Name: Avaliação da função cardíaca e Energetics em Corações Isolados rato Usando 31 P NMR Spectroscopy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprenda a avaliar função cardíaca e energética em corações isolados de rato usando espectroscopia 31P NMR. Este método combina perfusão Langendorff com monitoramento dinâmico de fosfatos de alta energia.

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Os autores gostariam de agradecer Lynne Spencer, pelo seu apoio durante a parte espectroscopia de RMN do experimento. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde HL059246 fundo R01, R01 HL067970, R01 HL088634 (para Dr. Tian) e F32 HL096284 (para Dr. Kolwicz).

<ol><li> Para estes experimentos, dois sistemas separados são utilizados simultaneamente. Para aquisição de 31 espectros de P, um ímã Bruker 14T é a interface com o III Avance console e um computador equipado com software TopSpin V2.1. Para avaliação da função cardíaca, um sistema de perfusão personalizado construído coração está conectado com o PowerLab 30/04 aquisição de dados, equipada com os 6 LabChartPro software para análise de dados. </li><li> No dia do experimento, 1 litro de Krebs-Henseleit tampão é preparado da seguinte forma: 0,5 mM EDTA, 5,3 mm KCl, 1,2 mm MgSO 4, 118mm NaCl e 25mM NaHCO 3. A mistura é então borbulhado com 5% de CO 2 / O 2 95% por 10-15 minutos antes da adição de 2mM CaCl 2. Finalmente, substratos, na forma de glicose 10 mM e 0,5 mM de piruvato, são adicionados. </li><li> Regulação da temperatura durante a experiência é fundamental. Circuladores aquecida são usados ​​para manter a temperatura entre 37,0-37,5 ° C, enquanto o coração está dentro do ímã. A temperatura é monitorada para a duração do experimento usando uma sonda de temperatura de fibra óptica. </li><li> Pressão de perfusão ea pressão ventricular esquerda são monitorados através de transdutores de pressão ligados a um sistema de aquisição de dados e exibidos utilizando o software incluído. Estes são calibrados com um esfigmomanômetro padrão antes do experimento. Além disso, linhas de pressão são liberadas de forma adequada, a fim de remover todas as bolhas de ar. </li><li> A amostra padrão de 150 mM fosfato de sódio (que é equivalente à força iônica do tampão KH) é usado para "calibrar" a sonda antes da inserção do coração. Isso facilita o sinal e diminui o tempo necessário para começar o período de aquisição uma vez que o coração está posicionado dentro da sonda. </li><li> Para reduzir a coagulação, o mouse é injetado com 200 unidades de heparina IP Depois de 5 minutos, sódio IP (175 mg / kg) pentobarbital é dado. </li><li> O coração é rapidamente retirado (com os pulmões eo timo intacta) e preso no gelo frio KH buffer. </li><li> Enquanto mantidos em gelo, os pulmões são rapidamente removidas. Os lobos do timo são identificados e delicadamente descascadas volta para expor a aorta. O timo é removido. A aorta é então isolado pela remoção cuidadosa de qualquer tecido circundante. </li><li> Forceps Micro sutura são usados ​​para segurar delicadamente ambas as paredes da aorta para expor o lúmen. A aorta é cuidadosamente colocada sobre a cânula feita de tubo de polietileno 0,965 mm de diâmetro externo (PE50). A aorta é mantida no lugar com uma braçadeira navio micro, enquanto as suturas são rapidamente amarrado ao redor da aorta. O clipe é removido e as pinças são usadas para verificar cuidadosamente que a cânula está acima da raiz da aorta. Vínculos adicionais são adicionados como necessário para manter o coração no lugar. </li><li> Qualquer tecido extra é removida com fórceps e microtesoura. Uma pequena incisão é feita na aurícula esquerda. A tubulação de polietileno de 0,61 milímetros OD (PI10) é cuidadosamente inserido