Name: RhoC Assay Activation GTPase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a quantificar a forma ativa da GTPase RhoC em células usando ensaio pull down. Este método confiável permite estudar a função de RhoC e sua regulação na sinalização celular.

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Departamento de Defesa W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 e W81XWH-08-1-0356

1. Prepare proteína de fusão GST- <ol><li> Stocks de glicerol JM109 bactérias competente, que contenha o primeiro N-terminal 90 aminoácidos da Rho rhotekin ligação de domínio (RBD) subclonado no pGEX3x BamH1/EcoR1 vector são feitas. Para garantir alta eficiência Os seguintes passos devem ser realizados para cada experimento. Em nossa experiência, preparados na hora GST-RBD é a chave para um ensaio robustas e precisas GTPase ativação. </li><li> Adicionar 50 mL (aproximados, não descongelar) do estoque de glicerol a 50 mL de LB ampères e crescer 37 ° C durante a noite com agitação. </li><li> Diluir 1:10 em 500 mL LB-amp e crescer por 1 h. </li><li> GST induzir a produção de proteína com 0,1 mM IPTG durante 2 horas. </li><li> Distribuir uniformemente em garrafas centrífuga e, centrífuga Sorval GSA3 rotor em 5000 RPM 4 ° C por 20 min. </li><li> Ressuspender pellet em frascos de centrífuga, 10 mL de tampão de lise *. * Tampão de Lise bacteriana: sacarose 20%, glicerol 10%, 50 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM Na 2 S 2 O 5, 2 mM MgCl 2, 2 mM DTT, Adicionar PMSF fresco, benzamida, aprotinina e leupeptin. </li><li> Sonicate 2-3 min (isso depende do tipo de sonicador. Usamos um Fischer de Sonic Dismembranator Model 500 fixado em marca 6, o ciclo de 50%). </li><li> Centrífuga, Sorvall SS34, 20 min 10.000 rpm a 4 ° C. Neste ponto, uma pequena alíquota pode ser retirado e dirigida por SDS-PAGE. O gel pode ser manchado coomassie e uma banda deve ser aparente em 46 kDa. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de 50% glutation-Sepharose 4B lama. </li><li> Incubar por 30 min a 4 ° C com rotação. Lavar 3 vezes com tampão de lise. </li><li> Ressuspender contas GST-RBD/glutatione-Sepharose a uma suspensão de 50% (aproximadamente 1 mL) com GST peixe-buffer **. ** Buffer GST-Peixe: Glicerol 10%, 50 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl 2, Adicionar PMSF fresco, benzamida, aprotinina e leupeptin </li></ol> 2. GST-fusion pull down ensaio <ol><li> Use 50-10 x 10 6 células / ensaio </li><li> Lave as células uma vez em PBS gelado, manter as placas de gelo (usamos um prato de vidro plano cheio de gelo) e lise com 0,5 mL de buffer GST-peixe. </li><li> Incubar 5 minutos em gelo, as células colheita usando um policial de borracha ou scrapper plana, transferir para tubo de microcentrífuga e centrifugar 20.000 rpm 5 min a 4 ° C. </li><li> Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco. Tomar 50 mL para determinar Rho total (ou seja, PIB + GTP ligado). </li><li> Adicionar 0,5 mL contas GST-RBD/glutatione-Sepharose e incubar a 4 ° C, durante a noite com rotação. </li><li> Lavar 6x com GST peixe-buffer. </li><li> Contas ressuspender em 40 mL tampão de amostra 2x-Laemelli Neste ponto, a concentração da alíquota total de proteínas Rho tomadas em 2.4 devem ser determinados e 30 mg preparado para ser executado no gel com a amostra de ativação correspondente. </li><li> Amostras ferver a 90 ° C por 5 min, centrífuga e tomar brevemente carga (ou seja, evitar a esferas) sobrenadante e executado em um gradiente de 12% bem 20/04 SDS-PAGE gel. </li><li> Executar gel sem volt superior a 150, a transferência para membrana usando Towbin tampão e corrente constante de 100 W. </li><li> Bloco de membrana com 5% de solução de leite / TBST e sonda com RhoC specfic-anticorpo. </li></ol> 3. Resultados representante Bons resultados deve produzir uma única banda de aproximadamente 22 kDa. Maus resultados produzem múltiplas bandas ou fundo de altura. Este é um indicativo de degradação protéica, lavagem incompleta de amostras ou o uso de velhos GST-RBD. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Três linhas separadas de células expressando diferentes níveis de RhoC GTPase são apresentados para demonstrar os baixos níveis de RhoC ativa e total, altos níveis de RhoC ativa e total ou não RhoC. O blot foi então despojado e reprobed com um anticorpo para o gene de actina casa mantendo a servir como um controle de carga para a proteína RhoC total. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Múltiplas bandas ou resultados do fundo de alta degradação protéica, lavagem incompleta das amostras ou o uso de velhos GST-RBD.

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A etapa mais crítica do procedimento é a geração de novos GST-RBD. Incapacidade de prestar muita atenção para esta etapa é principal razão para o fracasso. Todas as etapas, desde a geração do GST-RBD (1,2) para a incubação durante a noite com o lisado celular (2,5), deve ser feito em um único dia. Outro passo fundamental é a certeza de que existem células suficientes para produzir os lisados ​​celulares. Isto é de particular importância quando se olha para RhoC GTPase, que tende a estar presente em níveis baixos na célu...

