Name: Label-free In situ Imaging de lignificação na parede celular das plantas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a imagem de lignificação em paredes celulares de plantas usando microscopia Raman confocal sem marcação. Este método permite visualizar a distribuição de lignina com alta resolução espacial em estado nativo.

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Agradecemos a Andrew Carroll, brilhante Chaibang, Purbasha Sarkar (Energy Biosciences Institute, Berkeley), Bahram Parvin (Lawrence Berkeley National Laboratory) e Vincent L. Chiang (North Carolina State University) para colaborações frutíferas e discussões úteis. Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Biociências de Energia. Trabalho na Fundição Molecular foi apoiado pelo Escritório de Ciência, Escritório de ciências básicas da energia, do Departamento de Energia dos EUA no âmbito do contrato n º DE-AC02-05CH1123.

1. Preparação da Amostra <ol><li> Monte a amostra vegetal hidratado, por exemplo, madeira de álamo-tronco ou caule Arabidopsis thaliana, no micrótomo. </li><li> Cortar secções finas (normalmente 20 mm de espessura) do tecido original. </li><li> Transferência da seção de plantas para uma lâmina de vidro. </li><li> Mergulhe a seção planta em D 2 O e cobrir com uma lamínula de vidro, que é selado a lâmina de microscópio para evitar a evaporação de D 2 O. A seção de plantas já está pronto para imagens ou pode ser armazenado para uso futuro. </li></ol> 2. Medição da amostra <ol><li> Aplicar óleo de imersão para a objetiva do microscópio e / ou a lamínula. </li><li> Lugar e garantir a lâmina de microscópio no palco scan piezoelétrico do microscópio, com a lamínula de frente para a objetiva do microscópio. </li><li> Ver a amostra através do lamínula usando uma alta abertura numérica objetiva do microscópio de imersão (100x, NA = 1,40) e localizar a área da amostra de interesse. </li><li> Depois de desligar todas as outras fontes de luz e microscópio de laboratório, a posição-resolvido microspectroscopic medições são realizadas focando bandpass filtrada luz monocromática verde (λ = 532 nm) de uma cw-laser sobre a amostra com um poder típico de 10 a 30 mW ( veja a Figura 1 para um esquema do setup). Autofluorescência pode ocorrer em algumas amostras, que pode proibir medições úteis, em que a excitação caso com mais luz de comprimento de onda do laser pode ser aconselhável. </li><li> O back-luz difusa Stokes-shifted Raman é coletado pela objetiva do microscópio, passa por um espelho dicróico, uma pinhole, que serve como um filtro espacial na configuração confocal, e um filtro longpass, e está focada na fenda de uma grade espectrômetro, onde a luz é espectralmente dispersa e detectada por uma câmera CCD refrigerado, dando um espectro Raman. Um espectro Raman de madeira de álamo é mostrado na Figura 2, com bandas de lignina característica na região espectral entre 1600 e 1700 cm -1. </li><li> Para imagens de química e visualização da distribuição espacial de lignina, um mapa bidimensional espectral é adquirida pela digitalização raster a amostra através do foco do laser com a fase de digitalização e gravação piezoelétrico um espectro Raman para cada posição da amostra. Mapas tridimensionais espectrais podem ser geradas pelo empilhamento de mapas bidimensionais em que o foco do laser foi reforçada consecutivamente ao longo da direção z. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> Para a indústria química e visualização de imagens de lignina, os dados coletados são analisados ​​usando MATLAB (MathWorks, versão 7.7). Os dados são organizados em um cubo tridimensional hiperespectrais, que é composto pelas duas dimensões espaciais e uma terceira dimensão para os sinais espectrais. </li><li> Para a análise de lignina, a região espectral entre 1550 e 1700 cm -1 é considerado (ver Figura 2). A distribuição espacial da lignina é visualizado através da integração da intensidade de 1.550 a 1.700 cm -1 dos espectros de linha de base corrigida (ver Figura 3). Como uma alternativa para correção de linha de base, da derivada segunda espectros podem ser computados e os picos de segunda derivativos utilizados para análise. </li><li> Lignina localização e química, especialmente com relação a coniferaldehyde e metades de álcool coniferil, podem ser analisados ​​através da avaliação da área sob os picos equipado Gaussian das três bandas encontrados entre 1.600 e 1.700 cm -1 (ver inserção da Figura 2 e 15 Refs. - 17). </li><li> Normalização intensidade entre diferentes mapas espectral é realizada utilizando como referência a altura do pico da banda OD extrínsecos alongamento cerca de 2.500 cm -1 nos espectros da luz média, que são obtidos por meio de classificação k-clustering. Isto é crítico e permite comparar as intensidades de sinal de lignina entre as medidas diferentes, tecidos, amostras e espécies. </li></ol> 4. Resultados representante Um espectro Raman representativo de madeira de álamo haste (Populus angustifolia) é mostrado na Figura 2. Lignina bandas características são encontradas na região espectral entre 1600 e 1700 cm -1. Como exemplo, a distribuição espacial da lignina em uma madeira de álamo seção transversal é apresentada na Figura 3. Em comparação com a imagem visível, regiões morfologicamente distintas parede celular se claramente distinguíveis devido às diferentes intensidades de lignina sinal. Alto sinal de lignina é observado nos cantos das células (CC) e, um pouco menos, no meio composto lamelas (CML). Quantidades inferiores, ainda não insubstancial, de lignina são observados dentro da camada S2 da parede das fibras. Variabilidade de lignina intensidade do sinal é encontrado em certa medida, dentro de CC, CML e S2, especialmente da fibra a fibra. A resolução lateral espacial em nossas medições é de aproximadamente 300 nm. A qualidade dos dados presta-se bem para comparar entre lignificaçãoamostras e para continuar a dissecar lignina química 15. <img src="/files/ftp_upload/2064/2064fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Um esquema da configuração instrumental BP:. Bandpass filtro; DM: espelho dicróico, PH: pinhole; LP: longpass filtro. <img src="/files/ftp_upload/2064/2064fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Um espectro Raman representativo de madeira de álamo haste (Populus angustifolia) registrados em D 2 O. A área realçada espectral (ver também o inset) marca a região espectral tendo três picos especificamente atribuíveis a lignina. <img src="/files/ftp_upload/2064/2064fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Raman imagem lignina (inferior) de uma madeira de álamo seção transversal (de cima: imagem visível), obtida pela integração da intensidade do sinal Raman de 1.550 a 1.700 cm -1.

