Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células

O objetivo geral deste procedimento é realizar microinjeções altamente precisas em estruturas cerebrais profundas para administração de medicamentos, vetores virais ou transplantes de células. Isso é feito produzindo primeiro agulhas capilares de vidro com um lúmen de 50 micrômetros. O segundo passo do procedimento é encher 50% da agulha com óleo mineral por capilar e inserir o êmbolo pela extremidade mais larga do tubo.

A terceira etapa do procedimento é carregar a agulha com a substância ou a suspensão celular que você deseja injetar. A etapa final do procedimento é introduzir a ponta da agulha e injetar a substância em um fluxo de taxa muito baixa em uma estrutura cerebral profunda. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram um direcionamento muito preciso de substâncias para o cérebro por meio de microinjeções com um tubo capilar de vidro.

Olá, sou Oscar Gonzalez, do Laboratório de Neurociência da Escola de Psicologia da Universidade de Colima, México. Hoje, mostraremos um procedimento para realizar microinjeção com um tubo capilar de vidro para administrar medicamentos no cérebro do camundongo. Usamos esse procedimento em laboratório suficiente para estudar células-tronco neurais adultas.

Então vamos começar. O uso de agulhas capilares de vidro com um lúmen de 50 micrômetros para microinjeções no cérebro reduz significativamente os danos cerebrais, minimiza a difusão passiva de drogas e permite um direcionamento preciso para o cérebro de roedores. Antes que as microinjeções possam ser realizadas, as agulhas de vidro devem ser construídas.

Comece colocando o tubo de vidro capilar em um eletrodo de alta resistência de tração de um micro extrator de pipeta. Em seguida, ligue o eletrodo do extrator de micropipeta. Para aquecer o meio do tubo de vidro para amolecer localmente o tubo de vidro, estique o tubo de vidro ao longo de seu eixo longitudinal por uma distância inicial de três a cinco milímetros, suficiente para causar uma redução no diâmetro do tubo de vidro na área localizada.

Continue esticando o tubo de vidro até que ele se quebre. Repita essas etapas para criar duas agulhas idênticas de barril único. Agora coloque as agulhas de vidro em uma micro forja.

Um ângulo de 30 graus é suficiente para chanfrar a ponta. Por fim, coloque as agulhas sob o microscópio e verifique se ambas têm o diâmetro interno correto. Para a maioria dos medicamentos hidrofílicos, um diâmetro interno de 30 a 50 micrômetros é ideal com as agulhas construídas.

Vamos ver como usá-los para micro injeções. Para começar, encha a agulha construída com óleo mineral da extremidade mais larga. Deixe o óleo mineral entrar por capilar até atingir aproximadamente 50% do comprimento do tubo capilar.

Coloque graxa de alto vácuo ao redor da extremidade mais larga da agulha e insira o êmbolo através dela. Para empurrar suavemente o óleo mineral até que uma pequena gota de cena saia da ponta da agulha de vidro. Agora prenda a agulha no suporte do microinjetor e comece a preparar o animal para a injeção.

Primeiro, coloque uma almofada de aquecimento no suporte estereotáxico para manter a temperatura corporal do animal. A 37 graus Celsius, raspe a cabeça do camundongo anestesiado, coloque-a e prenda-a no dispositivo estereotáxico. Usando barras auriculares e um suporte de dentes, use uma lâmina cirúrgica para incisar a pele das orelhas até a linha do crânio Lambda.

Polir o crânio com um cotonete para secá-lo e puxar a pele para fora do campo cirúrgico. Em seguida, use a ponta da agulha de vidro para apontar para o vértice da sutura bgma e defina a posição inicial da injeção lá. Agora defina o ponto no crânio que deve ser perfurado movendo os eixos x e Y do dispositivo estereotáxico sobre o crânio.

Usando uma micro broca de pesquisa, faça furos cuidadosamente nas coordenadas selecionadas com uma pinça fina. Remova cuidadosamente a camada mais profunda do osso e quebre a membrana da dura-máter moderna. Você verá um pouco de líquido cefalorraquidiano vazando.

Para confirmar que a agulha pode passar pelos orifícios perfurados, abaixe lentamente a agulha de vidro usando o eixo Z do dispositivo estereotáxico. Agora pipete um microlitro da droga a ser injetada e coloque-a em um pequeno pedaço de parfum. Coloque o perfume no crânio.

Sugue a droga girando a roda do microinjetor enquanto verifica através do microscópio se o fluido está subindo para a agulha de vidro. Remova o filme para e redefina a coordenada zero. Agora mova a agulha para as coordenadas selecionadas e abaixe o suporte até que a ponta da agulha de vidro toque suavemente a superfície do cérebro e defina a coordenada Z em zero.

Introduza a agulha de vidro no parênquima cerebral na profundidade desejada. Injete a droga lentamente a uma taxa de cerca de um nanolitro por segundo. Quando o volume desejado for injetado, deixe o medicamento se difundir no parênquima por dois minutos e, em seguida, remova a agulha de maneira suave e lenta.

Por fim, cole a ferida cirúrgica e remova o animal do dispositivo estereotáxico. Coloque o animal em uma gaiola pré-guerra para recuperação da anestesia. Agora vamos mostrar alguns resultados de microinjeção.

Lisofosfatidilcolina ou liina foi injetada no corpo cosso que produz desmielinização dos tratos da substância branca para minimizar a lesão cerebral produzida pela agulha de vidro. Apenas 20 litros de lyin foram injetados. A desmielinização é representada pela ausência de expressão da proteína básica da mielina nos tratos da substância branca, uma injeção muito precisa é obtida e um trato de agulha muito estreito minimiza a lesão cerebral.

Acabamos de mostrar como construir agulhas de vidro para realizar microinjeções em estruturas cerebrais profundas. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de ter todos os equipamentos e materiais prontos para serem usados na sala cirúrgica. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.