Avaliação da função cardíaca e Energetics em Corações Isolados rato Usando ³¹ P NMR Spectroscopy

O objetivo geral do experimento a seguir é observar a função cardíaca e a energética em um coração de camundongo perfundido isolado. Isso é conseguido perfundindo um coração de rato no modo LOR. Com o tampão de seleção manual de Krebs enriquecido com glicose e piruvato como segunda etapa, um balão cheio de água é inserido no ventrículo esquerdo ou ve, o que permite o monitoramento constante da função cardíaca durante o experimento.

Em seguida, o coração é colocado em um tubo de RMN de 10 milímetros e inserido no ímã para avaliar a energética cardíaca através da observação das ressonâncias dos fosfosfatos de fosfocreatina de um TP e foram obtidos os resultados de fosfato inorgânico que mostram a função cardíaca e a energética com base nas ondas de pressão do VE e P 31 e uma espectroscopia de massa p. Olá, Eu sou Steve Kitz, do MIT Cadre Metabolism Center no Departamento de Anestesiologia da Universidade de Washington. Hoje vou mostrar a vocês um procedimento para perfusão cardíaca isolada combinada com espectroscopia 31 PNMR.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para avaliar a função cardíaca e a energética em nossos modelos de camundongos de bioengenharia. Então vamos começar. Para iniciar este protocolo, prepare um litro de kres, portanto, light ou KH buffer.

Introduza bolhas de 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio na mistura por 10 a 15 minutos. Em seguida, adicione dois milimolares de cloreto de cálcio, seguidos de substratos, 10 milimolares de glicose e 0,5 milimolar de piruvato. Para esses experimentos, dois sistemas separados são utilizados simultaneamente por aquisição de P 31 Spectra.

Um ímã BRUER 14 T é conectado com o console avançado de três e um computador equipado com o software Top Spin V 2.1 para avaliação da função cardíaca. Um sistema de perfusão cardíaca personalizado é conectado ao laboratório de energia. Quatro requisição de dados 30.

Equipado com o software de prontuário PRO seis para análise de dados. O aparelho de perfusão cardíaca inclui uma mini bomba peristáltica de três pulsos controlada por um controlador de bomba STH usado para perfundir o tampão KH na regulação da temperatura cardíaca durante o experimento de RMN é crítico. Os circuladores aquecidos são usados para manter a temperatura entre 37,0 e 37,5 graus Celsius enquanto o coração está dentro do ímã e a temperatura é monitorada durante o experimento usando uma sonda de temperatura de fibra óptica.

Ao longo do experimento, a pressão do VE e a pressão de perfusão são monitoradas por meio de transdutores de pressão que são conectados a um sistema de aquisição de dados e exibidos usando o software incluído. Um transdutor fisiológico é usado para monitorar a pressão do VE e um transdutor de pressão arterial descartável é usado para monitorar a pressão de perfusão. Finalmente, um cordão umbilical é usado para fornecer o tampão oxigenado aquecido ao coração.

Uma vez dentro do ímã, antes do início do experimento, calibre os transdutores de pressão com o manômetro de momento fig padrão em primeiro lugar, sem pressão no transdutor, para zerar a calibração. Em seguida, encha este manômetro de modo figo a uma pressão mais alta. Insira esse valor no programa de computador.

Em seguida, confirme se os transdutores de pressão foram calibrados adequadamente, enchendo este manómetro de momento de figo a pressões conhecidas e verificando-as no ecrã do computador. Uma vez calibrados os transdutores de pressão, calibrar a sonda de RMN com um tubo de RMN de 10 milímetros contendo uma amostra-padrão de fosfato de sódio a 150 milimolares. Execute a calibração usando o programa de software de rotação superior.

Primeiro, ajuste a amostra para definir a frequência da ressonância do fósforo. Em seguida, calce a amostra para criar um campo magnético homogêneo. Essa calibração inicial facilita o sinal e diminui o tempo necessário para iniciar o período de aquisição.

Uma vez que o coração esteja posicionado dentro da sonda para iniciar a extração do coração do camundongo, injete no camundongo 200 unidades de heparina intraperitoneal para reduzir a coagulação. Após cinco minutos, administre 175 miligramas por quilograma de Penta barbital de sódio intraperitoneal. Depois que o mouse estiver anestesiado, coloque-o de costas e prenda os braços e as pernas para expor a área do peito.

Execute uma pitada no dedo do pé para garantir que o mouse esteja totalmente anestesiado. Cortar. Abra a cavidade peritoneal e o tórax com uma tesoura e use uma pinça para descascar a caixa torácica e expor uma cavidade torácica com uma pinça. Segure o tecido pulmonar e levante suavemente o coração com uma tesoura curva.

Corte os grandes vasos atrás do coração e continue lentamente em direção à cabeça do rato até que o coração esteja livre. Prenda imediatamente o coração no tampão KH gelado. Mantenha os órgãos no gelo e remova rapidamente os pulmões.

