Resposta celular ao vivo para Estimulação mecânicas estudadas por Microscopia de Força Atômica e Óptica Integrada
4 de outubro de 2010
Este trabalho tem como objetivo instruir o leitor na operação de um sistema integrado de força atômica-microscópio óptico de imagem para a estimulação mecânica de células vivas em cultura. Um protocolo passo a passo é apresentado. Um representante conjunto de dados que mostra a resposta de células vivas ao estímulo mecânico é apresentado.
O estudo da resposta celular em tempo real à estimulação mecânica é realizado pelas primeiras células em crescimento expressando proteínas de fusão GFP em placas de fundo de vidro por 24 horas. O segundo passo é revestir a ponta A FM com fibronectina biotinilada. Em seguida, a ponta de FM funcionalizada é colocada em contato com a superfície celular para permitir que uma forte adesão focal se forme ao redor da ponta de A FM, permitindo a manipulação direta do citoesqueleto de ação por meio de uma ligação de actina de integrina de matriz entre a ponta revestida de fibronectina e a célula.
A etapa final é estimular mecanicamente a célula viva pelo movimento ascendente controlado da ponta A FM, de modo que a força vertical seja aplicada no ponto de contato da célula sem quebrar a forte adesão focal. Em última análise, os resultados mostram que as células respondem à estimulação mecânica reforçando sua ligação ao substrato e induzindo a reorganização do citoesqueleto de actina, conforme registrado com imagens ópticas de fluorescência em tempo real. Olá, sou Andrea Trake, professora assistente do Departamento de Biologia de Sistemas e Medicina Translacional do Texas a and m Health Science Center.
Olá, sou Sum Lim. Sou pós-doutoranda no Departamento de Biologia de Sistemas e Medicina Translacional do Texas a e m Health Science Center. Hoje mostraremos um procedimento para estudar a remodelação celular adaptativa à estimulação mecânica.
Usamos esse procedimento em nosso laboratório para investigar a remodelação do citoesqueleto em tempo real em células musculares lisas vasculares vivas. Então, vamos começar. Para esses estudos, é utilizado um microscópio Olympus IX 81 invertido com fluorescência de reflexão interna total ou fixação de grama combinada com um cabeçote de varredura CSU 22 Yokogawa.
Um microscópio de força atômica SZ bioscope é montado na parte superior do microscópio óptico invertido. Todo o sistema é montado em uma mesa óptica de grau de pesquisa e foi descrito anteriormente em detalhes. Este microscópio integrado usa dois dispositivos acoplados de carga de multiplicação de elétrons EM ou câmeras EMCD.
Um é para imagens de grama e o outro para imagens confocais. O conjunto confocal, que é composto pela roda de filtro externo do scanner de disco giratório e uma câmera EMCD, é montado em uma placa de base de alumínio colocada em cima de uma almofada de silicone necessária para o amortecimento de vibrações. Todo o conjunto confocal se conecta ao microscópio por meio de um flange com um colar rosqueado.
Assim, o conjunto pode ser desacoplado do microscópio durante a microscopia de força atômica ou medições FM para evitar a vibração do scanner de disco giratório. Um laser de criptônio de argônio é usado como fonte de excitação para os modos de imagem confocal e de grama. O laser pode ser acoplado a qualquer uma das duas fibras ópticas, que entregam o laser ao acessório de grama ou ao cabeçote de varredura confocal.
Dois, os computadores controlam o sistema. Um utiliza o software de livro de slides, que controla a imagem óptica e o outro software de nano escopo, que controla o A FM 24 horas antes do experimento de estimulação mecânica colocado células vivas expressando construções GFP direcionadas contra proteínas específicas em uma placa de cultura de células com fundo de vidro. No dia do experimento, substituir o meio de cultura celular por meio livre de vermelho de fenol.
Como o experimento FM é muito sensível ao ruído, evite falar ou tocar na mesa óptica ou no microscópio durante o experimento para minimizar o ruído. Nas medições a FM, desacople o disco giratório confocal do microscópio. O experimento começa montando a placa de cultura de células no estágio de FM com um colar magnético para fixar o prato ao estágio do microscópio magnético.
O cantilever em forma de V na sonda A FM é personalizado com o grânulo de vidro biotinilado de dois mícrons. O cantilever pode ser facilmente visto usando o microscópio. O cordão é colado na extremidade do cantilever, e é aqui que a solução de revestimento deve ser aplicada gota a gota.
