Name: Indução transuretral de rato infecção urinária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a induzir infecção urinária transuretral em camundongos para estudos de microbiologia e doenças infecciosas. Este método permite quantificar colonias bacterianas em amostras de urina e tecidos renais.

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Os autores gostariam de agradecer Shelly Xie e Jennifer Payne por sua assistência técnica especializada. Este trabalho foi possível através de doações da Sociedade de Urologia Pediátrica e do Fundo de Investigação Pediátrica Stanford.

I. Elaboração de cateteres uretrais <ol><li> Para cada bexiga e rim do rato a amostrar, coloque 5-6 grânulos de aço inoxidável (bexiga, 1,6 mm ou tamanho 0,9-2,0 mistura mm) ou grânulos de óxido de zircônio (rim, tamanho 0,5 mm) em um tubo de cryovial, respectivamente. Autoclave os tubos contendo talão. </li><li> Após os tubos esfriarem até a temperatura ambiente, adicionar 200 microlitros de PBS estéril a cada tubo de aço inoxidável contendo talão e 400 microlitros de PBS estéril a cada tubo de óxido de zircônio contendo talão. </li><li> Nós preparamos cateteres uretrais, como descrito por Hung e Hultgren 13. Autoclave um par limpo de flat-cabeça pinças e tesouras finas (íris ou tipo similar) e permitir que os instrumentos para esfriar a temperatura ambiente. Limpe as superfícies de uma capela de fluxo laminar com etanol 70%. Na capa, corte um segmento de 30 centímetros (aproximado) de tubos de polietileno. Assepticamente colocar uma agulha estéril 30 (meia polegada longa agulha) em uma seringa estéril cc 3. Pegue uma das extremidades do tubo de polietileno de corte com a pinça autoclavado e deslize o tubo na agulha até encontrar o hub. Cortar o tubo de modo que cerca de 2 centímetros se estende além da ponta da agulha. Remover o cateter da seringa e colocar em uma placa de Petri estéril. </li><li> Para reduzir a probabilidade de contaminação cruzada, fazemos um cateter para cada rato. Depois de todos os cateteres são feitos, esterilizá-los pela exposição em uma placa de Petri descoberto à radiação UV por pelo menos 30 minutos. Não olhe diretamente para as lâmpadas UV ou expor qualquer parte do corpo no capô enquanto as lâmpadas são ativadas. Após a exposição UV, os cateteres podem ser armazenados a longo prazo na placa de Petri. Recomendamos selando o prato com Parafilm para ajudar a manter a esterilidade. </li></ol> II. Inoculação em animais <ol><li> Ratos deve chegar pelo menos uma semana antes da manipulação experimental, a fim de evitar o stress induzido por fatores de confusão. Camundongos fêmeas são usados ​​porque a uretra masculina do mouse é extremamente difícil de cateterização. CBA / J é um comumente utilizados, UTI suscetíveis à tensão do mouse puras. Camundongos devem ser usados ​​entre 8 e 12 semanas de idade, uma vez que esta é a janela imunológica de maturidade antes da senescência. No primeiro dia do experimento, mergulhe o fim de um ciclo estéril da inoculação em um frasco de estoque de bactérias congeladas. Desenterrar um inóculo pequenos e fora de raia em uma placa de ágar apropriado. Geralmente, uropathogenic E. coli (UPEC) e de outras variedades podem ser cultivadas durante a noite em Luria-Bertani agar (LB) a 37 ° C no ar ambiente. Cepas UPEC crescer como sólido, branco-amarelada translúcida colônias em ágar LB. Devolver imediatamente o estoque de bactérias para o freezer. Cepas bacterianas uropathogenic pode tornar-se menos virulento ao longo do tempo com repetidas, as culturas de série. Por isso, recomendamos listando fora uma placa de agar fresco para cada experimento. </li><li> No dia 2 do experimento, após a confirmação de morfologia das colônias adequada, pick colônias única a partir de placas de ágar e colocar em pelo menos 5 cc caldo de cultura durante a noite. LB pode ser usado para cepas mais uropathogenic bacteriana (37 ° C, 200 rpm no ar ambiente). Mantenha as tampas soltas sobre os tubos de caldo de cultura para permitir a aeração. </li><li> No dia 3 do experimento, tomam 10% do caldo da cultura primeira e cultura em caldo novamente durante a noite (tipicamente 37 ° C e 200 rpm), para aumentar a expressão do tipo I pili. Culturas caldo Serial ajudar a otimizar uropathogenicity bacteriana, uma vez que pili tipo I tem se mostrado um fator de virulência essencial para uropatógenos in vivo 1. Mantenha as tampas soltas sobre os tubos de caldo de cultura para permitir