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<li>Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+imaging+of+cell+wall+polymers+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana.</a> Biochem Biophys Res Comm. 395, 521-523 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais lignocelulósicos são hierárquicas e heterogêneo em relação à estrutura e composição. Ferramentas para uma aprofundada caracterização analítica que têm sensibilidade química, resolução espacial, e que dão insights sobre estas matérias no contexto nativas são desejáveis. O método descrito permite a visualização de lignina e comparação de lignificação da biomassa vegetal lignocelulósica com resolução espacial que é sub-M, sem manchas ou rotulagem das amostras em uma situação próxima do estado nativo. Ela exige a ...

<table><tbody><tr><td>lâminas de microscópio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lamínulas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>esmalte de unha</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>óleo de imersão</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinceta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pincel pontiagudo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrótomo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal Raman</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

label-free in situ imaging de lignificação na parede celular das plantas

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Reunião crescentes demandas de energia de forma segura e eficiente é um desafio urgente global. Portanto, a investigação sobre a produção de biocombustíveis, que procura encontrar soluções cost-effective e sustentável tornou-se uma tarefa tópica e crítica. Biomassa lignocelulósica é posicionado para se tornar a principal fonte de biomassa para a conversão em biocombustíveis líquidos 1-6. No entanto, a recalcitrância desses materiais da parede celular de plantas para a degradação do custo-efetiva e eficiente apresenta um grande impedimento para a sua utilização na produção de biocombustíveis e produtos químicos 4. Em particular, a lignina, complexo e irregular heteropolímero poli-fenilpropanóides, torna-se problemática para a pós-colheita desconstrução da biomassa lignocelulósica. Por exemplo, na conversão de biomassa para os biocombustíveis, inibe sacarificação dos processos destinados a produção de açúcares simples para fermentação 7. O uso efetivo de biomassa vegetal para fins industriais é de fato em grande parte dependente da medida em que a parede celular vegetal é lignificado. A remoção de lignina é um fator limitante caro e 8 e lignina, portanto, tornar-se um melhoramento de plantas chave e alvo da engenharia genética, a fim de melhorar a conversão da parede celular. Ferramentas analíticas que permitem a caracterização exata rápida lignificação da parede celular das plantas cada vez mais importante para avaliar um grande número de populações reprodutoras. Procedimentos extrativistas para o isolamento de componentes nativos, como a lignina são inevitavelmente destrutivas, trazendo química significativa e modificações estruturais 9-11. Química analítica nos métodos in situ são, portanto, ferramentas inestimáveis ​​para a caracterização composicional e estrutural de materiais lignocelulósicos. Microscopia Raman é uma técnica que depende de espalhamento inelástico ou Raman de luz monocromática, como a de um laser, onde a mudança na energia dos fótons do laser está relacionado às vibrações moleculares e apresenta uma intrínseca label-free &quot;impressão digital&quot; molecular da amostra . Microscopia Raman pode pagar medições não-destrutivas e relativamente barato com a preparação da amostra mínima, dando insights sobre composição química e estrutura molecular em uma situação próxima do estado nativo. Química de imagens por microscopia confocal Raman tem sido utilizado anteriormente para a visualização da distribuição espacial de celulose e lignina nas paredes celulares de madeira 12-14. Com base nesses resultados anteriores, temos recentemente adoptado este método para comparar lignificação no tipo selvagem e lignina deficiente transgênicos trichocarpa Populus (preto cottonwood) haste de madeira 15. Analisando as bandas Raman 16,17 lignina na região espectral entre 1600 e 1700 cm -1, intensidade de sinal de lignina e localização foram mapeados in situ. Nossa abordagem visualizadas diferenças no conteúdo de lignina, localização e composição química. Mais recentemente, demonstramos imagem Raman de polímeros da parede celular em Arabidopsis thaliana com resolução lateral que é sub-M 18. Aqui, este método é apresentado proporcionando a visualização de lignina na parede celular das plantas e comparação de lignificação em diferentes tecidos, amostras ou espécie, sem manchas ou rotulagem dos tecidos.

