Name: Enriquecimento de isolamento, e Manutenção de Células-Tronco Meduloblastoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda a isolar, enriquecer e manter células-tronco de meduloblastoma de modelos murinos geneticamente modificados. Este protocolo reduz diferenciação espontânea e morte celular, estabelecendo linhagens proliferativas e multipotentes para estudos de biologia tumoral.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este estudo foi suportado por concessões do Vanderbilt-Ingram Cancer Center de Suporte Grant (P30 CA068485), a Childhood Foundation tumor cerebral e os Institutos Nacionais de Saúde (NS042205).

1. Micro dissecção de Tumor-rolamento Cerebelo, dissociação do tecido tumoral e Galvanização <ol><li> Recuperação do tecido tumoral <ol><li> Meduloblastoma tendo doente camundongos foram muitas vezes runted, exibido hidrocefalia e típicos sintomas neurológicos, incluindo paralisia posterior e insuficiência de recuperar a postura, quando capotou. Para recuperar tecido tumoral, euthanize ratos por inalação de dióxido de carbono. É importante não realizar deslocamento cervical, um procedimento que gera pressão para a posterior do crânio e pode comprometer a integridade do tecido do tumor. </li><li> Decapitação é realizada imediatamente após a morte usando um par de tesouras, a remoção de pêlos e tecido muscular, tanto quanto possível para uma boa visualização do crânio. Limpe a superfície do crânio com Kimwipe embebido com álcool 95%. </li><li> Use uma tesoura fina para cortar uma abertura ao longo da linha média do crânio, e remover o tecido usando uma pinça fina crânio, altura em que todo o cérebro, incluindo tumor-rolamento cerebelo é exposto. </li><li> Enquanto o cerebelo de adultos saudáveis ​​mostrar bem definidas hemisférios e vermis, o cerebelo de camundongos portadores de tumor são muitas vezes alargada, amorfa com uma superfície lisa e vasos sanguíneos visíveis. Usando técnicas estéreis, recuperar o tumor cerebelar usando uma pinça e coloque em PBS gelado sem Mg2 + e Ca 2 +. </li></ol> Nota: todos os instrumentos são esterilizados em etanol 95% antes de usar. </li><li> Dissociação do tecido tumoral <ol><li> Transferir o tecido tumoral a partir de PBS para Accutase 50% (diluído em PBS), que é cerca de 4 vezes o volume do tecido tumoral, mince o tecido com uma tesoura bem por 3 minutos em temperatura ambiente, seguido de incubação a 37 ° C por 4 minutos , após o qual o tecido passa por pipetagem repetitiva com um Pipetman de 1 ml para mais 3 minutos. Este método deve render uma mistura de células isoladas e pequenos agregados celulares. </li><li> Diluir a suspensão celular 3 vezes com PBS e centrifugar por 5 minutos a 1000 g para agregar as células. Ressuspender o pellet celular em meio de cultura fresco neural de células-tronco e em uma placa de 60 milímetros gelatinizado Primaria prato de cultura de tecidos. Usamos pratos Primaria para fixação reforçada em chapeamento em primeiro lugar; passagens subseqüentes podem ser semeados em placas de cultura de tecido normal. </li></ol></li></ol> Nota: pratos Brasão cultura com 0,1% de gelatina por pelo menos 30 minutos. Prepare-tronco neurais fresco meio de cultura celular consistindo de médio Neurobasal com glutamina, Pen-Strep, N2, B27, EGF humano (25 ng / mL) e FGF básico (25 ng / mL). 2. Manutenção, enriquecimento e expansão das células tumorais Meduloblastoma por passagens seriadas Costumamos ter muitas colônias após 1 semana de o início do cultivo (Figura 1). Estas colônias podem ser dissociadas e replated em novos pratos gelatinizado para o enriquecimento da população de células tumorais. Primeira mudança de meio de cultura novo, então simplesmente use um Pipetman de 1 ml para separar mecanicamente colônias seguido por pipetagem repetitiva por 4 minutos para produzir uma suspensão celular (não Accutase necessário). Verificar sob um microscópio para assegurar que aglomerados de grandes células foram dissociadas. Então dispensar suspensão de células em novos pratos gelatinizado para cultura ainda mais e atravessar o mesmo procedimento para passagens adicionais. Células tumorais desapegado, células sanguíneas e outros tipos de células são removidas por série re-chapeamentos, deixando as células do tumor ligado a expandir-se rapidamente. Alterar meio de cultura, no segundo dia após a semeadura inicial, e todos os outros dias depois. 3. A coloração de imunofluorescência e Exame de células cultivadas 1. Cultivar células tumorais em lamínulas No dia 1, coloque uma lamela de vidro em cada um uma placa 6-bem, em seguida, adicionar 0,1% de gelatina por 30 minutos a 37 ° C. Semente de cerca de 2-4X 10 5 células tumorais por ml. As células devem anexar noite eo meio células-tronco neurais mudou no dia 3. Coloração é realizada no dia 4. 