Name: Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-01T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a realizar microinjeções precisas em estruturas cerebrais profundas usando agulhas de vidro com lúmen de 50 µm. Esta técnica minimiza danos cerebrais e permite entrega direta de drogas, vetores virais ou transplantes celulares em modelos de roedores.

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OG-P foi apoiada por CONACyT s subvenção (CB-2008-101476) e Fraba (686/10). AQ-H apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde, o Howard Hughes Medical Institute, da Robert Wood Johnson Foundation e da Fundação Maryland células-tronco.

<ol><li> Fazer agulhas de vidro antes da cirurgia mouse: <ol class="lalpha"><li> Coloque o tubo de vidro capilar em um extrator de micropipeta. </li><li> O calor do meio do tubo de vidro para suavizar o tubo de vidro na área localizada. </li><li> Estique o tubo de vidro ao longo de seu eixo longitudinal por uma distância inicial suficiente para causar uma redução no diâmetro do tubo de vidro na área localizada. </li><li> Mantenha o tubo de vidro que se estende até que quebre. Desta forma, dois idênticos agulhas único barril são obtidos. </li></ol></li><li> Coloque a agulha de vidro em uma microforge. Um ângulo de 30 ° é suficiente para chanfrar a ponta. </li><li> Verifique sob o microscópio que cada agulha tem o diâmetro correto interior. Para a maioria das drogas hidrofílicas um diâmetro 30-50 mM interior é ideal (figura 1). </li><li> Encha-se a agulha com óleo mineral a partir da maior final de agulha de vidro. Deixe que o óleo mineral (MSDS, Cat. M7700) entra por capilaridade, até atingir ~ 50% do comprimento do tubo capilar. Coloque a vácuo de alta gordura (Dow Corning, Cat. 05054-AB) em todo o êmbolo para selar o maior ponta da agulha. </li><li> Insira o êmbolo pelo maior ponta da agulha e empurre delicadamente o óleo mineral até que uma pequena gota de óleo é visto saindo da ponta da agulha de vidro. </li><li> Segura a agulha de vidro no suporte do microinjetor. </li><li> Anestesiar o rato com Avertin 2,5% (2,2,2-tribromoetanol + terc-amil álcool, 01:01 w / v). Dose de 25 30μL por grama intraperitoneal. </li><li> Coloque uma almofada de aquecimento no aparelho estereotáxico para manter a temperatura corporal do animal a 37 ° C. </li><li> Lugar e segura a cabeça do rato no dispositivo estereotáxico usando barras de ouvido e um suporte de dentes. </li><li> Limpe a cabeça do rato com a solução de gluconato de clorexidina 0,1%, seguido por etanol 70% e gluconato de clorexidina 0,1% pela segunda vez. </li><li> Inciso a pele com uma lâmina cirúrgica # 15 de orelhas de rato para a linha do crânio Lamba. </li><li> Polonês do crânio com um cotonete para secar o produto e puxar a pele para fora do campo cirúrgico. </li><li> Use a ponta da agulha de vidro para apontar para o vértice da sutura bregma. Lá você tem que definir a posição inicial do injetor (a coordenada "zero"). </li><li> Definir o ponto a ser perfurado, movendo o "X" e "Y" eixo do dispositivo estereotáxico sobre o crânio. </li><li> Broca com muito cuidado buracos na coordenada selecionada. Microdrills e ferramentas de outros metais foram previamente esterilizado a 250 ° C por 60 segundos com um pano seco de contas de vidro esterilizador (Cole Palmer, Cat. No. EW-10779-00). </li><li> Com uma pinça fina remover com cuidado a camada mais profunda do osso e romper a membrana duramatter (você vai ver algum fluido cérebro-espinhal vazando). </li><li> Confirmar que a agulha pode passar por buracos perfurados. </li><li> Pipetar 1 mL da droga você quer injetar e colocá-lo em um pequeno pedaço de parafilme. </li><li> Coloque o parafilme sobre o crânio. </li><li> Sugam a droga girando a roda microinjetor, enquanto verifica sob o microscópio que o fluido está subindo para dentro da agulha de vidro. </li><li> Remover o parafilme e re-definir a coordenar zero. </li><li> Mover a agulha para as coordenadas selecionado, o porta até que a ponta da agulha de vidro tocar suavemente na superfície do cérebro e definir a "Z" coordenar a zero. </li><li> Introduzir a agulha de vidro para o parênquima cerebral em profundidade selecionada. </li><li> Injetar a droga lentamente a uma taxa de ~ 1 nl / sec. </li><li> Quando o volume desejo é injetado, deixe o difuso de drogas dentro do parênquima por 2 min. Em seguida, avance para remover a agulha suavemente e lentamente. </li><li> Cola a ferida cirúrgica e remover o animal a partir do dispositivo estereotáxico e colocar o animal em uma gaiola pré-aquecido contendo uma cama limpa para a recuperação da anestesia. </li><li> Para fornecer analgesia pós-operatória todos os animais receberam 5 mg / kg subcutânea Ketorolac cada hora de 12 para 24 h. </li></ol> Resultados representativos: Ao seguir este protocolo, uma injeção muito precisa é obtida e uma faixa muito estreita agulha minimiza lesão cerebral. Como resultado representante deste método, injetamos lysophosphatidyl colina (lysolecithin) no corpo caloso, que produz desmielinização de tratos de substância branca 1-4. Para minimizar a lesão cerebral produzido pela agulha de vidro, injetou apenas 20 nl de lysolecithin no corpo caloso, mas se necessário maior volume de até 200 nl pode ser injetado com o mesmo método. Desmielinização é detectada pela ausência de mielina expressão da proteína básica na tratos de substância branca (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2082/2082fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Uma agulha de vidro com um diâmetro de 50 mícrons. Distância entre dois ticks curtana escala representa um comprimento de 50 mícrons. <img src="/files/ftp_upload/2082/2082fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura injeção Lysolecithin 2. No corpo caloso. Desmielinização é mostrado como um não a expressão da proteína básica de mielina (área pontilhada). Observe o pequeno tamanho do vidro do trato agulha (setas). Bar = 100 mm

