Avaliação da função cardíaca e Energetics em Corações Isolados rato Usando ³¹ P NMR Spectroscopy

O objetivo geral do seguinte experimento é observar a função cardíaca e a energetica em um coração de camundongo isolado e perfundido. Isso é conseguido por meio da perfusão de um coração de camundongo no modo LOR. Com o tampão Krebs-Henseleit enriquecido com glicose e piruvato como segundo passo, um balão cheio de água é inserido no ventrículo esquerdo ou lv, o que permite o monitoramento contínuo da função cardíaca durante o experimento.

Em seguida, o coração é colocado em um tubo de RMN de 10 milímetros e inserido no ímã para avaliar a energetica cardíaca mediante a observação das ressonâncias dos fosfatos de fosfocreatina e de TP e do fosfato inorgânico. Os resultados obtidos demonstram a função e a energetica cardíaca com base nas ondas de pressão do VE e na espectroscopia de fósforo-31 e espectrometria de massas. Olá, sou Steve Kitz, do Centro de Metabolismo Cadre do MIT, do Departamento de Anestesiologia da Universidade de Washington. Hoje vou mostrar um procedimento de perfusão cardíaca isolada combinado com espectroscopia de RMN de 31P.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para avaliar a função cardíaca e a energetica em nossos modelos de camundongos bioengenheirados. Então, vamos começar. Para iniciar este protocolo, prepare um litro de kres, portanto luz ou tampão KH.

Introduza bolhas de dióxido de carbono a 5% e oxigênio a 95% na mistura por 10 a 15 minutos. Em seguida, adicione cloreto de cálcio a dois milimolares, seguido pelos substratos, glicose a 10 milimolares e piruvato a 0,5 milimolares. Para esses experimentos, dois sistemas separados são utilizados simultaneamente por aquisição de espectros de P 31.

Um ímã BRUER de 14 T é conectado a uma consola avançada de três canais e a um computador equipado com o software Top Spin V 2.1 para avaliação da função cardíaca. Um sistema de perfusão cardíaca personalizado é conectado ao Power Lab. Quatro aquisições de dados de 30.

Equipado com o software lab chart PRO six para análise de dados. O aparelho de perfusão cardíaca inclui uma bomba peristáltica mini pulse three controlada por um controlador de bomba STH, utilizada para perfundir o tampão KH no coração. A regulação da temperatura do coração durante o experimento de RMN é crítica. Circuladores aquecidos são usados para manter a temperatura entre 37,0 e 37,5 graus Celsius enquanto o coração está dentro do ímã, e a temperatura é monitorada durante toda a duração do experimento utilizando uma sonda de temperatura de fibra óptica.

Durante todo o experimento, a pressão do VE e a pressão de perfusão são monitoradas por meio de transdutores de pressão conectados a um sistema de aquisição de dados e exibidas utilizando o software incluso. Um transdutor fisiológico é usado para monitorar a pressão do VE e um transdutor descartável de pressão sanguínea é usado para monitorar a pressão de perfusão. Por fim, um cordão umbilical é utilizado para fornecer o tampão aquecido e oxigenado ao coração.

Uma vez dentro do ímã, antes do início do experimento, calibre os transdutores de pressão com o manômetro padrão do fig momento, primeiro coloque sem pressão no transdutor, para zerar a calibração. Em seguida, inflar este manômetro do modo fig a uma pressão mais alta. Insira este valor no programa do computador.

Em seguida, confirme que os transdutores de pressão foram adequadamente calibrados ao inflar este manômetro de fig momento até pressões conhecidas e verificá-las na tela do computador. Após a calibração dos transdutores de pressão, calibre a sonda de RMN com um tubo de RMN de 10 milímetros contendo uma amostra padrão de fosfato de sódio 150 milimolar. Realize a calibração utilizando o programa de software top spin.

Primeiro, ajuste a amostra para definir a frequência da ressonância do fósforo. Em seguida, faça o shim da amostra para criar um campo magnético homogêneo. Essa calibração inicial facilita o sinal e reduz o tempo necessário para iniciar o período de aquisição.

Uma vez posicionado o coração dentro da sonda para iniciar a extração do coração de camundongo, injete 200 unidades de heparina por via intraperitoneal no camundongo para reduzir a coagulação. Após cinco minutos, administre 175 miligramas por quilograma de pentabarbital de sódio por via intraperitoneal. Quando o camundongo estiver anestesiado, coloque-o de costas e prenda os membros com fita adesiva para expor a região torácica.

Realize uma compressão no dedo do pé para garantir que o camundongo está completamente anestesiado. Abra a cavidade peritoneal e o tórax com tesoura e use pinça para afastar a caixa torácica e expor a cavidade torácica. Segure o tecido pulmonar e levante suavemente o coração com tesoura curva.

Corte os grandes vasos atrás do coração e continue lentamente em direção à cabeça do camundongo até que o coração esteja livre. Imediatamente, pare o coração em tampão KH gelado. Mantenha os órgãos no gelo e remova rapidamente os pulmões.

