Name: Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-01T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a realizar microinjeções precisas em estruturas cerebrais profundas usando agulhas de vidro com lúmen de 50 µm. Esta técnica minimiza danos cerebrais e permite entrega direta de drogas, vetores virais ou transplantes celulares em modelos de roedores.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

OG-P foi apoiada por CONACyT s subvenção (CB-2008-101476) e Fraba (686/10). AQ-H apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde, o Howard Hughes Medical Institute, da Robert Wood Johnson Foundation e da Fundação Maryland células-tronco.

<ol><li> Fazer agulhas de vidro antes da cirurgia mouse: <ol class="lalpha"><li> Coloque o tubo de vidro capilar em um extrator de micropipeta. </li><li> O calor do meio do tubo de vidro para suavizar o tubo de vidro na área localizada. </li><li> Estique o tubo de vidro ao longo de seu eixo longitudinal por uma distância inicial suficiente para causar uma redução no diâmetro do tubo de vidro na área localizada. </li><li> Mantenha o tubo de vidro que se estende até que quebre. Desta forma, dois idênticos agulhas único barril são obtidos. </li></ol></li><li> Coloque a agulha de vidro em uma microforge. Um ângulo de 30 ° é suficiente para chanfrar a ponta. </li><li> Verifique sob o microscópio que cada agulha tem o diâmetro correto interior. Para a maioria das drogas hidrofílicas um diâmetro 30-50 mM interior é ideal (figura 1). </li><li> Encha-se a agulha com óleo mineral a partir da maior final de agulha de vidro. Deixe que o óleo mineral (MSDS, Cat. M7700) entra por capilaridade, até atingir ~ 50% do comprimento do tubo capilar. Coloque a vácuo de alta gordura (Dow Corning, Cat. 05054-AB) em todo o êmbolo para selar o maior ponta da agulha. </li><li> Insira o êmbolo pelo maior ponta da agulha e empurre delicadamente o óleo mineral até que uma pequena gota de óleo é visto saindo da ponta da agulha de vidro. </li><li> Segura a agulha de vidro no suporte do microinjetor. </li><li> Anestesiar o rato com Avertin 2,5% (2,2,2-tribromoetanol + terc-amil álcool, 01:01 w / v). Dose de 25 30μL por grama intraperitoneal. </li><li> Coloque uma almofada de aquecimento no aparelho estereotáxico para manter a temperatura corporal do animal a 37 ° C. </li><li> Lugar e segura a cabeça do rato no dispositivo estereotáxico usando barras de ouvido e um suporte de dentes. </li><li> Limpe a cabeça do rato com a solução de gluconato de clorexidina 0,1%, seguido por etanol 70% e gluconato de clorexidina 0,1% pela segunda vez. </li><li> Inciso a pele com uma lâmina cirúrgica # 15 de orelhas de rato para a linha do crânio Lamba. </li><li> Polonês do crânio com um cotonete para secar o produto e puxar a pele para fora do campo cirúrgico. </li><li> Use a ponta da agulha de vidro para apontar para o vértice da sutura bregma. Lá você tem que definir a posição inicial do injetor (a coordenada "zero"). </li><li> Definir o ponto a ser perfurado, movendo o "X" e "Y" eixo do dispositivo estereotáxico sobre o crânio. </li><li> Broca com muito cuidado buracos na coordenada selecionada. Microdrills e ferramentas de outros metais foram previamente esterilizado a 250 ° C por 60 segundos com um pano seco de contas de vidro esterilizador (Cole Palmer, Cat. No. EW-10779-00). </li><li> Com uma pinça fina remover com cuidado a camada mais profunda do osso e romper a membrana duramatter (você vai ver algum fluido cérebro-espinhal vazando). </li><li> Confirmar que a agulha pode passar por buracos perfurados. </li><li> Pipetar 1 mL da droga você quer injetar e colocá-lo em um pequeno pedaço de parafilme. </li><li> Coloque o parafilme sobre o crânio. </li><li> Sugam a droga girando a roda microinjetor, enquanto verifica sob o microscópio que o fluido está subindo para dentro da agulha de vidro. </li><li> Remover o parafilme e re-definir a coordenar zero. </li><li> Mover a agulha para as coordenadas selecionado, o porta até que a ponta da agulha de vidro tocar suavemente na superfície do cérebro e definir a "Z" coordenar a zero. </li><li> Introduzir a agulha de vidro para o parênquima cerebral em profundidade selecionada. </li><li> Injetar a droga lentamente a uma taxa de ~ 1 nl / sec. </li><li> Quando o volume desejo é injetado, deixe o difuso de drogas dentro do parênquima por 2 min. Em seguida, avance para remover a agulha suavemente e lentamente. </li><li> Cola a ferida cirúrgica e remover o animal a partir do dispositivo estereotáxico e colocar o animal em uma gaiola pré-aquecido contendo uma cama limpa para a recuperação da anestesia. </li><li> Para fornecer analgesia pós-operatória todos os animais receberam 5 mg / kg subcutânea Ketorolac cada hora de 12 para 24 h. </li></ol> Resultados representativos: Ao seguir este protocolo, uma injeção muito precisa é obtida e uma faixa muito estreita agulha minimiza lesão cerebral. Como resultado representante deste método, injetamos lysophosphatidyl colina (lysolecithin) no corpo caloso, que produz desmielinização de tratos de substância branca 1-4. Para minimizar a lesão cerebral produzido pela agulha de vidro, injetou apenas 20 nl de lysolecithin no corpo caloso, mas se necessário maior volume de até 200 nl pode ser injetado com o mesmo método. Desmielinização é detectada pela ausência de mielina expressão da proteína básica na tratos de substância branca (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2082/2082fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Uma agulha de vidro com um diâmetro de 50 mícrons. Distância entre dois ticks curtana escala representa um comprimento de 50 mícrons. <img src="/files/ftp_upload/2082/2082fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura injeção Lysolecithin 2. No corpo caloso. Desmielinização é mostrado como um não a expressão da proteína básica de mielina (área pontilhada). Observe o pequeno tamanho do vidro do trato agulha (setas). Bar = 100 mm

