas virais, a contribuição de mutações específicas em proteínas virais na replicação viral e / ou patogênese e, também, vetores virais usando vírus influenza recombinantes expressando proteínas estranhas<sup&gt; 3</sup&gt;.

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Os esforços de diversos grupos de pesquisa sobre influenza foram fundamentais para o desenvolvimento e o aprimoramento da genética reversa do vírus influenza A. Originalmente...

O objetivo geral do seguinte experimento é gerar vírus influenza recombinante a partir de DNA plasmidial. Isso é alcançado transfectando os oito plasmídeos de DNA que codificam os genes do influenza em uma co-cultura de células 293T e MDCK, utilizando Lipofectamine 2000 como segundo passo. O sobrenadante de cultura de tecidos será usado para infectar células MDCK frescas e/ou ovos embrionados de galinha com 10 dias de idade, os quais amplificarão o vírus presente no sobrenadante das células transfectadas.A seguir, coletaremos os sobrenadantes das culturas de tecidos e o fluido de Alan Toic de ovos embrionados de galinha infectados. Para confirmar a presença do vírus utilizando um ensaio de HA, são obtidos resultados que indicam a presença do vírus com base na presença de aglutinação. Olá, sou Luis Martinez Rito do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade de Rochester.Hoje vou mostrar como resgatar vírus recombinantes da gripe a partir de DNA plasmidial. Utilizamos essa técnica em nosso laboratório para estudar múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe e para desenvolver vetores e vacinas potenciais. Então, vamos começar.Antes de iniciar a transfeção, aqueça os reagentes de cultura celular a 37 graus Celsius, bem como solução salina tamponada com fosfato, P-B-S-E-D-T-A, tripsina e meio de Eagle modificado por KO, DMEM, contendo 10% de soro bovino fetal, FBS, e 1% de penicilina-estreptomicina, PS. Em seguida, prepare 250 microlitros de meio opti-MEM e de seis a oito microlitros de LPF 2000 por transfeção e incube à temperatura ambiente por cinco a 10 minutos. Prepare a mistura de transfeção de plasmídeo adicionando um micrograma de DNA plasmidial a um tubo com 50 microlitros de meio opti-MEM. Adicione um micrograma de cada um dos oito plasmídeos PDZ contendo segmentos virais.PB dois PB um pa ha np na m e N MS. Adicione 250 microlitros de Opti-MEM com PF-2000 à temperatura ambiente à mistura de transfeção de plasmídeo de DNA da influenza e incube por 20 a 30 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare suspensões de células 293T e MDCK para transfeção. A densidade das células 293T e MDCK deve estar entre 80 e 90% de confluência.No dia da transfeção, cerca de cinco vezes 10 elevado a seis células por placa de 100 milímetros, lave as células, desprenda-as e centrifugue utilizando técnicas padrão de cultura celular. RESSUSPENDE as células 293T em três mililitros de D-M-E-M-F-B-S-P-S. Quando as células estiverem ressuspendidas, adicione os três mililitros às células MDCK para ressuspensão.Isso criará a mistura de células 293T e MDCK a ser usada como co-cultura. Adicione 250 mililitros das células 293T-MDCK por poço em uma placa de seis poços. Após 20 a 30 minutos, adicione um mililitro de DMEM com 10% de FBS e 1% de PS a cada uma das misturas de plasmídeo de DNA de influenza opti M-E-M-L-P-F 2000.Em seguida, adicione às poças as 250 mililitros de células 293T-MDCK. Agite suavemente a placa de seis poços e deixe a transfeção incubar durante a noite no incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, 16 a 24 horas após a transfeção, troque o meio de transfeção e incube as células transfectadas em DMEM contendo 0,3% de albumina bovina ou BA e 1% de PS, acrescido de um micrograma por mililitro de tripsina tratada com L-tosilamido-2-feniletilcloreto de metila ou TPCK, por 48 horas.Se desejar infecção de MDCK, plaque células MDCK frescas um dia antes da infecção ou dois dias após a transfeção viral inicial; então, 48 horas após a troca do meio, transfira o sobrenadante SUP das células transfectadas para um tubo de microcentrífuga e centrifugue. Centrifugue o sobrenadante de cultura tecidual em uma microcentrífuga por um a dois minutos a 13.000 RPMs antes da infecção das células MDCK. Verifique as células ao microscópio para confirmar uma monocamada e, em seguida, prossiga com a infecção: lave as células duas vezes com um mililitro de PBS uma vez.Adicione 200 microlitros de sobrenadantes de cultura de tecidos centrifugados das etapas anteriores e incube por uma hora à temperatura ambiente. Agite a placa a cada 10 minutos para evitar o ressecamento das células após uma hora de absorção viral. Remova o meio de infecção das células MDCK e adicione dois mililitros de DMEM com 0,3% de BA e 1% de PS contendo um micrograma por mililitro de tripsina TPCK.Um efeito citopático será observado nas células MDCK infectadas entre 48 e 72 horas após a passagem. Dependendo da eficiência de transfeção e da carga viral, os efeitos citopáticos consistem no arredondamento celular, morte e desprendimento da superfície, entre outros. Em seguida, isole o snat das células MDCK para o ensaio, a fim de confirmar a presença do vírus na cultura tecidual.Microcentrifugue os sobrenadantes por um a dois minutos a 13.000 RPMs para remover