<ol><li>Menn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+oligodendrocytes+in+the+subventricular+zone+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain.</a> J Neurosci. 26, 7907-7918 (2006).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Romero-Rodriguez, R., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Growth+Factor+Induces+the+Progeny+of+Subventricular+Zone+Type+B+Cells+to+Migrate+and+Differentiate+into+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal Growth Factor Induces the Progeny of Subventricular Zone Type B Cells to Migrate and Differentiate into Oligodendrocytes.</a> Stem Cells. 27, 2032-2043 (2009).</li>
<li>Hall, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+aspects+of+remyelination+after+demyelination+produced+by+the+intraneural+injection+of+lysophosphatidyl+choline%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Some aspects of remyelination after demyelination produced by the intraneural injection of lysophosphatidyl choline.</a> J Cell Sci. 13, 461-477 (1973).</li>
<li>Webster, G. R., Thompson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+presence+of+lysolecithin+in+nervous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Observations on the presence of lysolecithin in nervous tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 63, 38-45 (1962).</li>
<li>Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+Zone+Astrocytes+Are+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subventricular Zone Astrocytes Are Neural Stem Cells in the Adult mammalian Brain.</a> Cell. 97, 1-20 (1999).</li>
<li>Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+converts+transit-amplifying+neurogenic+precursors+in+the+adult+brain+into+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells.</a> Neuron. 36, 1021-1034 (2002).</li>
<li>Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 15472-15477 (2009).</li>
<li>Richardson, R. M., Barbaro, N. M., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+cell+transplantation+for+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Focus%22%5BJournal%5D)">Developing cell transplantation for temporal lobe epilepsy.</a> Neurosurg Focus. 24, E17-E17 (2008).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26, 7380-7389 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método mostrou neste vídeo é muito útil para entregar a maioria das drogas ou vetores virais em lugares muito precisos para o cérebro. Algumas das principais vantagens desta técnica são a confiabilidade do ponto de focalização, a precisão das injeções eo pequeno tamanho da lesão cerebral e danos trato 1, 2, 5, 6. Uma vez que a técnica é padronizada a faixa de 50 mm deve mistargeting ou menos 1, 2. Transplantes de células também pode ser feito usando mais amplo, 100-150 mM 7-9, agulhas....

