Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células
1 de dezembro de 2010
Neste artigo, vamos mostrar um método para fazer agulhas capilar de vidro com um lúmen 50 mícrons. Esta técnica reduz significativamente os danos cerebrais, minimiza difusão passiva de drogas e permite uma segmentação precisa no cérebro de roedores.
O objetivo geral deste procedimento é realizar microinjeções altamente precisas em estruturas cerebrais profundas para a administração de fármacos, vetores virais ou transplantes celulares. Isso é realizado primeiramente produzindo agulhas de capilar de vidro com uma luz de 50 micrômetros. O segundo passo do procedimento consiste em preencher 50% da agulha com óleo mineral por capilaridade e inserir o êmbolo pela extremidade mais larga do tubo.
O terceiro passo do procedimento é carregar a agulha com a substância ou com a suspensão celular que você deseja injetar. O passo final do procedimento é introduzir a ponta da agulha e injetar a substância em uma estrutura cerebral profunda com um fluxo muito baixo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram um direcionamento muito preciso de substâncias para o cérebro por meio de microinjeções com um tubo capilar de vidro.
Olá, sou Oscar Gonzalez do Laboratório de Neurociência da Escola de Psicologia da Universidade de Colima, México. Hoje, vamos mostrar um procedimento para realizar microinjeção com um tubo capilar de vidro para administrar fármacos no cérebro de camundongos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar células-tronco neurais adultas.
Então vamos começar. O uso de agulhas de capilar de vidro com lúmen de 50 micrômetros para microinjeções no cérebro reduz significativamente os danos cerebrais, minimiza a difusão passiva de fármacos e permite um direcionamento preciso no cérebro de roedores. Antes que as microinjeções possam ser realizadas, as agulhas de vidro devem ser construídas.
Inicie colocando o tubo de vidro capilar em um eletrodo de alta resistência de um puxador de micropipetas. Em seguida, ligue o eletrodo do puxador de micropipetas. Para aquecer a região central do tubo de vidro e amolecer localmente o vidro, estique o tubo ao longo de seu eixo longitudinal por uma distância inicial de três a cinco milímetros, suficiente para provocar uma redução no diâmetro do tubo de vidro na área localizada.
Continue esticando o tubo de vidro até que ele quebre. Repita esses passos para criar duas agulhas idênticas de barril simples. Agora, coloque as agulhas de vidro em uma micro-fornalha.
Um ângulo de 30 graus é suficiente para biselar a ponta. Por fim, coloque as agulhas sob o microscópio e verifique se ambas possuem o diâmetro interno correto. Para a maioria das drogas hidrofílicas, um diâmetro interno de 30 a 50 micrômetros é ideal com as agulhas construídas.
Vamos ver como utilizá-las para microinjeções. Para começar, encha a agulha construída com óleo mineral pela extremidade mais larga. Deixe o óleo mineral penetrar por capilaridade até atingir aproximadamente 50% do comprimento do tubo capilar.
Coloque graxa de alto vácuo ao redor da extremidade mais larga da agulha e insira o êmbolo através dela. Empurre suavemente o óleo mineral até que uma pequena gota apareça na ponta da agulha de vidro. Agora, fixe a agulha no suporte do microinjetor e comece a preparar o animal para a injeção.
Primeiro, coloque uma almofada de aquecimento no suporte estereotáxico para animais para manter a temperatura corporal do animal. A 37 graus Celsius, retire os pelos da cabeça do camundongo anestesiado e, em seguida, posicione-o e fixe-o no aparelho estereotáxico. Usando barras auriculares e um suporte para os dentes, utilize uma lâmina cirúrgica para fazer uma incisão na pele da região das orelhas até a linha do crânio Lambda.
Polir o crânio com um cotonete para secá-lo e puxar a pele para fora do campo cirúrgico. Em seguida, use a ponta da agulha de vidro para apontar o vértice da sutura bgma e definir ali a posição inicial da injeção. Agora, defina o ponto no crânio que será perfurado movendo os eixos X e Y do aparelho estereotáxico sobre o crânio.