através do átrio esquerdo, cavidade do VE, e para fora através do ápice, enquanto delicadamente segurando o coração. A tubulação em excesso é aparado. </li><li> A deflacionado balão cheio de água é introduzido através do átrio para o LV e é mantida no lugar usando fita adesiva ou suturas. A velocidade da bomba peristáltica é gradualmente aumentada para fornecer fluxo suficiente para o coração. Até que o coração é lugar para a sonda de RMN, o coração vai continuar a ser perfundidos com fluxo constante equivalente a aproximadamente 2 ml / min. O balão é inflado LV com um pequeno volume, utilizando uma seringa micrométrica para verificar se o transdutor de pressão LV está funcionando. </li><li> O coração é cuidadosamente inserido em um tubo de RMN 10 mm. Uma ampla furo "giratório" é usado para ajudar a orientar o tubo na posição adequada dentro da sonda. Todo o aparato é, então, firmemente ligado ao "cordão umbilical" com fita adesiva. </li><li> O cordão umbilical é lentamente abaixado no furo superior do ímã até o tubo de coração / NMR está dentro da bobina da sonda 10 milímetros de RMN. </li><li> Uma vez que o coração está na posição adequada dentro da sonda, a vazão da bomba peristáltica é ajustado de forma a atingir uma pressão de perfusão de 80mmHg. (Lembre-se que até este ponto, o coração foi perfundido com um fluxo constante de aproximadamente 2 ml / min). A pressão de perfusão é então mantida, permitindo que o "hold" mecanismo no controlador de bomba. O coração é então permitido um período de equilíbrio 15-20 minutos. Durante esse tempo, o volume do balão LV é ajustada para atingir uma pressão final diastólica de 8-10 mmHg. </li><li> Durante o período de equilíbrio, é necessário otimizar os parâmetros espectrômetro a fim de obter o sinal de fósforo melhor possível. Isto é conseguido através da criação do pulso de rádio na frequência a qual o núcleo de fósforo ressoa ("tuning") e fazendo o campo magnético homogêneo ("calços"). </li><li> Após o período de equilíbrio, vários espectros de RMN 31 P pode ser obtida. O período de aquisição de cada espectro é dependente de tele força do campo do ímã, do tamanho da amostra, ea relação sinal-ruído requerida para um experimento específico. Espectros são obtidos utilizando um ímã 14 Telsa pela média do sinal obtido a partir de 256 pulsos de rádio freqüência de 20 mS com um ângulo de 60 graus flip e atrasos de 2,0 segundos. Esta experiência vai exigir cerca de 10 min. </li></ol> Resultados representante Do hardware de aquisição de dados eo software LabChart, vários parâmetros da função cardíaca pode ser medido ao longo do protocolo experimental. A medida típica da função cardíaca, a pressão ventricular esquerda desenvolvidos (LVDevP), é obtida pela subtração da pressão diastólica final (EDP) a partir da pressão sistólica (Figura 1). Esta medida pode variar dependendo da estirpe do mouse ea condição do coração (ou seja, a sobrecarga de pressão). No entanto, em um normal LVDevP coração C57BL6 mouse é normalmente entre 100-110 mmHg na pressão diastólica final fixo de 10/08 mmHg. Além disso, o programa permite LabChart para a medição da freqüência cardíaca baseada nas medidas cíclica das ondas de pressão do VE. Novamente, esta medida pode variar, mas valores típicos são 350-400 bpm quando os corações estão autorizados a bater a taxas intrínsecas. No entanto, o coração pode ser padronizado utilizando um sistema de estimulação onde a freqüência cardíaca é mantida a 420 bpm. Além disso, medidas de contratilidade (+ dP / dt) e relaxamento (-dP/dt) pode ser estimada utilizando a primeira derivada da onda de pressão do VE. Durante o protocolo experimental é fácil avaliar o mecanismo de Starling, incorporando uma relação pressão-volume. Isto é conseguido