<table><tbody><tr><td>Tubo de vidro capilar</td><td>Wiretrol I</td><td>5-000-1001</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 730</td><td></td></tr><tr><td>Microforja</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Modelo 48000</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>MSDS</td><td>M7700</td><td></td></tr><tr><td>Graxa de alto vácuo</td><td>Dow Corning</td><td>05054-AB</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia: Avertin 2,5%</td><td></td><td></td><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;etanol + álcool tert-amílico, 1:1 p/v</td></tr><tr><td>Almofada aquecida</td><td>Mastex</td><td>Modelo 900</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo Kopf-900</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi cirúrgico nº 15</td><td>Medi-Cut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbroqueadora</td><td>Ideal Micro Drill</td><td>67-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta de 1-&amp;mu;L</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Vasiorkop com sistema Contraves</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Narishige International</td><td>Modelo MO-10</td><td></td></tr></tbody></table>

segmentação de estruturas cerebrais profundas com microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou transplantes de células

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjeções no parênquima cerebral são procedimentos importantes para entregar drogas, vetores virais ou transplantes de células. A lesão cerebral que uma agulha de injeção produz durante sua trajetória é uma grande preocupação, especialmente no cérebro do rato, não só para o cérebro é pequeno, mas às vezes também de múltiplas injeções são necessárias. Mostramos aqui um método para produzir agulhas capilar de vidro com um lúmen 50 mícrons, que reduz significativamente os danos cerebrais e permite uma segmentação precisa no cérebro de roedores. Este método permite uma entrega de pequenos volumes (20-100 nl), reduz os riscos de sangramento, e minimiza a difusão passiva de drogas dentro do parênquima cerebral. Usando diferentes tamanhos de tubos capilares de vidro, ou mudando o lúmen da agulha, vários tipos de substâncias e células pode ser injetado. Microinjeções com um tubo de vidro capilar representam uma melhoria significativa nas técnicas de injeção e cerebral profunda segmentação com danos colaterais mínimos em pequenos roedores.

Neste artigo, vamos mostrar um método para fazer agulhas capilar de vidro com um lúmen 50 mícrons. Esta técnica reduz significativamente os danos cerebrais, minimiza difusão passiva de drogas e permite uma segmentação precisa no cérebro de roedores.

Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células

As microinjeções no parênquima cerebral são procedimentos importantes para a administração de fármacos, vetores virais ou transplantes celulares. A lesão cerebral que um...