<ol><li>Menn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+oligodendrocytes+in+the+subventricular+zone+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain.</a> J Neurosci. 26, 7907-7918 (2006).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Romero-Rodriguez, R., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Growth+Factor+Induces+the+Progeny+of+Subventricular+Zone+Type+B+Cells+to+Migrate+and+Differentiate+into+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal Growth Factor Induces the Progeny of Subventricular Zone Type B Cells to Migrate and Differentiate into Oligodendrocytes.</a> Stem Cells. 27, 2032-2043 (2009).</li>
<li>Hall, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+aspects+of+remyelination+after+demyelination+produced+by+the+intraneural+injection+of+lysophosphatidyl+choline%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Some aspects of remyelination after demyelination produced by the intraneural injection of lysophosphatidyl choline.</a> J Cell Sci. 13, 461-477 (1973).</li>
<li>Webster, G. R., Thompson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+presence+of+lysolecithin+in+nervous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Observations on the presence of lysolecithin in nervous tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 63, 38-45 (1962).</li>
<li>Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+Zone+Astrocytes+Are+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subventricular Zone Astrocytes Are Neural Stem Cells in the Adult mammalian Brain.</a> Cell. 97, 1-20 (1999).</li>
<li>Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+converts+transit-amplifying+neurogenic+precursors+in+the+adult+brain+into+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells.</a> Neuron. 36, 1021-1034 (2002).</li>
<li>Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 15472-15477 (2009).</li>
<li>Richardson, R. M., Barbaro, N. M., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+cell+transplantation+for+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Focus%22%5BJournal%5D)">Developing cell transplantation for temporal lobe epilepsy.</a> Neurosurg Focus. 24, E17-E17 (2008).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26, 7380-7389 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método mostrou neste vídeo é muito útil para entregar a maioria das drogas ou vetores virais em lugares muito precisos para o cérebro. Algumas das principais vantagens desta técnica são a confiabilidade do ponto de focalização, a precisão das injeções eo pequeno tamanho da lesão cerebral e danos trato 1, 2, 5, 6. Uma vez que a técnica é padronizada a faixa de 50 mm deve mistargeting ou menos 1, 2. Transplantes de células também pode ser feito usando mais amplo, 100-150 mM 7-9, agulhas....