através de aumentos graduais no balão LV e observando o LVDevP, bem como a EDP. Estes valores podem ser representados como mostrado na Figura 2. Enquanto a curva de Starling é o ideal, observando o volume necessário para atingir uma EDP de 8-10 mmHg pode dar uma idéia indireta de LV dimensão câmara. Isto pode ser usado em modelos de bandagem aórtica como corações hipertrofiados normalmente exigirá um volume menor balão enquanto corações dilatados requerem um volume maior quando comparados aos controles. A Tabela 1 apresenta dados representativos função cardíaca como adquiridos durante o protocolo de perfusão. O espectrômetro de RMN 31 P irá fornecer sinais de fosfocreatina (PCr) e os três fosfatos do ATP (ATP-γ, α-ATP, e β-ATP), bem como fosfato inorgânico (Pi), conforme mostrado na Figura 2. Análise de cada um desses picos fornece um valor para a área sob a curva. A quantidade de ATP é estimada pela média das γ-ATP e β-ATP áreas. (O α-ATP não é utilizada porque as moléculas de NAD contribuir para uma parte desconhecida do sinal total). O status energético do coração é determinado pelo quociente da PCr e áreas ATP (PCr: relação ATP). Esse valor é normalmente 1,5-1,7 em um coração de rato fornecido com a glicose como substrato primário. Embora 31 P NMR não fornece medidas diretas de ATP ou PCr, a área dos picos é proporcional à quantidade de fósforo contendo compostos na amostra. Valores para esses sinais podem ser estimados por outros métodos. Por exemplo, medidas diretas de ATP por cromatografia líquida (HPLC) em uma coorte de coração pode produzir uma concentração média. Este valor pode então ser usada para calibrar o ATP áreas médias observadas nos espectros. A concentração de PCr pode ser calculada com base na área PCr relativa à área de ATP. Também é possível estimar pH, analisando o deslocamento químico relativa do fosfato inorgânico (Pi) de sinal para o sinal de PCr. 1 Usando seqüências de pulsos de rádio diferentes, a velocidade de reação da creatina quinase ATP ou a velocidade de reação de síntese também pode ser medido. 2 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="Tabela 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Tabela de funções da linha de base 1. Cardíaca de corações isolados perfundidos. LVDevP: pressão ventricular esquerda desenvolvidos; PDFVE: final do ventrículo esquerdo pressão diastólica; FC: freqüência cardíaca; RPP: produto pressão taxa; + dP / dt: primeiro LV pressão derivada positiva; -dP/dt: primeiro LV pressão derivada negativa; PP : pressão de perfusão; CF: fluxo coronariano. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Representante LV ondas de pressão de LabChart software Pro. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Curvas de Starling Representante do controle (linha sólida) e em faixas aórtica (linha pontilhada) camundongos. A) função sistólica, representado por mais de LVDevP volumes crescentes LV, conforme determinado pelo volume do balão LV. B) A função diastólica como representado pela EDP sobre volumes crescentes LV, conforme determinado pelo volume do balão LV. LVDevP: pressão do ventrículo esquerdo desenvolveu (sistólica menos p diastólicaressure); EDP: pressão diastólica final. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representante 31 P espectros de RMN de coração de rato isolado perfundido. Observe o relativamente pequeno pico Pi. Em um coração aerobicamente perfundidos fornecido com ácidos graxos ou piruvato, além de glicose, o pico deve ser mínima. Durante os períodos de isquemia, o que aumenta de pico, enquanto o pico PCr diminui. Observe o ombro para a direita do pico de α-ATP. Esta é a contribuição de moléculas de NAD. Pi: fosfato inorgânico; PCr: fosfocreatina; ATP: adenosina trifosfato.