a aeração. </li><li> No dia 4 do experimento, medir o OD 600 da cultura caldo do dia 3. Se não já conhecidos para a cepa bacteriana que está sendo testado, executar dez vezes à diluição em série ao longo de pelo menos 7 logs (diluições realizadas com PBS, as culturas realizadas em ágar LB, 37 ° C durante a noite de incubação) para determinar a relação entre OD e 600 ufc / ml. Como regra geral, um OD 600 de 0,4-0,5 geralmente corresponde a 1-2x10 7 ufc por 50 microlitros. Uma vez que a relação entre OD e 600 ufc / ml foi determinado, pode-se ajustar o caldo de cultura para o OD 600 correspondente ao ufc desejado por rato em 50 microlitros de PBS. Alguns trabalhos sugerem que a inoculação de 10 microlitros, em vez de 50, leva a uma menor refluxo para o kidneys6. No entanto, a maioria das publicações têm relatado o uso de 50 microlitros por mouse. Geralmente, os intervalos ufc desejado entre 10 6 e 108 ufc / mouse, mas cada combinação estirpe bacteriana / mouse precisa ser empiricamente testado in vivo. </li><li> Para ajudar a garantir que inóculos não são anulados imediatamente após a instilação, os ratos deveriam ser privados de água por pelo menos 30 minutos antes da indução da anestesia geral. Outra manobra fundamental é induzir esvaziamento antes da indução da anestesia por scruffing ratos e pressionando suavemente a parte inferior abdomen. Dois a 2,5% do isoflurano é uma dose segura para a indução 8-12 semanas de idade camundongos fêmeas CBA, seguido de anestesia de manutenção com 1,8-2% isoflurano. </li><li> Uma vez que a anestesia é alcançado, os ratos são colocados em posição supina com a cabeça inserido em um cone de nariz ligado ao isoflurano contendo oxigênio. Parte inferior do abdome é massageado para evacuar a urina da bexiga. Se a bexiga está relativamente vazio, esta manobra pode não produzir urina. Parte inferior do abdómen e do períneo é embebido com álcool 70%. </li><li> Uma seringa estéril 1 cc sem agulha é usada para elaborar o inóculo desejado bacteriana. Em seguida, um cateter uretral estéril é colocado assepticamente na seringa. A tubulação em excesso é cortar o cateter com uma tesoura de modo que somente 1-2 milímetros de tubos permanecem distal à ponta da agulha. Em seguida, a seringa é aproveitado eo êmbolo deprimido com a seringa na posição vertical para remover todas as bolhas. Um montão de lubrificante bacteriostático geléia é esguichou em uma placa de Petri estéril ou o interior do invólucro seringa estéril. A ponta do cateter (com seringa em anexo) é mergulhado na geléia. Se múltiplas cepas bacterianas estão sendo testados no mesmo experimento, tenha cuidado para não usar a mesma queda de geléia para lubrificar cateteres contendo diferentes cepas. </li><li> Usando um microscópio estéreo (0,8 x a faixa de zoom 5x) para ampliação, o capuz do clitóris do mouse anestesiados é gentilmente agarrou na mão não-dominante com um par de pinças de dentes finos e levantou cefálica para expor o fundo rosa meato uretral ( Figura 1). A seringa (com cateter em anexo) é agarrado na mão dominante, com um aperto de lápis ea ponta do cateter está envolvida no meato uretral em um ângulo de 45 graus. O capuz do clitóris é esticada ao longo do eixo da seringa, de forma eficaz "loading" a uretra para o cateter. Esta manobra é essencial, pois a uretra do mouse é redundante. O cateter deve deslizar facilmente para a bexiga (até o hub, Figura 2), e pode ser gentilmente girou para ajudar a navegar as dobras redundantes da uretra. Uma vez que o cateter é hub, a seringa pode ser reduzida até que esteja paralela com o longo eixo do mouse. A mão não-dominante pode soltar o fórceps para ajudar a estabilizar a posição do cateter e seringa como a mão dominante é utilizada para injectar lentamente o inóculo (pelo menos 5 segundos). Se o líquido é visto fluindo ao redor do cateter durante a injeção, seja a bexiga está cheia ou o cateter é na vagina (apenas caudal para a uretra). Injecção deve ser imediatamente interrompido e da posição do cateter cuidadosamente examinada. Se o cateter foi na uretra, o rato dado não deve ser incluído no experimento. Por outro lado, um cateter extraviado na vagina pode ser reposicionada ea injeção re-tentada. Após a injeção, o cateter ea seringa é lentamente retirado do mouse. </li><li> Para reduzir a probabilidade de esvaziamento pós-inoculação precoce, o que pode evacuar bactérias administrados e, assim, levar a níveis de infecção variável, alguns investigadores