Para preparar uma sonda FM para o experimento, primeiro monte a ponta no suporte de vidro e, em seguida, coloque o suporte de vidro no suporte de mesa para revestir a ponta. Lave a ponta pingando cuidadosamente 10 microlitros de solução salina tamponada com fosfato docos ou DPBS no final da ponta e, em seguida, use um lenço kim para secar a ponta. Repita este procedimento cinco vezes após a lavagem com DPBS a um miligrama por mililitro.
Ávido em solução. Dropwise sobre a ponta. Deixe a ponta incubar por cinco minutos após o revestimento de avadon.
Lave a ponta mais cinco vezes com DPBS. Em seguida, reticule a fibronectina biotinilada no avadon adicionando uma solução de um miligrama por mililitro. Gota a gota na ponta e incubando por cinco minutos.
Por fim, lave a ponta novamente cinco vezes com DPBS deixando a última gota na ponta. Depois que a ponta estiver preparada, monte-a em um scanner FM. Depois de montar uma ponta FM, coloque uma saia protetora de silicone ao redor do suporte.
Em seguida, configure o microscópio de visualização de vídeo. Em seguida, alinhe a ponta FM no centro do campo de visão. Defina a alavanca óptica colocando o feixe de laser na extremidade do cantilever.
Em seguida, altere a objetiva para a objetiva de alta ampliação adequada para imagens de célula única. Em seguida, traga a célula, que será estimulada mecanicamente, para o campo de visão e escolha um local onde a ponta A FM deve pousar na superfície da célula. Por fim, abaixe a ponta FM até que ela toque nessa célula específica.
Depois de colocar a ponta em contato com a célula, aguarde aproximadamente 20 minutos. Isso permite que uma forte adesão focal se forme no ponto de contato FM na superfície da célula. Após o período de espera, o procedimento de estimulação mecânica pode começar a se preparar para o experimento de estimulação mecânica.
Mude da câmera de vídeo para a câmera EMCD para permitir a visualização das células fluorescentes para geração de imagens. Em seguida, adquira uma imagem inicial da célula em repouso. Use o disco giratório e a microscopia vocal para visualização do ato no citoesqueleto em todo o corpo celular.
Por outro lado, use relva para visualizar aderências focais para estimular a célula. Use o cantilever para aplicar um movimento ascendente controlado em passos discretos a cada três a cinco minutos. Ao adquirir os dados A FM, é importante que o operador monitore constantemente a tensão da posição do piso Z para determinar o tempo adequado para o poste vertical.
Simultaneamente a um registro de aquisição de dados FM uma imagem confocal ou de grama da célula após cada puxão vertical usando o software do livro de slides. Por fim, retire a ponta FM da célula após a conclusão do experimento de estimulação. Uma transfecção de células musculares lisas vasculares com actina MRFP e vcul.
A GFP foi fotografada usando um FM na superfície da célula apical. A mesma célula foi fotografada usando grama na superfície da célula basal. Aqui as duas imagens estão sobrepostas.
Uma imagem da mesma célula também foi adquirida usando disco giratório confocal em todo o corpo celular e é mostrada como uma projeção máxima de uma pilha 3D. Boas sobreposições entre o A FM e o disco giratório Imagens confocais são mostradas. Sua célula muscular lisa vascular transfectada com actina MRFP foi estimulada mecanicamente pelo A FM e fotografada por microscopia confocal de disco giratório.
Os erros indicam fibras atuantes que mostram notável reestruturação após uma estimulação FM. Algumas fibras de ação polimerizam enquanto outras despolimerizam devido à estimulação mecânica, outras fibras de ação se agrupam. Devido à reestruturação do ato, acabamos de mostrar como estimular mecanicamente uma cultura de venda de vida usando EFM e, ao mesmo tempo, registrar o rearranjo CY usando métodos de imagem óptica.
Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que o experimento FM é extremamente barulhento, sensível. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com suas declarações.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para o uso de um microscópio integrado de força atômica e imagem óptica com o objetivo de estimular mecanicamente células vivas em cultura. A metodologia inclui um guia passo a passo e demonstra dados representativos das respostas de células vivas à estimulação mecânica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Estímulo mecânico
- Imagem de células vivas
Antecedentes
- Compreender a resposta celular a estímulos mecânicos é fundamental na biologia celular.
- A microscopia de força atômica permite a manipulação precisa de células.
- A imagem de células vivas fornece insights em tempo real sobre processos celulares.
- A adesão focal desempenha um papel fundamental na fixação celular e na resposta a estímulos.
Objetivo do Estudo
- Ensinar o funcionamento de um microscópio especializado para estudos com células vivas.
- Demonstrar os efeitos da estimulação mecânica sobre células vivas.
- Fornecer um protocolo detalhado para que pesquisadores possam replicar o estudo.