<ol><li>Nascimben, L., Ingwall, J. S., Lorell, B. H., Pinz, I., Schultz, V., Tornheim, K., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+increased+glycolysis+in+the+hypertrophied+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for increased glycolysis in the hypertrophied rat heart.</a> Hypertension. 44, 662-667 (2004).</li>
<li>Spindler, M., Saupe, K. W., Tian, R., Ahmed, S., Matlib, M. A., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+creatine+kinase+enzyme+kinetics+in+diabetic+cardiomyopathy.+A%2831%29P+NMR+magnetization+transfer+study+of+the+intact+beating+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Altered creatine kinase enzyme kinetics in diabetic cardiomyopathy. A(31)P NMR magnetization transfer study of the intact beating rat heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 31, 2175-2189 (1999).</li>
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<li>Luptak, I., Balschi, J. A., Xing, Y., Leone, T. C., Kelly, D. P., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+contractile+and+metabolic+reserve+in+peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha-null+hearts+can+be+rescued+by+increasing+glucose+transport+and+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Decreased contractile and metabolic reserve in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha-null hearts can be rescued by increasing glucose transport and utilization.</a> Circulation. 112, 2339-2346 (2005).</li>
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<li>Luptak, I., Shen, M., He, H., Hirshman, M. F., Musi, N., Goodyear, L. J., Yan, J., Wakimoto, H., Morita, H., Arad, M., Seidman, C. E., Seidman, J. G., Ingwall, J. S., Balschi, J. A., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+remodels+metabolic+network+in+favor+of+cardiac+glycogen+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Aberrant activation of AMP-activated protein kinase remodels metabolic network in favor of cardiac glycogen storage.</a> J Clin Invest. 117, 1432-1439 (2007).</li>
<li>Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+and+energy+homeostasis+in+mouse+hearts+overexpressing+dominant+negative+alpha2+subunit+of+AMP-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase.</a> J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).</li>
<li>Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+increased+glucose+entry+on+mouse+hearts+during+normal+aging+and+ischemic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress.</a> Circulation. 116, 901-909 (2007).</li>
<li>Tian, R., Abel, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+GLUT4-deficient+hearts+to+ischemia+underscore+the+importance+of+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis.</a> Circulation. 103, 2961-2966 (2001).</li>
<li>Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac-specific+overexpression+of+GLUT1+prevents+the+development+of+heart+failure+attributable+to+pressure+overload+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice.</a> Circulation. 106, 2125-2131 (2002).</li>
<li>Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activity+in+rat+hearts+with+pressure-overload+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy.</a> Circulation. 104, 1664-1669 (2001).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

31 P espectroscopia de RMN no coração do mouse Langendorff-perfundidos isolados fornece dados confiáveis ​​e reprodutíveis. 3, 4 No entanto, é imperativo que a canulação da aorta ea inserção do balão LV são feitas adequadamente tais para permitir o desempenho cardíaco estável, enquanto no interior do NMR tubo. Além disso, a regulação da temperatura é fundamental para alcançar a função de referência apropriada. Um fator importante na obtenção de bons, espectros de RMN analisável é o aumento da relação sinal-ruído. Isto pode ser conseguido através da garantia &quot;tuning&quot; ótimo e &quot;calços&quot; na amostra. Como mencionado no texto do protocolo, o uso de uma amostra padrão antes da inserção do coração pode facilitar este processo. Também é útil ter uma adequada &quot;amostra&quot; de tamanho. Corações com peso inferior a 100 mg normalmente fornecem PCr mais baixos e sinais de ATP para aumento do tempo de aquisição será necessário para obter espectros de fósforo bom. Existem várias maneiras de modificar o protocolo existente para angariar informações adicionais sobre a função cardíaca e energética. Em nosso laboratório, temos perfundidos corações com buffers substrato misto, que pode incluir a presença de diferentes combinações de ácidos graxos (em concentrações baixa e alta), lactato, cetonas e insulina. Com o uso de isótopos estáveis ​​no buffer de perfusão (ou seja, 13 C rotulados substratos), possuímos a capacidade de estimar utilização do substrato pela contribuição relativa da rotulados acetil CoA para o ciclo TCA. 5-7 Para esta aplicação, realizamos isotopomer análise de 13 e 13 de C3-C4-glutamato com 13 C espectroscopia de RMN. Isso exige congelamento de aperto no coração no final do protocolo de perfusão e realizar uma extração do tecido congelado. Este será um experimento adicional como a análise requer o uso de uma sonda com diferentes parâmetros de configuração separado. Outras aplicações incluem a substituição de glicose com deoxiglicose no buffer enquanto monitora a acumulação dependente do tempo de 2-fosfato deoxiglicose no coração usando espectroscopia de RMN 31 P. Este método permite a medição da absorção de glicose do miocárdio. 