manter ratos sob anestesia por 30 minutos após inoculation10 transuretral. Após a cirurgia, os ratos deve se recuperar em um cobertor aquecimento limpo, com observação contínua para confirmar retorno dos padrões normais de respiração e atividade. Uma vez que os animais se recuperaram totalmente a capacidade de engatinhar, que podem ser devolvidos à cama contendo gaiolas. </li></ol> III. CFU medição em tecido infectado <ol><li> Publicações diversas do mouse UTI relataram os resultados de cultura de 6 horas para uma semana ou mais após a inoculação. O tempo ideal pontos precisam ser determinadas empiricamente para cada combinação estirpe bacteriana / mouse. Urina anulada é obtido para a cultura por scruffing do mouse sobre uma placa de Petri estéril. Urina colhida deve ser mantida no gelo em todos os momentos. Várias tentativas para obter urina anulado durante muitas horas pode ser necessária, uma vez anular mouse é volume, freqüência baixa (3-10 microlitros por void), e estresse-dependente. </li><li> Depois de obter amostras de urina anulada, nos sacrificamos camundongos usando isoflurano e deslocamento cervical. O abdômen é assepticamente aberto. Se uma amostra de urina anulado não foi obtida com sucesso anteriormente, uma pequena quantidade de urina muitas vezes pode ser aspirado através da parede da bexiga usando uma agulha de calibre 30 e seringa. </li><li> Um ou ambos os rins são removidos, picadas em pelo menos 4 peças (cada peça deve ser inferior a 50 microgramas) em uma placa de Petri estéril e colocados em cordão de zircônio / PBS contendo criotubos no gelo. A bexiga é removida, picada em pelo menos 4 peças, e colocados em cordão de aço inoxidável / PBS contendo criotubos no gelo. O tecido / grânulo / PBS contendo criotubos são colocados em um homogeneizador de bala Blender e os tecidos são homogeneizados usando o "8" configuração de velocidade durante um minuto. É comum que alguns fragmentos de tecido para permanecer após homogeneização. Enquanto 5-10 microlitros de homogeneizado de líquido pode ser pipetado, fragmentos sólidosnão são necessariamente um problema. Se o tempo de homogeneização é o aumento de algumas amostras, é fundamental para fazê-lo para todos os tecidos, a fim de manter a consistência de homogeneização. Nós utilizamos uma bala Blender homogeneizador porque evita a possibilidade de contaminação cruzada, é mais rápido do que o processamento de amostras individuais um a um, usando um homogeneizador padrão, e não de forma significativa de calor as amostras sendo homogeneizado. </li><li> Pelo menos dois ou três de dez diluições de urina coletados e homogeneizados de tecido deve ser feita em uma placa de microtitulação. Para experimentos preliminares, pode ser prudente para fazer pelo menos sete de dez diluições. Cultura até 100 microlitros de urina, da bexiga e / ou homogeneizados de rins em ágar apropriado. Uma vez que as amostras de urina podem ser de volume limitado, pode ser necessário para trazer os seus volumes de 100 microlitros antes de realizar dez diluições. Se esta for necessária, a diluição inicial (antes de dez vezes diluição) terão de ser tidos em conta os cálculos finais de rendimentos bacteriana. Nós preferimos UPEC cultura em eosina-azul de metileno ou agar MacConkey (incubação overnight a 37 ° C), uma vez que estes meios são seletivos para os organismos Gram negativos. Cepas UPEC crescer em agar MacConkey como central umbilicadas, vermelho-rosa colônias devido à sua capacidade para fermentar lactose. </li><li> Depois de cultura durante a noite, contar o ufc para cada prato. Para amostras diluídas em série, a diluição placa contendo 50-100 colônias é considerada a contagem mais precisa. "Voltar" calcular ufc por tecidos, por miligrama de tecido, ou por ml. </li></ol> IV. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Meato uretral (tecido rosa escuro) expostos, levantando capuz do clitóris cefálica com o fórceps (além topo da foto) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cateterizada uretra. O clitóris bífido pode ser visto logo acima do cateter. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Bexiga ufc conta dois dias após a infecção transuretral de 8 semanas de idade do sexo feminino camundongos CBA / J com uropathogenic E. coli. Bexigas foram homogeneizadas e ufc / ml determinada pela diluição em série em ágar MacConkey. Diamantes indicam ufc / ml para camundongos individual, barra horizontal indica ufc mediana / ml.