detritos celulares e transfira para um novo tubo de centrífuga para infectar ovos embrionados de galinha. Ilumine os ovos de 10 dias de idade usando uma caixa de candelação com luz para visualizar a interface entre o saco de ar e a cavidade alantoide. Faça uma marca com lápis na borda da interface usando uma agulha de seringa de cinco mililitros.Faça um orifício na casca do ovo com uma seringa de um mililitro. Infete cada ovo com 200 microlitros dos sobrenadantes de cultura de tecidos obtidos anteriormente. Cubra o orifício na casca do ovo com cera derretida usando um cotonete.Incube os ovos infectados a 37 graus Celsius por dois a três dias antes de colher o fluido de Alan Toic. Incube os ovos de galinha por duas horas ou durante a noite a quatro graus Celsius para matar o embrião de galinha e coagular o sangue após esse período. Lave as cascas dos ovos com etanol 70% para estabelecer condições estéreis.Abra o ovo cuidadosamente sobre a câmara de ar batendo com uma colher. Remova as cascas quebradas usando pinça com agulha de um mililitro. Remova a membrana alantoide sem romper a gema do ovo.Estabilize o embrião de galinha com uma espátula e guie uma pipeta de 10 mililitros até o líquido alantoico. Colete o máximo possível de líquido alantoico. De oito a 12 mililitros em um tubo cônico de 15 mililitros sobre gelo para cada ovo.Não quebre nem colete nenhuma gema de ovo. Centrifugue por cinco minutos a quatro graus Celsius e transfira o fluido Alan Toic para tubos c&ocirc;nicos frescos de 15 mililitros sobre gelo. Mantenha os tubos contendo o fluido Alan Toic a quatro graus Celsius at&eacute; que sejam verificados quanto &agrave; presen&ccedil;a de v&iacute;rus resgatado com um ensaio de HA. O ensaio de HA &eacute; realizado usando placas VBO de 96 po&ccedil;os, controles negativos com PBS um X e controles positivos de cultura de tecidos.Supine e/ou fluido de Alan Toic. O fluido proveniente de infecção por vírus influenza não-responsivo deve sempre ser incluído no ensaio NAHA. Distribua 50 microlitros de PBS 1X em cada poço de uma placa de fundo em V de 96 poços, adicione 50 microlitros dos sobrenadantes de cultura tecidual de MDCK e/ou fluido de Alan Toic proveniente de ovos infectados ao primeiro poço e realize diluições seriadas de duas vezes para os poços seguintes.Descarte os 50 microlitros extras do último poço. Adicione 50 microlitros de 0,5 a 1% de hemácias de frango a cada poço e incube a placa de fundo V de 96 poços por 30 a 45 minutos no gelo ou até que um ponto vermelho seja visível no fundo da amostra do controle negativo com PBS. A presença de vírus nos sobrenadantes de cultura tecidual MDCK e/ou no fluido alantoico de ovos infectados pode ser determinada macroscopicamente utilizando hemaglutinação com hemácias de frango.A presença do vírus induz a hemaglutinação, enquanto a ausência do vírus permite a formação de um pellet vermelho no fundo do poço. Além disso, a ocorrência de CPE, como arredondamento celular, morte e destacamento das células da superfície, entre outros, em células infectadas com sobrenadantes de cultura tecidual ou com fluido alantoico de ovos, sugerirá um resgate viral positivo. No caso do vírus da influenza, aproximadamente de 10³ a 10⁴ unidades formadoras de placa, ou pfu, são necessárias para gerar um sinal positivo no ensaio de HA. Portanto, um ensaio de imunofluorescência pode ser realizado em paralelo com o ensaio de HA para confirmar um resultado verdadeiramente negativo.Como a presença de partículas virais individuais pode ser detectada por meio da coloração de células infectadas com anticorpos marcados com fluorescência, é possível que sobrenadantes HA negativos ou fluidos Alan Toic sejam positivos ao utilizar ensaios de imunofluorescência. Nesse caso, o vírus deve ser amplificado novamente por meio do encapsidamento em células MDCK ou em ovos. O fluido Alan Toic e/ou os sobrenadantes de cultura de tecidos da segunda passagem devem agora apresentar claramente resultado positivo no ensaio de HA.Portanto, acabamos de mostrar como resgatar vírus da gripe e vírus da raiva a partir de DNA plasmidial. O resgate de vírus da gripe a partir de DNA plasmidial é um processo simples e direto. Primeiramente, o protocolo foi originalmente desenvolvido no laboratório para o resgate de vírus da gripe recombinantes a partir de DNA plasmidial.Recomendamos três transfeções independentes por vírus recombinante. Se for tentado o resgate de mais de um vírus recombinante da gripe, dimensione os passos de acordo com o número de vírus a serem resgatados. O seguinte protocolo de transfeção e infecção para resgate de vírus recombinantes da gripe a partir de DNA plasmidial é adequado para placas de seis poços.Todos os procedimentos para coletar fluidos tóicos de LAN de ovos infectados são realizados em condições estéreis. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Este vídeo demonstra a geração de partículas semelhantes ao vírus da gripe (VLPs) em um sistema de mamíferos. Ao expressar três vetores de expressão eucariótica - codificando diferentes proteínas estruturais virais - em células hospedeiras de mamíferos adequadas, as proteínas virais expressas se auto-montam em VLPs na membrana plasmática do hospedeiro e são liberadas por brotamento da superfície celular.