7, 8 Além disso, nosso laboratório analisou a função cardíaca e energética em protocolos de perfusão consiste de isquemia / reperfusão e desafio alta carga de trabalho. 6, 80-10 Em resumo, 31 P espectroscopia de RMN no coração de rato isolado é um procedimento tecnicamente desafiador exigindo o uso de equipamentos sofisticados. No entanto, os dados que ele produz é inestimável para o pesquisador que pretende analisar a função e energética dos modelos do rato de bioengenharia. Para o nosso laboratório, estas técnicas têm sido vitais em nossa compreensão das conseqüências de uma variedade de fatores de estresse sobre a função cardíaca, energética e metabolismo. 1, 11, 12

<table><tbody><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Ultrashield 600WB Plus</td><td>Equipamento</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;PowerLab 4/30&lt;/a&gt;</td><td>Equipamento</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;ML866/P&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;LabChart 6 Pro&lt;/a&gt;</td><td>Equipamento</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;MLS260/6&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;Quad Bridge Amp&lt;/a&gt;</td><td>Equipamento</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;ML224&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;STH Pump Controller&lt;/a&gt;</td><td>Equipamento</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;ML175&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;Minipuls 3 Peristaltic Pump&lt;/a&gt;</td><td>Equipamento</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;ML172&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;Transdutor de pressão descartável&lt;/a&gt;</td><td>Equipamento</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;MLT0699&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de amostra de RMN de 10 mm</td><td>Equipamento</td><td>Wilmad LabGlass</td><td>513-7PP-7</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE10</td><td>Equipamento</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;Transdutor de pressão fisiológica&lt;/a&gt;</td><td>Equipamento</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;MLT844&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE50</td><td>Equipamento</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>Seringa micrométrica</td><td>Equipamento</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GS-1101</td><td></td></tr><tr><td>Pinça McPherson</td><td>Equipamento</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-949</td><td></td></tr><tr><td>Microtesoura Castroviejo</td><td>Equipamento</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Condicionador de sinal Neoptix</td><td>Equipamento</td><td>Neoptix, Inc.</td><td>Reflex - 1</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da função cardíaca e energetics em corações isolados rato usando 31 p nmr spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Modelos de ratos bioengenharia tornaram-se ferramentas de pesquisa poderosa para determinar relações causais entre as alterações moleculares e modelos de doença cardiovascular. Embora a biologia molecular é necessário na identificação das alterações-chave na via de sinalização, não é um substituto para o significado funcional. Enquanto fisiologia pode fornecer respostas para a questão da função, fisiologia combinando com a avaliação bioquímica dos metabólitos na intacto, coração batendo permite uma visão completa da função cardíaca e energética. Durante anos, nosso laboratório tem utilizado perfusões coração isolado combinada com espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) para realizar essa tarefa. Função ventricular esquerda é avaliado por Langendorff modo perfusões coração isolado enquanto energética cardíaca é medida através da realização de<sup&gt; 31</sup&gt; P espectroscopia por ressonância magnética dos corações perfundidos. Com essas técnicas, os índices da função cardíaca em combinação com os níveis de fosfocreatina e ATP podem ser medidos simultaneamente em corações batendo. Além disso, estes parâmetros podem ser monitorados enquanto estressores fisiológicos ou patológicos são instituídos. Por exemplo, a isquemia / reperfusão ou protocolos de alto desafio carga de trabalho pode ser adotada. O uso de bandagem aórtica ou outros modelos de patologia cardíaca estão aptos também. Independentemente das variantes dentro do protocolo, o significado funcional e energética de modificações moleculares de modelos de ratos transgênicos pode ser descrito adequadamente, levando a novos insights sobre os caminhos associados enzimática e metabólica. Portanto,<sup&gt; 31</sup&gt; P espectroscopia de RMN no coração isolado perfundido é uma técnica de pesquisa valiosa em modelos animais de doenças cardiovasculares.