<ol><li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li>
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<li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
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<li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li>
<li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Indução de rato infecção do trato urinário por inoculação de bactérias transuretral é um procedimento estabelecido há muito tempo, mas tecnicamente exigente 11. Hung e Hultgren publicou recentemente uma excelente revisão das técnicas de ressecção transuretral de mouse infecção do trato urinário 13. Neste trabalho, tentamos ilustrar ainda mais os pontos mais delicados desta abordagem experimental. Novatos podem praticar a sua técnica através da realização de uma laparoto...

<table><tbody><tr><td>Tubos crioviais, 2,0 ml de polipropileno (sem tampas)</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>Tampas para tubos crioviais, com anel &amp;rsquo;O&amp;rsquo;</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Contas de óxido de zircônio (0,5 mm)</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Contas de aço inoxidável (1,6 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de contas de aço inoxidável (0,9-2,0 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos CBA/J, fêmeas com 8-12 semanas de idade</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4,3 mM, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1,4 mM)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>Ágar LB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caldo LB</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Isóflurano (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>Alças de inoculação</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>Pó de ágar eosina-azul de metileno (EMB)</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pó de ágar MacConkey</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>Pó de ágar LB</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno não radiopaco Intramedic, PE10 [diâmetro interno 0,28 mm (0,011 polegada); diâmetro externo 0,61 mm (0,024 polegada)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de 30 gauge, 1/2 polegada</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Seringa tuberculina de 1 ml com ponta deslizante (Slip-Tip)</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer-Lock de 3 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