Uma técnica para a geração de partículas semelhantes ao vírus da gripe por meio de um sistema de mamíferos

O vídeo mostra um método para criar vírus influenza recombinantes adaptados ao frio. Envolve a transfecção de células humanas com plasmídeos bidirecionais, seguida de incubação em incubação de temperatura mais baixa para produzir vírus adequados para a produção de vacinas, caracterizada por replicação reduzida em condições mais quentes.

Geração de vírus influenza vivos atenuados recombinantes para vacinas

Aqui nós descrevemos uma forma de expressar antígenos de superfície do vírus da influenza corretamente dobradas e funcionais decorrentes do novo vírus H7N9 chinês em células de insetos. A técnica pode ser adaptado para expressar ectodomínios de quaisquer proteínas de superfície virais ou celulares.

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Um protocolo rápido e modular para a geração de vírus recombinantes de vaccinia expressando proteínas fluorescentes marcadas simultaneamente usando o método de seleção dominante transitória é descrito aqui.

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Há uma falta geral de conhecimento sobre como as vacinas funcionam. Aqui, propomos o uso combinado de genética reversa e camundongos quiméricos da medula óssea para obter informações sobre as respostas imunes iniciais do hospedeiro às vacinas, com foco especial nas células dendríticas e na imunidade das células T.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de partículas semelhantes a vírus, seja através de baculovírus ou sistemas de expressão de mamíferos e purificação ultracentrifugação. Esta abordagem altamente personalizada é utilizado para identificar antigénios virais como alvos de vacinas de maneira segura e flexível.

Expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação

Nós descrevemos um método pelo qual podemos identificar resíduos críticos necessários para a ligação de anticorpos monoclonais humanos ou murino que se destinam a hemaglutinina viral do vírus da influenza A. O protocolo pode ser adaptado para outras glicoproteínas de superfície do vírus e suas correspondentes anticorpos neutralizantes.

Geração de variantes de fuga de neutralizar os anticorpos monoclonais de vírus da gripe

Este protocolo descreve um processo experimental para produzir partículas pseudodigitadas virais infecciosas de alto titer (pp) com glicoproteínas envelope de duas cepas de gripe A e como determinar sua infectividade. Este protocolo é altamente adaptável para desenvolver pps de qualquer outro tipo de vírus envolvidos com glicoproteínas envelope diferentes.

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

A geração de rotavírus recombinantes a partir do DNA plasmático fornece uma ferramenta essencial para o estudo da replicação de rotavírus e patogênese, e o desenvolvimento de vetores e vacinas de expressão rotavírus. Aqui, descrevemos uma abordagem genética reversa simplificada para a geração de rotavírus recombinantes, incluindo cepas expressando proteínas fluorescentes de repórteres.

Método de genética reversa simplificado para recuperar rotavírus recombinantes expressando proteínas de repórter

Este é um método para gerar vírus de vaccinia recombinante "sem scarless" usando seleção de alcance de host e identificação visual de vírus recombinantes.

Geração rápida e perfeita de vírus de varíola recombinante usando faixa de host e seleção visual

Aprenda a gerar vírus Influenza recombinante a partir de DNA plasmidial usando transfecção em células 293T e MDCK. Este método viabiliza estudos de virologia e desenvolvimento de vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

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