Langendorff modo de perfusão do coração isolado, em conjunto com<sup&gt; 31</sup&gt; P espectroscopia de RMN, combina os campos da bioquímica e fisiologia em um experimento. O protocolo permite a medição dinâmica de conteúdo de alta energia de fosfato e volume de negócios no coração ao mesmo tempo em monitorização da função fisiológica. Quando realizada corretamente, esta é uma técnica valiosa na avaliação da energética cardíaca.

Avaliação da função cardíaca e Energetics em Corações Isolados rato Usando 31 P NMR Spectroscopy

Modelos de camundongos bioengenheirados tornaram-se ferramentas de pesquisa poderosas para determinar relações causais entre alterações moleculares e modelos de...

O objetivo geral do seguinte experimento é observar a função cardíaca e a energetica em um coração de camundongo isolado e perfundido. Isso é conseguido por meio da perfusão de um coração de camundongo no modo LOR. Com o tampão Krebs-Henseleit enriquecido com glicose e piruvato como segundo passo, um balão cheio de água é inserido no ventrículo esquerdo ou lv, o que permite o monitoramento contínuo da função cardíaca durante o experimento.Em seguida, o coração é colocado em um tubo de RMN de 10 milímetros e inserido no ímã para avaliar a energetica cardíaca mediante a observação das ressonâncias dos fosfatos de fosfocreatina e de TP e do fosfato inorgânico. Os resultados obtidos demonstram a função e a energetica cardíaca com base nas ondas de pressão do VE e na espectroscopia de fósforo-31 e espectrometria de massas. Olá, sou Steve Kitz, do Centro de Metabolismo Cadre do MIT, do Departamento de Anestesiologia da Universidade de Washington. Hoje vou mostrar um procedimento de perfusão cardíaca isolada combinado com espectroscopia de RMN de 31P.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para avaliar a função cardíaca e a energetica em nossos modelos de camundongos bioengenheirados. Então, vamos começar. Para iniciar este protocolo, prepare um litro de kres, portanto luz ou tampão KH.Introduza bolhas de dióxido de carbono a 5% e oxigênio a 95% na mistura por 10 a 15 minutos. Em seguida, adicione cloreto de cálcio a dois milimolares, seguido pelos substratos, glicose a 10 milimolares e piruvato a 0,5 milimolares. Para esses experimentos, dois sistemas separados são utilizados simultaneamente por aquisição de espectros de P 31.Um ímã BRUER de 14 T é conectado a uma consola avançada de três canais e a um computador equipado com o software Top Spin V 2.1 para avaliação da função cardíaca. Um sistema de perfusão cardíaca personalizado é conectado ao Power Lab. Quatro aquisições de dados de 30.Equipado com o software lab chart PRO six para análise de dados. O aparelho de perfusão cardíaca inclui uma bomba peristáltica mini pulse three controlada por um controlador de bomba STH, utilizada para perfundir o tampão KH no coração. A regulação da temperatura do coração durante o experimento de RMN é crítica. Circuladores aquecidos são usados para manter a temperatura entre 37,0 e 37,5 graus Celsius enquanto o coração está dentro do ímã, e a temperatura é monitorada durante toda a duração do experimento utilizando uma sonda de temperatura de fibra óptica.Durante todo o experimento, a pressão do VE e a pressão de perfusão são monitoradas por meio de transdutores de pressão conectados a um sistema de aquisição de dados e exibidas utilizando o software incluso. Um transdutor fisiológico é usado para monitorar a pressão do VE e um transdutor descartável de pressão sanguínea é usado para monitorar a pressão