indução transuretral de rato infecção urinária

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Cepas bacterianas uropathogenic de interesse são cultivadas em ágar. Geralmente uropathogenic,<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) e de outras variedades podem ser cultivadas durante a noite em Luria-Bertani (LB) ágar a 37 ° C no ar ambiente. Cepas UPEC crescer como branco-amarelada translúcida colônias em ágar LB. Após a confirmação da morfologia da colônia apropriado, colônias individuais são, então, escolhido para ser cultivado em caldo. LB pode ser usado para cepas mais uropathogenic bacteriana. Dois serial, culturas caldo LB noite pode ser empregada para aumentar a expressão do pili tipo I, um fator de virulência bem definidos para as bactérias uropathogenic. Culturas caldo são diluídos para a concentração desejada em tampão fosfato salino (PBS). De oito a 12 semanas de idade camundongos fêmeas são colocadas sob anestesia com isoflurano e transurethrally inoculadas com bactérias usando tubos de polietileno coberta de 30 seringas de calibre. Inóculos típico, que deve ser determinado empiricamente para cada combinação estirpe bacteriana / mouse, são 10<sup&gt; 6</sup&gt; A 10<sup&gt; 8</sup&gt; Ufc por rato em 10 a 50 microlitros de PBS. Após o período de infecção desejado (um dia a várias semanas), amostras de urina e da bexiga e os rins são colhidos. Cada órgão é picada, colocados em PBS e homogeneizadas em um homogeneizador de bala azul. Homogeneizados de urina e tecido são serialmente diluída em PBS e cultivadas em ágar apropriado. No dia seguinte, as unidades formadoras de colónias são contadas.

Este vídeo vai demonstrar os métodos para induzir transurethrally infecções do trato urinário do mouse e quantificar a extensão das infecções resultantes.