Um método baseado em microscopia confocal Raman é apresentado que proporciona rótulo sem visualização de lignina na parede celular das plantas e comparação de lignificação em diferentes tecidos, amostras ou espécies.

Label-free In situ Imaging de lignificação na parede celular das plantas

Atender às crescentes demandas energéticas de forma segura e eficiente é um desafio global premente. Portanto, a pesquisa na produção de biocombustíveis que busca encontrar...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens diretas e comparar a lignificação nas paredes celulares de plantas com resolução espacial na escala submicrométrica, sem coloração ou marcação das amostras, mantendo-as em um estado próximo ao nativo. Isso é realizado primeiramente cortando seções finas do tecido nativo com micrótomo. O próximo passo é adquirir um mapa espectral da região de interesse da amostra no microscópio Raman confocal.Isso é realizado por meio de uma varredura do amostra pelo Rasta, registrando um espectro Raman para cada posição da amostra. O passo final consiste em analisar o conjunto de dados espectrais e calcular imagens químicas nas quais a distribuição espacial da lignina é visualizada pela integração da intensidade de bandas Raman específicas, atribuíveis às vibrações moleculares da lignina. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram a distribuição espacial da lignina sem necessidade de coloração ou marcação das amostras.Por meio da microscopia confocal rama, as intensidades dos sinais da lignina podem ser comparadas entre diferentes medições, tecidos, amostras e espécies. Olá, sou Jim Shock, cientista da equipe técnica do Molecular Fou

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Biology

Biologia

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição da lignina polifenólicos.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte I: A lignina

Neste vídeo, descrevemos a técnica de coloração de Wiesner para colorir a lignina presente em células vegetais especializadas. Esta técnica de coloração ajuda a visualizar as paredes celulares lignificadas nos caules de Arabidopsis thaliana e ajuda a quantificar a lignificação nas paredes celulares de diferentes tipos de células.

Coloração de Wiesner para visualização de lignina: uma técnica para corar depósitos de lignina presentes em caules de Arabidopsis thaliana

Neste vídeo, descrevemos a técnica de coloração Maule para coloração de lignina siringil presente nas células vegetais especializadas. Essa técnica de coloração ajuda a caracterizar a distribuição da lignina no xilema e nas fibras interfasciculares.

Coloração Maule para lignina: uma técnica para caracterizar a distribuição de lignina em seções de caule de Arabidopsis thaliana

A composição da parede celular vegetal varia entre os tipos de tecido e pode incluir lignina, celulose, hemiceluloses e pectina. Várias técnicas de coloração foram desenvolvidas para visualizar as diferenças no nível do tipo de célula. Este artigo é uma compilação de técnicas de coloração da parede celular comumente usadas.

Coloração histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celular Secundária parede Elements

A celulose cristalina é um constituinte importante da parede celular da planta. No entanto, sua quantificação em uma resolução celular é tecnicamente desafiadora.  Aqui, relatamos o uso de tecnologia de luz polarizada e seções de choque radicular para obter informações da composição da parede celular em uma resolução espaço-temporal.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Este protocolo visa apresentar um método geral para visualizar lignina, celulose e hemicelulose em paredes celulares de plantas usando imagem de Raman e análise multivariada.

Combinando imagem Raman e análise multivariada para visualizar Lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta

BLISS, um protocolo de rotulagem duplo para estudar a dinâmica de lignificação, foi desenvolvido. Usando o monolignol sintético repórteres e uma combinação sequencial de SPAAC e CuAAC opaco clique em reações, abre esta metodologia o caminho para uma análise detalhada dos fatores que regulam a biogênese de Ligninas em planta.

Visualização dinâmica de lignificação em plantas com química clique: dupla rotulagem é uma bênção!

Este protocolo descreve uma configuração original que combina medições espectrais e fluorescência ao longo da vida para avaliar a transferência de energia de ressonância Förster (FRET) entre sondas fluorescentes à base de rodamina e polímero de lignina diretamente em seções de plantas espessas.

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Este protocolo descreve em detalhes como o material vegetal para imunolocalização de proteínas e pectinas arabinogalactanas é fixado, embutido em uma resina acrílica hidrofílica, seccionada e montada em lâminas de vidro. Mostramos que epítopos relacionados à parede celular serão detectados com anticorpos específicos.

Imunolocalização fluorescente de proteínas árabes e pectinas na parede celular de tecidos vegetais

Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a imagem da dinâmica da parede celular 3D do tecido de musgo vivo, permitindo a visualização do descolamento das paredes celulares em mutantes ggb e do espessamento dos padrões da parede celular no tipo selvagem durante o desenvolvimento durante um longo período.

Imagem de lapso de tempo 3D da dinâmica da parede celular usando Calcofluor no musgo Physcomitrium patens

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