de perfusão. Por fim, um cordão umbilical é utilizado para fornecer o tampão aquecido e oxigenado ao coração.Uma vez dentro do ímã, antes do início do experimento, calibre os transdutores de pressão com o manômetro padrão do fig momento, primeiro coloque sem pressão no transdutor, para zerar a calibração. Em seguida, inflar este manômetro do modo fig a uma pressão mais alta. Insira este valor no programa do computador.Em seguida, confirme que os transdutores de pressão foram adequadamente calibrados ao inflar este manômetro de fig momento até pressões conhecidas e verificá-las na tela do computador. Após a calibração dos transdutores de pressão, calibre a sonda de RMN com um tubo de RMN de 10 milímetros contendo uma amostra padrão de fosfato de sódio 150 milimolar. Realize a calibração utilizando o programa de software top spin.Primeiro, ajuste a amostra para definir a frequência da ressonância do fósforo. Em seguida, faça o shim da amostra para criar um campo magnético homogêneo. Essa calibração inicial facilita o sinal e reduz o tempo necessário para iniciar o período de aquisição.Uma vez posicionado o coração dentro da sonda para iniciar a extração do coração de camundongo, injete 200 unidades de heparina por via intraperitoneal no camundongo para reduzir a coagulação. Após cinco minutos, administre 175 miligramas por quilograma de pentabarbital de sódio por via intraperitoneal. Quando o camundongo estiver anestesiado, coloque-o de costas e prenda os membros com fita adesiva para expor a região torácica.Realize uma compressão no dedo do pé para garantir que o camundongo está completamente anestesiado. Abra a cavidade peritoneal e o tórax com tesoura e use pinça para afastar a caixa torácica e expor a cavidade torácica. Segure o tecido pulmonar e levante suavemente o coração com tesoura curva.Corte os grandes vasos atrás do coração e continue lentamente em direção à cabeça do camundongo até que o coração esteja livre. Imediatamente, pare o coração em tampão KH gelado. Mantenha os órgãos no gelo e remova rapidamente os pulmões.Identifique os lobos do timo e retire-os cuidadosamente para expor a aorta. Em seguida, remova o timo. Por fim, isole a aorta removendo cuidadosamente qualquer tecido circundante.Usando pin&ccedil;as de sutura microcir&uacute;rgica, segure geralmente ambas as paredes da aorta para expor o l&uacute;men. Em seguida, posicione cuidadosamente a aorta sobre a cânula. Feita de tubo de polietileno com di&acirc;metro externo de 0,965 mil&iacute;metro.Segure a aorta no lugar com um clipe para vasos microscópicos e amarre rapidamente pontos ao redor da aorta. Após o fechamento dos pontos, remova o clipe. Use a pinça para verificar cuidadosamente se a cânula está posicionada acima da raiz aórtica.Adicione quaisquer amarras adicionais necessárias para manter o coração no lugar. Remova qualquer tecido extra usando a pinça e as tesouras microcirúrgicas. Em seguida, faça uma pequena incisão no átrio esquerdo.Segure suavemente o coração e insira cuidadosamente um tubo de polietileno com diâmetro externo de 0,61 milímetro através do átrio esquerdo, da cavidade do ventrículo esquerdo e para fora pelo ápice. Corte o excesso de tubo. Em seguida, insira um balão inflável vazio, preenchido com água, através do átrio até o ventrículo esquerdo.Segure o balão no lugar usando fita adesiva. Em seguida, aumente gradualmente a velocidade da bomba peristáltica para fornecer fluxo suficiente ao coração. Continue a perfundir o coração com tampão KH usando um fluxo constante equivalente a