<table><tbody><tr><td>Tubo de vidro capilar</td><td>Wiretrol I</td><td>5-000-1001</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 730</td><td></td></tr><tr><td>Microforja</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Modelo 48000</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>MSDS</td><td>M7700</td><td></td></tr><tr><td>Graxa de alto vácuo</td><td>Dow Corning</td><td>05054-AB</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia: Avertin 2,5%</td><td></td><td></td><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;etanol + álcool tert-amílico, 1:1 p/v</td></tr><tr><td>Almofada aquecida</td><td>Mastex</td><td>Modelo 900</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo Kopf-900</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi cirúrgico nº 15</td><td>Medi-Cut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbroqueadora</td><td>Ideal Micro Drill</td><td>67-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta de 1-&amp;mu;L</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Vasiorkop com sistema Contraves</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Narishige International</td><td>Modelo MO-10</td><td></td></tr></tbody></table>

segmentação de estruturas cerebrais profundas com microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou transplantes de células

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjeções no parênquima cerebral são procedimentos importantes para entregar drogas, vetores virais ou transplantes de células. A lesão cerebral que uma agulha de injeção produz durante sua trajetória é uma grande preocupação, especialmente no cérebro do rato, não só para o cérebro é pequeno, mas às vezes também de múltiplas injeções são necessárias. Mostramos aqui um método para produzir agulhas capilar de vidro com um lúmen 50 mícrons, que reduz significativamente os danos cerebrais e permite uma segmentação precisa no cérebro de roedores. Este método permite uma entrega de pequenos volumes (20-100 nl), reduz os riscos de sangramento, e minimiza a difusão passiva de drogas dentro do parênquima cerebral. Usando diferentes tamanhos de tubos capilares de vidro, ou mudando o lúmen da agulha, vários tipos de substâncias e células pode ser injetado. Microinjeções com um tubo de vidro capilar representam uma melhoria significativa nas técnicas de injeção e cerebral profunda segmentação com danos colaterais mínimos em pequenos roedores.

Neste artigo, vamos mostrar um método para fazer agulhas capilar de vidro com um lúmen 50 mícrons. Esta técnica reduz significativamente os danos cerebrais, minimiza difusão passiva de drogas e permite uma segmentação precisa no cérebro de roedores.

Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células

As microinjeções no parênquima cerebral são procedimentos importantes para a administração de fármacos, vetores virais ou transplantes celulares. A lesão cerebral que um...

O objetivo geral deste procedimento é realizar microinjeções altamente precisas em estruturas cerebrais profundas para a administração de fármacos, vetores virais ou transplantes celulares. Isso é realizado primeiramente produzindo agulhas de capilar de vidro com uma luz de 50 micrômetros. O segundo passo do procedimento consiste em preencher 50% da agulha com óleo mineral por capilaridade e inserir o êmbolo pela extremidade mais larga do tubo.O terceiro passo do procedimento é carregar a agulha com a substância ou com a suspensão celular que você deseja injetar. O passo final do procedimento é introduzir a ponta da agulha e injetar a substância em uma estrutura cerebral profunda com um fluxo muito baixo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram um direcionamento muito preciso de substâncias para o cérebro por meio de microinjeções com um tubo capilar de vidro.Olá, sou Oscar Gonzalez do Laboratório de Neurociência da Escola de Psicologia da Universidade de Colima, México. Hoje, vamos mostrar um procedimento para realizar microinjeção com um tubo capilar de vidro para administrar fármacos no cérebro de camundongos. Utilizamos este procedimento em nosso laborató

targeting-deep-brain-structures-with-microinjections-for-delivery

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Escalável Fluidic Arrays Injector para Viral Segmentação de Intact Circuitos 3-D do cérebro