Indução transuretral de rato infecção urinária

As cepas bacterianas uropatogênicas de interesse são cultivadas em ágar. Geralmente, a *E. coli* uropatogênica (UPEC) e outras cepas podem ser cultivadas durante a noite em ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir infecção do trato urinário em camundongos por via transuretral. Isso é realizado primeiramente cultivando cepas bacterianas de interesse e diluindo os cultivos até a concentração desejada. O segundo passo do procedimento consiste em inocular transuretralmente a bexiga do camundongo com as cepas bacterianas de interesse.O terceiro passo do procedimento é coletar amostras de urina e obter rins e bexigas. O passo final do procedimento é a inoculação de placas de ágar com urina e amostras homogeneizadas de rim e bexiga. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram infecção bem-sucedida do trato urinário com base na presença de colônias bacterianas nas amostras cultivadas.Olá, eu sou Michael Shea e bem-vindo ao meu laboratório do Departamento de Urologia da Escola de Medicina da Universidade de Stanford. Eu sou Annu ti, também do laboratório Shea. Hoje vamos mostrar um procedimento de cateterização transuretral em camundongos.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a indução de infecção do trato urinário em camundongos. Vamos começar. Em uma capela de fluxo laminar, corte um segmento de tubo de polietileno com 30 centímetros de comprimento e fixe uma agulha de calibre 30 em uma seringa estéril de três centímetros cúbicos.Use pin&ccedil;as est&eacute;reis para pegar uma extremidade do tubo cortado e deslize-o sobre a agulha at&eacute; alcan&ccedil;ar o cubo. Corte o tubo de modo que aproximadamente dois cent&iacute;metros se estendam al&eacute;m da ponta da agulha. Isso ajuda a prevenir les&otilde;es em camundongos durante a cateteriza&ccedil;&atilde;o.Remova o cateter da seringa e coloque-o em uma placa de Petri estéril. Prepare um cateter para cada camundongo a ser infectado. Esterilize os cateteres com irradiação ultravioleta por pelo menos 30 minutos.Selar uma placa com perfil para manter o cateter estéril durante o armazenamento de longo prazo. Semear uma placa de ágar apropriada com um inóculo de estirpe bacteriana congelada de interesse. Aqui, um inóculo de Escherichia coli uropatogênica ou UPEC é repicado para crescimento noturno a 37 graus Celsius.Escolha colônias isoladas com a morfologia adequada, que no caso de UPEC são colônias sólidas, amareladas e translúcidas em ágar LB, e coloque-as em pelo menos cinco mililitros de caldo líquido para cultura noturna a 37 graus Celsius com agitação a 200 rotações por minuto. Adicione 10% da primeira cultura em caldo a um meio fresco e cultive durante a noite. Novamente, para realçar a expressão de pili tipo 1, associada à patogênese de UPEC in vivo, meça a OD 600 da cultura para determinar o número de unidades formadoras de colônias.UFC abreviada por mililitro de cultura. Dilua a cultura com PBS estéril de modo que a concentração final esteja entre 10 à sexta e 10 à oitava UFC em 10 a 50 microlitros, para garantir que as inocular não sejam eliminadas imediatamente. Após a instalação, prive os camundongos de água por 30 minutos antes da anestesia, segure o camundongo pelo dorso e pressione suavemente o abdômen inferior para estimular a micção.Coloque o camundongo anestesiado em decúbito dorsal com a cabeça inserida em um cone nasal conectado ao isoflurano contendo oxigênio. Massageie o abdômen para esvaziar qualquer urina remanescente da bexiga. Utilize um frasco com pulverizador para umedecer o abdômen inferior e o períneo com etanol a 70%.Em seguida, utilize uma seringa estéril de um mililitro para aspirar o inóculo bacteriano. Fixe um cateter estéril preparado na seringa. Use uma tesoura para cortar o tubo, de modo que ele se estenda apenas um a dois milímetros além da ponta da agulha.Isso ajuda a prevenir lesões em camundongos durante a cateterização; bata levemente na seringa e pressione o êmbolo. Para remover bolhas de ar, lubrifique o cateter mergulhando-o em uma pequena quantidade de gel lubrificante bacteriostático. Certifique-se de usar uma quantidade distinta de gel para cada cepa bacteriana que será testada sob um microscópio estereoscópico dissecante.Use uma pin&ccedil;a de dentes finos na m&atilde;o n&atilde;o dominante para segurar suavemente o capuz clitoriano e levant&aacute;-lo, expondo a ATU uretral rosa-avermelhada na m&atilde;o dominante. Segure a seringa com o cateter acoplado. Com um aperto semelhante ao de um l&aacute;pis, introduza a ponta do cateter na ATU uretral em um &acirc;ngulo de 45 graus em rela&ccedil;&atilde;o ao abd&ocirc;men do camundongo.No plano sagital mediano. Estique