Usando uma microfresadora de pesquisa, perfure cuidadosamente orifícios nas coordenadas selecionadas com pinça fina. Remova cuidadosamente a camada mais profunda do osso e rompa a membrana dura-mater. Você verá algum líquido cefalorraquidiano vazando.
Para confirmar que a agulha pode passar pelos orifícios perfurados, abaixe lentamente a agulha de vidro utilizando o eixo Z do aparelho estereotáxico. Agora, pipete um microlitro da droga a ser injetada e coloque-a sobre um pequeno pedaço de parafina. Coloque a parafina sobre o crânio.
Aspire a droga girando a roda do microinjetor enquanto verifica pelo microscópio se o fluido está subindo para dentro da agulha de vidro. Remova o filme de parafina e redefina a coordenada zero. Agora, mova a agulha até as coordenadas selecionadas e abaixe o suporte até que a ponta da agulha de vidro toque suavemente a superfície do cérebro, ajustando a coordenada Z em zero.
Introduza a agulha de vidro no parênquima cerebral na profundidade desejada. Injete a droga lentamente a uma taxa de cerca de um nanolitro por segundo. Quando o volume desejado for injetado, deixe a droga difundir no parênquima por dois minutos e, em seguida, proceda com a remoção da agulha de forma suave e lenta.
Finalmente, feche a ferida cirúrgica com cola e remova o animal do aparelho estereotáxico. Coloque o animal em uma gaiola pré-aquecida para recuperação da anestesia. Agora mostraremos alguns resultados da microinjeção.
A lisofosfatidilcolina ou lyin foi injetada no corpo caloso, que produz desmielinização dos feixes de substância branca, para minimizar a lesão cerebral provocada pela agulha de vidro. Apenas 20 litros de lyin foram injetados. A desmielinização é representada pela ausência da expressão da proteína básica da mielina nos feixes de substância branca; obtém-se uma injeção muito precisa e um trajeto de agulha muito estreito minimiza a lesão cerebral.
Acabamos de mostrar como construir agulhas de vidro para realizar microinjeções em estruturas cerebrais profundas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter todos os equipamentos e materiais prontos para uso na sala cirúrgica. É isso aí.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para criar agulhas de capilar de vidro com lúmen de 50-μm, permitindo microinjeções precisas em estruturas cerebrais profundas. Esta técnica minimiza danos cerebrais e reduz a difusão passiva de fármacos, possibilitando a administração direcionada em modelos de roedores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Técnicas de microinjeção
- Sistemas de entrega de fármacos
Antecedentes
- As microinjeções são essenciais para a administração direta de substâncias no cérebro.
- Métodos tradicionais podem causar danos cerebrais significativos e uma entrega ineficiente de medicamentos.
- As agulhas capilares de vidro oferecem uma solução para direcionamento preciso.
- Este estudo concentra-se na melhoria do processo de microinjeção.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para criar agulhas de capilar de vidro com lúmen de 50 µm.
- Aprimorar a precisão da administração de fármacos em estruturas cerebrais profundas.
- Minimizar danos cerebrais durante o processo de injeção.
Métodos Utilizados
- Produção de agulhas de capilar de vidro com lúmen de 50 μm.
- Preenchimento da agulha com óleo mineral para facilitar a injeção.
- Carregamento da agulha com a substância desejada ou suspensão celular.
- Injeção da substância em baixa taxa de fluxo em áreas cerebrais específicas.
Resultados Principais
- O método permite o direcionamento preciso de substâncias no cérebro.
- Redução significativa dos danos cerebrais em comparação com métodos tradicionais.
- Entrega eficiente de fármacos, vetores virais ou transplantes celulares.
- Efetividade demonstrada em modelos de roedores.
Conclusões
- A técnica desenvolvida aumenta a precisão das microinjeções.
- Oferece um método confiável para a administração de fármacos em pesquisas de neurociência.