Identifique os lobos do timo e retire-os cuidadosamente para expor a aorta. Em seguida, remova o timo. Por fim, isole a aorta removendo cuidadosamente qualquer tecido circundante.

Usando pinças de sutura microcirúrgica, segure geralmente ambas as paredes da aorta para expor o lúmen. Em seguida, posicione cuidadosamente a aorta sobre a cânula. Feita de tubo de polietileno com diâmetro externo de 0,965 milímetro.

Segure a aorta no lugar com um clipe para vasos microscópicos e amarre rapidamente pontos ao redor da aorta. Após o fechamento dos pontos, remova o clipe. Use a pinça para verificar cuidadosamente se a cânula está posicionada acima da raiz aórtica.

Adicione quaisquer amarras adicionais necessárias para manter o coração no lugar. Remova qualquer tecido extra usando a pinça e as tesouras microcirúrgicas. Em seguida, faça uma pequena incisão no átrio esquerdo.

Segure suavemente o coração e insira cuidadosamente um tubo de polietileno com diâmetro externo de 0,61 milímetro através do átrio esquerdo, da cavidade do ventrículo esquerdo e para fora pelo ápice. Corte o excesso de tubo. Em seguida, insira um balão inflável vazio, preenchido com água, através do átrio até o ventrículo esquerdo.

Segure o balão no lugar usando fita adesiva. Em seguida, aumente gradualmente a velocidade da bomba peristáltica para fornecer fluxo suficiente ao coração. Continue a perfundir o coração com tampão KH usando um fluxo constante equivalente a aproximadamente dois mililitros por minuto até que o coração seja colocado na sonda de RMN.

Inflar o balão do VE com um pequeno volume utilizando uma seringa micrométrica para verificar se o transdutor de pressão do VE está funcionando para a espectroscopia por RNM. Primeiro, inserir cuidadosamente o coração em um tubo de RNM de 10 milímetros. Um rotor de diâmetro largo é colocado ao redor do tubo de RNM para ajudar a guiar o tubo até a posição correta.

No interior da sonda, prenda firmemente todo o aparato ao cordão umbilical com fita adesiva. Em seguida, abaixe lentamente o cordão umbilical na abertura superior do ímã até que o tubo de RMN contendo o coração esteja dentro da bobina da sonda de RMN de 10 milímetros. Uma vez que o coração esteja na posição correta dentro da sonda, ajuste o fluxo da bomba parasita para atingir uma pressão de perfusão de 80 milímetros de mercúrio.

Mantenha a pressão de perfusão habilitando o mecanismo de retenção no controlador da bomba. Permita um período de equilíbrio de 15 a 20 minutos para o coração. Durante o período de equilíbrio, ajuste o volume do balão do VE para atingir uma pressão diastólica final de oito a 10 milímetros de mercúrio.

Em seguida, otimize os parâmetros do espectrômetro para obter o melhor sinal de fósforo possível. Ajuste o instrumento de RMN definindo o pulso de rádiofrequência, de modo a coincidir com a frequência na qual o núcleo de fósforo ressoa. Em seguida, faça o shim da amostra para tornar o campo magnético homogêneo após o período de equilíbrio.

Inicie a aquisição de múltiplos espectros de RMN de P 31. O período de aquisição para cada espectro depende da intensidade do campo magnético, do tamanho da amostra e da relação sinal-ruído necessária para um experimento específico. Neste caso, os espectros são obtidos usando um ímã de 14 teslas, com média do sinal obtido a partir de 256 pulsos de rádiofrequência de 20 microssegundos com um ângulo de giro de 60 graus e intervalos de 2,0 segundos.

Este experimento exigirá aproximadamente 10 minutos. Uma medida típica da função cardíaca, a pressão desenvolvida no VE é obtida subtraindo-se a pressão diastólica final ou PDF da pressão sistólica. Em um camundongo C57 black six normal, a pressão desenvolvida no VE é tipicamente entre 100 e 110 milímetros de mercúrio com uma pressão diastólica final fixa de oito a 10 milímetros de mercúrio.

Curvas representativas de estilização são mostradas a partir de camundongos controle e com banda aórtica. A função sistólica é representada pela pressão desenvolvida no VE ao longo do aumento dos volumes do VE, conforme determinado pelo volume do balão no VE. A função diastólica é representada pela PPD ao longo do aumento dos volumes do VE.

Spectros de RMN de 31P de um coração de camundongo isolado e perfundido fornecem sinais de FOSFOCREATINA ou PCR, dos três fosfatos do ATP e do fosfato inorgânico ou Pi. Aqui, o pico de Pi é relativamente pequeno. Isso é típico de um coração perfundido em condições aeróbicas e suprido com piruvato ou ácidos graxos.

Além da glicose durante períodos de isquemia, este pico aumenta enquanto o pico de PCR diminui. Acabei de mostrar como preparar um coração de camundongo para perfusão, de modo que tanto a função cardíaca quanto a energetica possam ser medidas simultaneamente durante o experimento. É importante garantir que o coração seja adequadamente perfundido.

Caso contrário, seus dados de RMN não serão confiáveis. É isso aí. Obrigado e boa sorte com seus experimentos.