a prepuce clitoriana ao longo do eixo longo da seringa. Carregue efetivamente a uretra no cateter.O cateter deve deslizar facilmente para dentro da bexiga, se necessário. Gire suavemente o cateter para ajudar a navegar pelas dobras redundantes da uretra. Quando o cateter estiver posicionado até a base, abaixe a seringa paralelamente ao abdômen do camundongo.Solte a pin&ccedil;a e use a m&atilde;o n&atilde;o dominante para estabilizar o cateter e a seringa. Injete lentamente o in&oacute;culo durante pelo menos cinco segundos. Se for observado fluxo de l&iacute;quido ao redor do cateter durante a inje&ccedil;&atilde;o, a bexiga est&aacute; cheia ou o cateter est&aacute; na vagina.Interrompa a injeção e examine a posição do cateter. Reposicione o cateter na uretra, se necessário. Após a injeção, retire lentamente o cateter.Mantenha o camundongo sob anestesia por meia hora após a inoculação. Para reduzir o risco de micção após a cirurgia, permita que o camundongo se recupere sobre uma manta térmica limpa, com observação contínua para confirmar o retorno de padrões normais de respiração e atividade. Uma vez completamente recuperado, com a capacidade de rastejar, devolva o camundongo a uma gaiola contendo cama.Dependendo da combinação de cepas bacterianas e de camundongos, pode levar entre seis horas e uma semana para que ocorra uma infecção completa. Para o procedimento, coloque uma placa de Petri estéril sobre gelo para cada camundongo infectado ao longo de várias horas. Segure o camundongo pelo dorso sobre a placa para coletar urina para cultura.50 microlitros de urina devem ser suficientes. Pipete a urina para um tubo de microcentrífuga, tampe-o e mantenha a urina sobre gelo. Sob o microscópio estereoscópico, posicione um camundongo eutanasiado em decúbito dorsal sobre uma bandeja de dissecação.Pulverize o abdômen com etanol 70%. Use uma tesoura para fazer uma incisão de três a quatro centímetros na pele e na parede abdominal subjacente. Se necessário, use pinças para retrair a parede abdominal longe do conteúdo abdominal.Se tentativas anteriores de coleta de urina não tiverem sido bem-sucedidas, utilize uma agulha de 30 gauge e uma seringa para aspirar a urina diretamente através da parede da bexiga. Use pinça e tesoura para remover os rins. Transfira-os para uma placa de Petri estéril e pique cada um em pelo menos quatro pedaços, com aproximadamente dois a três milímetros de tamanho cada.Transfira cada fragmento renal para um tubo criogênico contendo cinco a seis esferas estéreis de óxido de zircônio de 0,5 milímetros e 400 microlitros de PBS estéril. Mantenha as amostras de rim em gelo. Utilize pinça e tesoura para remover a bexiga.Pique a bexiga usando o mesmo método que para os rins. Transfira cada fragmento da bexiga para um tubo criogênico contendo esferas de aço inoxidável de 1,6 milímetro e 200 microlitros de PBS estéril e mantenha os tubos sobre gelo. Coloque os tubos no homogeneizador de alta velocidade (bullet blender) e homogeneíze o tecido na velocidade oito por pelo menos um minuto.É comum que alguns fragmentos de tecido permaneçam após a homogeneização. Todas as amostras devem ser homogeneizadas pelo mesmo período de tempo em uma placa de microtitulação. Faça diluições seriadas de dez vezes da urina coletada e do homogeneizado de tecido com gelo.Disseminação em PBS frio. A diluição finalizada. Placas apropriadas com agente seletivo são incubadas durante a noite a 37 graus Celsius.A UFC por órgão, miligrama de tecido ou mililitro de urina pode ser calculada retroativamente a partir do número de colônias em cada placa. Temos utilizado essas técnicas para estudar como mutações nas respostas bacterianas ao estresse afetam a capacidade da UPEC de causar ITU in vivo, bem como de resistir a antibióticos administrados a camundongos infectados. Esta tabela mostra a capacidade do tipo selvagem de UPEC de infectar a bexiga do camundongo após a inoculação transuretral.Acabamos de mostrar como induzir infecções do trato urinário transversalmente em camundongos. Ao realizar este procedimento, é importante cateterizar os camundongos com delicadeza. A técnica adequada está associada a uma cateterização fácil, mas pode exigir prática.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Luyts, N., et al. Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando imagem por bioluminescência. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra a indução e o rastreamento da infecção do trato urinário em um modelo camundongo usando E. coli bioluminescente injetada na bexiga, onde ocorrem adesão, invasão bacteriana e replicação intracelular. A luz emitida pelo operon bioluminescente serve como marcador em tempo real da carga bacteriana durante a...