Fonte: Poland, R. et al. Microinjeção de cérebro de roedores para estudar substratos moleculares do comportamento motivado. J. Vis. Exp. (2015)Neste vídeo, uma configuração de microinjeção cheia de água que consiste em uma seringa e um tubo de microinjetor é usada para a administração precisa do medicamento. Um rato com uma cânula guia pré-implantada é submetido a microinjeção cerebral direcionada, permitindo a administração precisa de agentes terapêuticos em animais acordados com danos mínimos...

Entrega baseada em microinjeção de um agente terapêutico em um cérebro de roedor acordado

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projeto, embalagem e entrega de CRISPR retro e lentivírus de alto título por meio de injeção estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a injeção viral estereotáxica para edição precisa de genes neuronais no cérebro de camundongos. O protocolo garante a entrega precisa do vírus ao giro denteado, permitindo a marcação fluorescente e o nocaute genético mediado por CRISPR para estudar circuitos neurais, função gênica e mecanismos de doenças in vivo.

Injeção viral estereotáxica para edição de genes neuronais direcionados no cérebro de camundongos

Melhorias recentes nas preparações organotípicas de fatias de cérebro permitiram sua exploração para aplicações biotecnológicas. As fatias organotípicas mantêm características estruturais locais da biologia in vivo, incluindo conexões sinápticas funcionais. Aqui apresentamos um método de entrega biolística regiosseletiva para rotular e manipular geneticamente essas fatias.

Regiosseletiva Biolistic Segmentação em Organotípicas fatias do cérebro do Usando um Modificado Gene Gun

O mecanismo subjacente aos efeitos terapêuticos da cirurgia de Estimulação Cerebral Profunda (DBS) precisa de investigação. Os métodos apresentados neste manuscrito descrevem uma abordagem experimental para examinar os eventos celulares desencadeados pela ECP, analisando o perfil de expressão gênica de genes candidatos que podem facilitar a neurogênese pós-cirurgia de ECP.

Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

MicroRNAs desempenham papéis cruciais no cérebro e são alvos potenciais para modelar a neurodegeneração. No entanto, perturbar os níveis de miRNA é um desafio devido ao curto comprimento do miRNA e à inacessibilidade do tecido cerebral. Este vídeo apresenta um método para o design do antagomir e entrega específica do cérebro usando um neuropeptídeo em camundongos.

Uma alternativa simples para injeção estereotáxica para Brain Knockdown específico de miRNA

O presente protocolo descreve uma técnica de infusão de microcirurgia de camundongo, que efetivamente fornece substâncias diretamente no cérebro através da artéria carótida interna.

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC via Artéria carótida interna

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para identificar a conectividade funcional específica do tipo de célula de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando estimulações optogenéticas em fatias de cérebro ex vivo.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Este protocolo delineia as etapas necessárias para a entrega gênica através da abertura da barreira hematoencefálica (BHE) por ultrassom focado, avaliação da expressão gênica resultante e mensuração da atividade neuromoduladora de receptores quimiogenéticos por meio de testes histológicos.

Abertura da Barreira Hematoencefálica Induzida por Ultrassom Focalizado para Atingir Estruturas Cerebrais e Avaliar a Neuromodulação Quimiogenética

A eletroporação de organoides cerebrais de primatas fornece uma abordagem precisa e eficiente para introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios em um sistema modelo próximo ao desenvolvimento do neocórtex (pato)fisiológico de primatas. Isso permite o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos e também pode ser aplicado para modelagem de doenças.

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Aprenda a realizar microinjeções precisas em estruturas cerebrais profundas usando agulhas de vidro com lúmen de 50 µm. Esta técnica minimiza danos cerebrais e permite entrega direta de drogas, vetores virais ou transplantes celulares em modelos de roedores.

Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células (Vídeo) | JoVE Journal

Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células

Explorar mais vídeos