- Essa abordagem pode ser aplicada a diversas substâncias, melhorando os resultados experimentais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A administração precisa de agentes terapêuticos em estruturas cerebrais profundas permanece um desafio crítico no desenvolvimento de fármacos em neurociência, especialmente em modelos de pequenos animais, onde o trauma procedimental pode comprometer os resultados. Este método de microinjeção aumenta a fidelidade do engajamento do alvo ao minimizar danos teciduais induzidos pela injeção e difusão passiva, melhorando assim a confiabilidade de estudos com intervenções farmacológicas e genéticas. A abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, permitindo a administração reprodutível e com baixo volume de fármacos, vetores virais ou transplantes celulares, com menor variabilidade biológica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação precisa de hipóteses terapêuticas em núcleos cerebrais profundos, reduzindo efeitos fora do alvo provocados pelo trauma da injeção.
- Valor Operacional: Garante a administração consistente de compostos ou ferramentas genéticas entre estudos, melhorando a reprodutibilidade nos fluxos de trabalho de validação de alvos.
- Confiabilidade Preditiva: Minimiza a variabilidade do procedimento que poderia mascarar respostas farmacológicas ou biológicas reais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados com carga lesional mínima para triagem de compostos em vias do sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Permite injeções padronizadas e de baixo volume (20–100 nl), adequadas para formatos de ensaio de alta precisão que exigem controle rigoroso da farmacocinética.
- Reutilização da Plataforma: Adaptável a diversas substâncias (fármacos, vetores virais, células) mediante ajuste do tamanho da luz da agulha, apoiando campanhas de triagem multimodal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Melhora a fidelidade do modelo de doença ao reduzir lesões de confusão decorrentes dos procedimentos de injeção, aumentando a relevância translacional.
- Valor Operacional: Facilita intervenções repetíveis em estudos longitudinais, apoiando regimes de administração crônica ou transplante celular.
- Avanço com Ajuste de Risco: Aumenta a confiança nos dados de interação com o alvo, auxiliando decisões de prosseguir/não prosseguir em programas pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta que vai da validação do alvo até a otimização do composto líder, onde a entrega precisa ao SNC é essencial para avaliar a modulação do alvo e o envolvimento da via.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses em estruturas cerebrais profundas, permitindo a administração precisa de sondas farmacológicas ou genéticas.
- Triagem: Permite a dosagem quantitativa e reprodutível para avaliação de compostos in vivo, essencial para estudos de resposta à dose e ocupação do alvo.
- Análises: Gera resultados claros ao minimizar o ruído induzido pelo procedimento, melhorando a detecção de sinais em medições de biomarcadores ou eficácia.
- Pesquisa Translacional: Favorece a continuidade do estágio de descoberta ao pré-clínico, garantindo administração consistente e de baixo trauma em todas as fases do estudo.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade padronizada e adaptável de administração no SNC, aplicável a múltiplos projetos e modalidades.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista decorrente de artefatos de injeção.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a padronização entre laboratórios e estudos por meio de parâmetros definidos de preparação da agulha e injeção.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao reduzir estudos fracassados devido à variabilidade procedural ou efeitos fora do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite uma priorização mais confiável de alvos do SNC com base em dados farmacológicos e genéticos mais limpos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em microcirurgia, coordenação estereotáxica e fabricação de agulhas utilizando um puxador de pipetas e microforjador.
- Depende do acesso a instrumentação especializada, incluindo um estereotáxico, microinjetor e microscópio para visualização da agulha.
- Necessita padronização do tamanho da luz da agulha (50 µm) e do protocolo de preenchimento (50% de óleo mineral) para desempenho consistente entre os usuários.
- A adaptação a diferentes sistemas modelo pode exigir ajuste das coordenadas e validação da profundidade de penetração da agulha.
- As limitações práticas incluem a habilidade técnica necessária para o puxamento e afiação das agulhas, bem como o baixo rendimento inerente à microinjeção manual.