Identifique os lóbulos do timo e retire-os suavemente para expor a aorta. Em seguida, remova o timo. Finalmente, isole a aorta removendo cuidadosamente qualquer tecido circundante.

Usando uma micro pinça de sutura, geralmente segure ambas as paredes da aorta para expor o lúmen. Em seguida, coloque cuidadosamente a aorta na cânula. Feito de tubo de polietileno de diâmetro externo de 0,965 milímetros.

Segure a aorta no lugar com uma pinça de microvasos e amarre rapidamente as suturas ao redor da aorta. Assim que as suturas estiverem amarradas, remova a pinça. Use a pinça para verificar cuidadosamente se a cânula está acima da raiz da aorta.

Adicione quaisquer laços adicionais necessários para manter o coração no lugar. Remova qualquer tecido extra usando a pinça e a microtesoura. Em seguida, faça uma pequena incisão no oráculo esquerdo.

Segure suavemente o coração e insira cuidadosamente um tubo de polietileno de 0.61 milímetro de diâmetro através do átrio esquerdo, cavidade ventricular esquerda e saia pelo ápice. Apare o excesso de tubo. Em seguida, insira um balão cheio de água esvaziado através do átrio no ventrículo esquerdo.

Segure o balão no lugar usando fita adesiva. Em seguida, aumente gradualmente a velocidade da bomba peristáltica para fornecer fluxo suficiente ao coração. Continue a perfundir o coração com tampão KH usando um fluxo constante equivalente a aproximadamente dois mililitros por minuto até que o coração seja colocado na sonda de RMN.

Encha o balão LV com um pequeno volume usando uma seringa micrométrica para verificar se o transdutor de pressão LV está funcionando para espectroscopia de RMN. Primeiro, insira cuidadosamente o coração em um tubo de RMN de 10 milímetros. Um girador de javali largo é colocado ao redor do tubo de RMN para ajudar a guiar o tubo para a posição correta.

Dentro da sonda, prenda firmemente todo o aparelho ao cordão umbilical com fita adesiva. Em seguida, abaixe lentamente o cordão umbilical no orifício superior do ímã até que o tubo de RMN contendo o coração esteja dentro da bobina da sonda de RMN de 10 milímetros. Quando o coração estiver na posição correta dentro da sonda, ajuste o fluxo da bomba parasita para atingir uma pressão de perfusão de 80 milímetros de mercúrio.

Mantenha a pressão de perfusão ativando o mecanismo de retenção no controlador da bomba. Deixe um período de equilíbrio de 15 a 20 minutos para o coração. Durante o período de equilíbrio, ajuste o volume do balão LV para atingir uma pressão diastólica final de oito a 10 milímetros de mercúrio.

Em seguida, otimize os parâmetros do espectrômetro para obter o melhor sinal de fósforo possível. Sintonize o instrumento de RMN ajustando o pulso de rádio, de modo que a frequência na qual o núcleo de fósforo ressoa. Em seguida, calço a amostra para tornar o campo magnético homogêneo após o período de equilíbrio.

Inicie a aquisição múltipla de espectros de RMN P 31. O período de aquisição para cada espectro depende da intensidade do campo do ímã, do tamanho da amostra e da relação sinal-ruído necessária para um experimento específico. Aqui, os espectros são obtidos usando um ímã de 14 Tesla, calculando a média do sinal obtido de 256 pulsos de radiofrequência de 20 microssegundos com um ângulo de inversão de 60 graus e atrasos de 2,0 segundos.

Este experimento exigirá aproximadamente 10 minutos. Uma medida típica da função cardíaca, a pressão desenvolvida pelo VE é obtida subtraindo a pressão diastólica final ou EDP da pressão sistólica. Em um camundongo C 57 preto normal de seis, a pressão desenvolvida pelo LV cardíaco é tipicamente entre 100 a 110 milímetros de mercúrio a uma pressão diastólica final fixa de oito a 10 milímetros de mercúrio.

Curvas de estilo representativas são mostradas de camundongos com bandas de controle e aórticos. A função sistólica é representada pela pressão desenvolvida pelo VE sobre o aumento dos volumes do VE, conforme determinado pelo volume do balão do VE. A função diastólica é representada pela EDP sobre o aumento dos volumes do VE.

Os espectros de RMN P 31 de um coração de camundongo perfundido isolado fornecem sinais de FOSFOCREATINA ou PCR, os três fosfatos de um TP e fosfato inorgânico ou pi. Aqui, o pico de PI é relativamente pequeno. Isso é típico de um coração profusado aerobicamente abastecido com piruvato ou ácidos graxos.

Além da glicose durante os períodos de isquemia, esse pico aumenta enquanto o pico de PCR diminui. Acabei de mostrar como preparar um coração de camundongo para perfusão, de modo que tanto a função cardíaca quanto a energética possam ser medidas simultaneamente durante o experimento. É importante certificar-se de que o coração está adequadamente perfundido.

Caso contrário, seus dados de RMN não serão confiáveis. Então é isso. Obrigado e boa sorte com seus experimentos.