aproximadamente dois mililitros por minuto até que o coração seja colocado na sonda de RMN.Inflar o balão do VE com um pequeno volume utilizando uma seringa micrométrica para verificar se o transdutor de pressão do VE está funcionando para a espectroscopia por RNM. Primeiro, inserir cuidadosamente o coração em um tubo de RNM de 10 milímetros. Um rotor de diâmetro largo é colocado ao redor do tubo de RNM para ajudar a guiar o tubo até a posição correta.No interior da sonda, prenda firmemente todo o aparato ao cordão umbilical com fita adesiva. Em seguida, abaixe lentamente o cordão umbilical na abertura superior do ímã até que o tubo de RMN contendo o coração esteja dentro da bobina da sonda de RMN de 10 milímetros. Uma vez que o coração esteja na posição correta dentro da sonda, ajuste o fluxo da bomba parasita para atingir uma pressão de perfusão de 80 milímetros de mercúrio.Mantenha a pressão de perfusão habilitando o mecanismo de retenção no controlador da bomba. Permita um período de equilíbrio de 15 a 20 minutos para o coração. Durante o período de equilíbrio, ajuste o volume do balão do VE para atingir uma pressão diastólica final de oito a 10 milímetros de mercúrio.Em seguida, otimize os parâmetros do espectrômetro para obter o melhor sinal de fósforo possível. Ajuste o instrumento de RMN definindo o pulso de rádiofrequência, de modo a coincidir com a frequência na qual o núcleo de fósforo ressoa. Em seguida, faça o shim da amostra para tornar o campo magnético homogêneo após o período de equilíbrio.Inicie a aquisição de múltiplos espectros de RMN de P 31. O período de aquisição para cada espectro depende da intensidade do campo magnético, do tamanho da amostra e da relação sinal-ruído necessária para um experimento específico. Neste caso, os espectros são obtidos usando um ímã de 14 teslas, com média do sinal obtido a partir de 256 pulsos de rádiofrequência de 20 microssegundos com um ângulo de giro de 60 graus e intervalos de 2,0 segundos.Este experimento exigirá aproximadamente 10 minutos. Uma medida típica da função cardíaca, a pressão desenvolvida no VE é obtida subtraindo-se a pressão diastólica final ou PDF da pressão sistólica. Em um camundongo C57 black six normal, a pressão desenvolvida no VE é tipicamente entre 100 e 110 milímetros de mercúrio com uma pressão diastólica final fixa de oito a 10 milímetros de mercúrio.Curvas representativas de estilização são mostradas a partir de camundongos controle e com banda aórtica. A função sistólica é representada pela pressão desenvolvida no VE ao longo do aumento dos volumes do VE, conforme determinado pelo volume do balão no VE. A função diastólica é representada pela PPD ao longo do aumento dos volumes do VE.Spectros de RMN de 31P de um coração de camundongo isolado e perfundido fornecem sinais de FOSFOCREATINA ou PCR, dos três fosfatos do ATP e do fosfato inorgânico ou Pi. Aqui, o pico de Pi é relativamente pequeno. Isso é típico de um coração perfundido em condições aeróbicas e suprido com piruvato ou ácidos graxos.Além da glicose durante períodos de isquemia, este pico aumenta enquanto o pico de PCR diminui. Acabei de mostrar como preparar um coração de camundongo para perfusão, de modo que tanto a função cardíaca quanto a energetica possam ser medidas simultaneamente durante o experimento. É importante garantir que o coração seja adequadamente perfundido.Caso contrário, seus dados de RMN não serão confiáveis. É isso aí. Obrigado e boa sorte com seus experimentos.

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