Visualização da Infecção do Trato Urinário em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Fonte: Conover, M. S., et al., J. Estabelecimento e Caracterização de ITU e CAUTI em um modelo de camundongo. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o procedimento para montar e implantar um cateter transuretral em uma camundonga, seguido pela inoculação bacteriana para estabelecer infecção urinária associada ao cateter e investigar interações hospedeiro-patógeno mediadas por biofilme.

Infecção do Trato Urinário Associada a Cateter em um Modelo de Camundongo

Fonte: Conover, M. S. et al., Estabelecimento e Caracterização de ITU e CAUTI em um Modelo de Camundongo. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra a detecção de comunidades bacterianas intracelulares (IBCs) em tecido bexiga de camundongos infectados com Escherichia coli que expressa β-galactosidase. Após fixação tecidual, permeabilização e coloração com X-gal, os IBCs aparecem como pontos azuis sob um microscópio dissecante, confirmando a invasão bacteriana durante infecção urinária.

Visualizando Comunidades Bacterianas Intracelulares em uma Bexiga de Camundongo Infectada

Neste vídeo, descrevemos a técnica de administração intravesical de bactérias uropatogênicas para gerar um modelo de infecção do trato urinário em camundongos. Este modelo pode ser usado para entender a disseminação da infecção bacteriana uropatogênica no sistema urinário e os mecanismos que determinam a suscetibilidade à ITU.

Modelo de Geração de Infecção do Trato Urinário: Uma Técnica para Administrar Bactérias Uropatogênicas em Camundongos para Desenvolver Modelo de Infecção do Trato Urinário

Este vídeo demonstra o estabelecimento da infecção uropatogênica por Escherichia coli em uma bexiga de camundongo fêmea por meio de instilação de cateter transuretral. As bactérias injetadas estabelecem com sucesso uma infecção do trato urinário dentro da bexiga, fornecendo uma plataforma valiosa para estudar doenças associadas à saúde relacionadas ao trato urinário.

Cateterismo transuretral e inoculação bacteriana para gerar um modelo de infecção do trato urinário em camundongos machos

Estabelecimento de um Modelo de Infecção do Trato Urinário em Camundongos Fêmeas

A capacidade de modelar infecções do trato urinário (ITU) é crucial para poder entender a patogênese bacteriana e gerar o desenvolvimento de novas terapêuticas. O objetivo deste trabalho é demonstrar modelos de camundongos de ITU experimental e ITU associada a cateter que recapitulam e predizem achados observados em humanos.

Criação e Caracterização da UTI e CAUTI em um modelo de rato

O modelo estabelecido de transuretral cateterismo de ratos permite o estudo das patologias de bexiga, incluindo a infecção do trato urinário, mas só pode ser realizado nas fêmeas. Um novo modelo de instilação transuretral masculino, apresentado aqui, permitirá a pesquisa em uma área marcada por fortes diferenças clínicas e epidemiológicas entre os sexos.

Infecção do trato urinário em um modelo Animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas

Instilação transuretral é um procedimento desafiador e não tem sido bem descrita na literatura. O objetivo deste manuscrito é descrever uma técnica transuretral inserção de um cateter para entrega intravesical de líquidos com substâncias activas para a bexiga urinária e/ou próstata em ratos machos adultos.

Procedimento de instilação transuretral no rato adulto masculino

Um modelo de camundongos de uropatogenic E. coli (UPEC) inoculação transuretral para estabelecer reservatórios de bexiga intracelular latente e subsequente exposição à bexiga a G. vaginalis para induzir a UTI UPEC recorrente é demonstrado. Também são demonstradas a enumeração de bactérias, citologia urinária, e fixação e processamento in situ bexiga para a varredura de microscopia eletrônica.

Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos

Este manuscrito descreve a administração intravesical de bactérias uropatômicas com um operon lux para induzir uma infecção do trato urinário em camundongos e posterior análise longitudinal in vivo da carga bacteriana usando imagens de bioluminescência.

Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando bioluminescência imagem

Aprenda a induzir infecção urinária transuretral em camundongos para estudos de microbiologia e doenças infecciosas. Este método permite quantificar colonias bacterianas em amostras de urina e tecidos renais.

Indução transuretral de rato infecção urinária

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