<table><tbody><tr><td>Perlas de glutatião-sefarose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Géis Criterion 4-20% Tris-HCl</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

rhoc assay activation gtpase

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase tem homologia de 91% para RhoA GTPase. Devido à sua prevalência nas células, muitos reagentes e técnicas para RhoA GTPase têm sido desenvolvidos. No entanto, RhoC GTPase é expressa em células de câncer metastático em níveis relativamente baixos. Por isso, poucos RhoC-reagentes específicos têm sido desenvolvidos. Nós adaptamos um ensaio de ativação Rho GTPase para detectar RhoC. Esta técnica utiliza um GST-Rho proteína de fusão de ligação de domínio para retirar GTPase RhoC ativo. Além disso, podemos colheita de proteína total no início do ensaio para determinar os níveis do total (GTP e GDP bound) GTPase RhoC. Isso permite a determinação da ativa versus total de GTPase RhoC na célula. Várias versões comerciais deste procedimento têm sido desenvolvidos no entanto, os kits comerciais são otimizados para RhoA GTPase e, normalmente, não funcionam bem para RhoC GTPase. Partes do ensaio ter sido modificado, bem como o desenvolvimento de um anticorpo específico RhoC.

Este protocolo utiliza um pull down ensaio para determinar os níveis de GTPase RhoC ativa dentro das células.

RhoC Assay Activation GTPase

A GTPase RhoC apresenta 91% de homologia com a GTPase RhoA. Devido à prevalência desta última nas células, muitos reagentes e técnicas para a GTPase RhoA foram desenvolvidos. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O método aqui apresentado descreve um ensaio para seguir a activação de factores específicos RhoA GDP / GTP Câmbio (GEFs) em células de cultura, fazendo uso de uma proteína de fusão GST mutante RhoA que tem elevada afinidade para GEFs activados. GEFs são precipitados a partir de lisados ​​celulares, detectadas por Western blotting e quantificada por densitometria.

Afinidade Precipitação do Active Rho-GEFs Usando um GST-marcado Mutant proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados ​​de células epiteliais

Este vídeo demonstra um ensaio de competição para estudar parceiros de proteínas de ligação à GTPase. Utilizando a proteína GTPase ligada a nucleotídeos imobilizada em esferas magnéticas, a ligação competitiva entre dois parceiros de proteína que interagem para o mesmo local de ligação na GTPase pode ser estudada para avaliar as afinidades de ligação dos parceiros de proteína.

Ensaio de ligação de competição para estudar parceiros concorrentes de proteínas de ligação à GTPase

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

Este protocolo compara as afinidades relativas dos parceiros de ligação para GTPases da família Rho, incluindo Rac1. In vivo, as proteínas de ligação a Rac1 competem por uma única interface de ligação, cuja conformação é ditada por um nucleotídeo ligado. O nucleotídeo é importante e difícil de controlar experimentalmente, devido à alta taxa de hidrólise.

Comparando-se a afinidade de proteínas de ligação utilizando ensaios de competição de GTPase

A ligação de trifosfato de guanosina (GTP) é um dos primeiros eventos na ativação do receptor acoplado com proteína G (GPCR). Este protocolo descreve como caracterizar farmacologicamente as interacções específicas de GPCR-ligando, monitorizando a ligação do análogo de GTP radio-marcado, [ 35 S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS), em Resposta a um ligando de interesse.

Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

Aqui descrevemos um protocolo para investigar a Prenilação e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carregamento de GTPase. Esse protocolo consiste em dois métodos detalhados, nomeadamente o fracionamento de membrana e uma GTPase-lig da imunoabsorção do ensaio. O protocolo pode ser utilizado para medir a Prenilação e GTP carregamento de diferentes outras GTPases pequenas.

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

Este relatório descreve a triagem de diferentes detergentes para a preparação do GPCR visual, a rodopsina e seu complexo com mini-Go. São demonstrados métodos bioquímicos caracterizando a qualidade do complexo em diferentes estágios durante a purificação. Este protocolo pode ser generalizado para outros complexos proteicos de membrana para seus futuros estudos estruturais.

Triagem Estratégica e Caracterização do Complexo de Sinalização de Proteínas Visuais GPCR-mini-G para cristalização bem sucedida

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

Estabelecemos um ensaio de remontagem de luciferase dividida para monitorar os contatos retículo-mitocôndria endoplasmática em células vivas. Usando este ensaio, descrevemos um protocolo para medir quantitativamente o nível desses acoplamentos inter-organelas em HEK293T células, sob a condição de tratamento químico.

Ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos de retículo endoplasmático-mitocôndrias em células vivas

O estudo demonstra um ensaio quantitativo baseado em PCR para ativação da via de sinalização Sonic Hedgehog (SHH) mediada por cílios primários usando agonista de SHH em um modelo celular de ciliogênese.

Ensaio quantitativo baseado em PCR para medir a sinalização Sonic Hedgehog em modelo celular de ciliogênese

Aprenda a quantificar a forma ativa da GTPase RhoC em células usando ensaio pull down. Este método confiável permite estudar a função de RhoC e sua regulação na sinalização celular.

RhoC Assay Activation GTPase

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