O objetivo geral deste procedimento é realizar microinjeções altamente precisas em estruturas cerebrais profundas para a administração de fármacos, vetores virais ou transplantes celulares. Isso é realizado primeiramente produzindo agulhas de capilar de vidro com uma luz de 50 micrômetros. O segundo passo do procedimento consiste em preencher 50% da agulha com óleo mineral por capilaridade e inserir o êmbolo pela extremidade mais larga do tubo.O terceiro passo do procedimento é carregar a agulha com a substância ou com a suspensão celular que você deseja injetar. O passo final do procedimento é introduzir a ponta da agulha e injetar a substância em uma estrutura cerebral profunda com um fluxo muito baixo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram um direcionamento muito preciso de substâncias para o cérebro por meio de microinjeções com um tubo capilar de vidro.Olá, sou Oscar Gonzalez do Laboratório de Neurociência da Escola de Psicologia da Universidade de Colima, México. Hoje, vamos mostrar um procedimento para realizar microinjeção com um tubo capilar de vidro para administrar fármacos no cérebro de camundongos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar células-tronco neurais adultas.Então vamos começar. O uso de agulhas de capilar de vidro com lúmen de 50 micrômetros para microinjeções no cérebro reduz significativamente os danos cerebrais, minimiza a difusão passiva de fármacos e permite um direcionamento preciso no cérebro de roedores. Antes que as microinjeções possam ser realizadas, as agulhas de vidro devem ser construídas.Inicie colocando o tubo de vidro capilar em um eletrodo de alta resistência de um puxador de micropipetas. Em seguida, ligue o eletrodo do puxador de micropipetas. Para aquecer a região central do tubo de vidro e amolecer localmente o vidro, estique o tubo ao longo de seu eixo longitudinal por uma distância inicial de três a cinco milímetros, suficiente para provocar uma redução no diâmetro do tubo de vidro na área localizada.Continue esticando o tubo de vidro até que ele quebre. Repita esses passos para criar duas agulhas idênticas de barril simples. Agora, coloque as agulhas de vidro em uma micro-fornalha.Um ângulo de 30 graus é suficiente para biselar a ponta. Por fim, coloque as agulhas sob o microscópio e verifique se ambas possuem o diâmetro interno correto. Para a maioria das drogas hidrofílicas, um diâmetro interno de 30 a 50 micrômetros é ideal com as agulhas construídas.Vamos ver como utilizá-las para microinjeções. Para começar, encha a agulha construída com óleo mineral pela extremidade mais larga. Deixe o óleo mineral penetrar por capilaridade até atingir aproximadamente 50% do comprimento do tubo capilar.Coloque graxa de alto vácuo ao redor da extremidade mais larga da agulha e insira o êmbolo através dela. Empurre suavemente o óleo mineral até que uma pequena gota apareça na ponta da agulha de vidro. Agora, fixe a agulha no suporte do microinjetor e comece a preparar o animal para a injeção.Primeiro, coloque uma almofada de aquecimento no suporte estereotáxico para animais para manter a temperatura corporal do animal. A 37 graus Celsius, retire os pelos da cabeça do camundongo anestesiado e, em seguida, posicione-o e fixe-o no aparelho estereotáxico. Usando barras auriculares e um suporte para os dentes, utilize uma lâmina cirúrgica para fazer uma incisão na pele da região das orelhas até a linha do crânio Lambda.Polir o crânio com um cotonete para secá-lo e puxar a pele para fora do campo cirúrgico. Em seguida, use a ponta da agulha de vidro para apontar o vértice da sutura bgma e definir ali a posição inicial da injeção. Agora, defina o ponto no crânio que será perfurado movendo os eixos X e Y do aparelho estereotáxico sobre o crânio.Usando uma microfresadora de pesquisa, perfure cuidadosamente orifícios nas coordenadas selecionadas com pinça fina. Remova cuidadosamente a camada mais profunda do osso e rompa a membrana dura-mater. Você verá algum líquido cefalorraquidiano vazando.Para confirmar que a agulha pode passar pelos orifícios perfurados, abaixe lentamente a agulha de vidro utilizando o eixo Z do aparelho estereotáxico. Agora, pipete um microlitro da droga a ser injetada e coloque-a sobre um pequeno pedaço de parafina. Coloque a parafina sobre o crânio.Aspire a droga girando a roda do microinjetor enquanto verifica pelo microscópio se o fluido está subindo para dentro da agulha de vidro. Remova o filme de parafina e redefina a coordenada zero. Agora, mova a agulha até as coordenadas selecionadas e abaixe o suporte até que a ponta da agulha de vidro toque suavemente a superfície do cérebro, ajustando a coordenada Z em zero.Introduza a agulha de vidro no parênquima cerebral na profundidade desejada. Injete a droga lentamente a uma taxa de cerca de um nanolitro por segundo. Quando o volume desejado for injetado, deixe a droga difundir no parênquima por dois minutos e, em seguida, proceda com a remoção da agulha de forma suave e lenta.Finalmente, feche a ferida cirúrgica com cola e remova o animal do aparelho estereotáxico. Coloque o animal em uma gaiola pré-aquecida para recuperação da anestesia. Agora mostraremos alguns resultados da microinjeção.A lisofosfatidilcolina ou lyin foi injetada no corpo caloso, que produz desmielinização dos feixes de substância branca, para minimizar a lesão cerebral provocada pela agulha de vidro. Apenas 20 litros de lyin foram injetados. A desmielinização é representada pela ausência da expressão da proteína básica da mielina nos feixes de substância branca; obtém-se uma injeção muito precisa e um trajeto de agulha muito estreito minimiza a lesão cerebral.Acabamos de mostrar como construir agulhas de vidro para realizar microinjeções em estruturas cerebrais profundas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter todos os equipamentos e materiais prontos para uso na sala cirúrgica. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Neurociência

Escalável Fluidic Arrays Injector para Viral Segmentação de Intact Circuitos 3-D do cérebro

Fonte: Poland, R. et al. Microinjeção de cérebro de roedores para estudar substratos moleculares do comportamento motivado. J. Vis. Exp. (2015)Neste vídeo, uma configuração de microinjeção cheia de água que consiste em uma seringa e um tubo de microinjetor é usada para a administração precisa do medicamento. Um rato com uma cânula guia pré-implantada é submetido a microinjeção cerebral direcionada, permitindo a administração precisa de agentes terapêuticos em animais acordados com danos mínimos...

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