Métodos Utilizados
- Células expressando proteínas de fusão GFP são cultivadas em placas de vidro.
- A ponta do microscópio de força atômica (AFM) é revestida com fibronectina biotinilada.
- A ponta funcionalizada do AFM é utilizada para criar adesões focais com a superfície celular.
- A estimulação mecânica é aplicada por meio de movimento ascendente controlado da ponta do AFM.
Resultados Principais
- As células reforçaram sua adesão ao substrato após a estimulação.
- Foi observada a reorganização do citoesqueleto de actina em resposta a forças mecânicas.
- A imagem de fluorescência em tempo real capturou respostas celulares dinâmicas.
- O protocolo demonstrou com sucesso a eficácia da técnica.
Conclusões
- O microscópio integrado estuda efetivamente as respostas de células vivas a estímulos mecânicos.
- Este método pode aprimorar a compreensão da mecânica e adesão celulares.
- Aplicações futuras podem incluir a exploração de diversos tipos celulares e condições.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender como as células vivas detectam e se adaptam a forças mecânicas é essencial para reduzir os riscos na validação de alvos em vias de mecanotransdução. Essa abordagem integrada de imagem por AFM e óptica permite a resolução em tempo real e em nível subcelular da dinâmica do citoesqueleto e das adesões, fornecendo confiança preditiva no estágio inicial de descoberta ao associar estímulos mecânicos à reorganização estrutural. O método auxilia na redução de riscos mecanicistas ao permitir a visualização direta do remodelamento da actina induzido por forças e do reforço das adesões focais, orientando decisões de avançar ou não avançar na seleção pré-clínica de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas ao revelar como a estimulação mecânica desencadeia a reorganização do citoesqueleto de actina e o fortalecimento das adesões focais.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da observação direta da dinâmica citoesquelética dependente de força em células aderentes vivas.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao vincular entradas mecânicas a saídas estruturais, reduzindo a ambiguidade no engajamento de alvos mecanossensíveis.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, estabelecendo protocolos reprodutíveis para estimulação mecânica e imagem em tempo real.
- Valor Operacional: Aborda a padronização de ensaios e saídas quantitativas por meio de movimentação controlada da ponta do microscópio de força atômica (AFM) e leituras sincronizadas de fluorescência.
- Escalabilidade: Destaca a reutilização da plataforma em diferentes tipos de células aderentes, permitindo avaliação confiável de compostos em campanhas de triagem de mecanobiologia.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Discute a relevância para doenças ao demonstrar o acoplamento estrutural de ápice a base, no qual a estimulação apical induz reorganização em todo o corpo celular.
- Avanço Ajustado ao Risco: Descreve a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica ao capturar respostas dinâmicas que orientam o alinhamento de biomarcadores em vias de mecanotransdução.
- Redução de Riscos Mecanística: Enfoca o valor preditivo de redução de riscos ao mostrar como a aplicação de força leva à polimerização, despolimerização e agrupamento da actina, esclarecendo o mecanismo de ação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos líderes, apoiando a compreensão mecanicista antes da triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método auxilia no teste de hipóteses mediante a aplicação de estímulo mecânico controlado e a observação em tempo real da remodelação do citoesqueleto.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio da formação reprodutível de adesões focais e da imagem quantitativa da dinâmica da actina utilizando modalidades TIRF e confocal.
- Análises: Destaca medições como eventos de polimerização/despolimerização da actina e alterações na intensidade das adesões focais, que permitem comparar estados estimulados e de repouso.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica, demonstrando como a estimulação mecânica apical propaga alterações estruturais através do corpo celular, relevante para a transmissão de forças em nível tecidual.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável para o estudo de alvos mecanossensíveis em modelos celulares vasculares, epiteliais e mesenquimais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista em vias de mecanotransdução.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da estimulação mecânica e da imagem multi-modal.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar/não avançar mais precisas, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados em programas de mecanobiologia.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base na observação direta da adaptação celular induzida por forças.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em operação de AFM, imagem de células vivas e dinâmica do citoesqueleto.
- Os requisitos de instrumentação incluem sistema integrado de AFM-TIRF-confocal com amortecimento de vibrações e duas câmeras EM-CCD.
- A padronização entre equipes exige adesão ao protocolo para funcionalização da ponta, formação de adesões focais e temporização da estimulação.
- As considerações para adaptação incluem variação na rigidez do substrato, proteínas de revestimento e tipos celulares, mantendo a especificidade da estimulação apical.
- As limitações práticas incluem a sensibilidade a ruídos durante as medições de AFM e a necessidade de condições ambientais controladas para minimizar deriva.