2 coloração imunofluorescência Remova o meio de cultura e lave as células duas vezes com PBS gelado. Fixar as células com recém-made PFA 4% por 15 minutos. Brevemente lavar as células duas vezes com PBS e permeablize com Triton 0,3% (em PBS) por 5 minutos. Brevemente lavar as células duas vezes com PBS e bloquear com soro de cabra 10% por 40 minutos. Incubar as células com o anticorpo primário por 90 minutos, depois lave as células três vezes com PBS, por 5 minutos cada. Incubar as células com anticorpo secundário por 60 minutos, depois lavar três vezes com PBS, 5 minutos cada. Monte lamínulas em lâminas com 5 mL de um meio aquoso de montagem e realização de microscopia confocal. 4. Diferenciação das células tumorais Remover nEURAL meio de células-tronco e brevemente lavar as células com PBS duas vezes. Adicionar médio diferenciação no dia 1, a mudança média no dia 4 e determinar o nível de diferenciação por imunofluorescência no dia 7. O meio de diferenciação consiste em DMEM, Pen-Strep e 10% de soro fetal bovino. 5. Resultados representante Resultados morfologia Após o tratamento Accutase pipetagem repetitiva e suave, o tecido do tumor deve ser dissociadas em sua maioria em pequenos agregados celulares e células individuais. Muitas colônias considerável pode ser observado logo em 5 dias após o início do cultivo, como mostrado na Figura 1. Células tumorais altamente proliferativa são muitas vezes bi-polar com relação nuclear / cytoplasmic elevada. Estas células são vistos tipicamente irradiam de pequenos agregados celulares ligados à superfície gelatinizada. Células do sangue, pequenas e redondas, são normalmente removidas por alterações posteriores mídia e chapeamentos serial. Depois de várias passagens, pode-se observar uniformemente distribuída, proliferativa Ki67 + células tumorais e contaminação pouco com outros tipos de células (Figura 2). Expressão de marcadores de células-tronco neurais, análise clonal e diferenciação em múltiplas linhagens Para determinar se as células proliferativas derivado de tumor cerebelar dissociada características do tecido show de células-tronco tumorais, foi realizada a caracterização adicional pela expressão marcador de células-tronco, a análise clonal e potência de diferenciação. Descobrimos que essas células tumorais isoladas altamente expressam marcadores de células-tronco neurais, tais como Sox2 e nestina (Figura 3). À medida que recuperados a partir de tecidos SmoM2-YFP tumor, todas as células do tumor expressar YFP. De acordo com um recente estudo relatando que cílios são importantes para o desenvolvimento de meduloblastoma caminho-dependente Shh 12, SmoM2-YFP expressão foi claramente localizada aos cílios de Sox2 + células tumorais (Figura 3). Quando plaqueadas na densidade clonal de 300 células por mL de meio de cultura, observou-se expansão clonal de uma célula de tumor único para uma colônia de tamanho considerável (Figura 4). Além disso, essas células foram capazes de se diferenciar em vários tipos de células neuronais e gliais, quando cultivado nas condições pro-diferenciação (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Morfologia de uma colônia altamente proliferativa após o plaqueamento primeiro de tecido meduloblastoma dissociados. Geralmente, uma forma considerável colônia dentro de 5 dias após a semeadura inicial de tecido tumoral dissociados, e um representante é ilustrada aqui em campo claro. Bi-polar, irradiar células alongadas a partir de um agregado denso núcleo da célula. Anexado às células tumorais são pequenas, redondas glóbulos vermelhos, que são gradualmente esgotado por chapeamentos serial. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Morfologia das células meduloblastoma estabelecido além de três passagens. Esta imagem de campo claro mostra a aparência típica de células meduloblastoma estabelecido após várias passagens. As células permanecem em sua maioria bi-polar com relação nuclear / cytoplasmic elevada. Mostramos coloração tubulina acetilada das células tumorais, a maioria dos quais de bicicleta, como mostrado pela expressão Ki67 forte. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Meduloblastoma células expressam marcadores estabelecidos células-tronco neurais. SmoM2-YFP marcas células que expressam Smo constitutivamente ativa, portanto, atividade da via Shh. Todas as células das linhas celulares estabelecidas meduloblastoma expressa YFP, ea maioria deles co-expressa altos níveis de vários marcadores de células-tronco neurais, tais como nestina e Sox2. Curiosamente, quando realizamos YFP detecção de sinal com potência do laser mínima durante microscopia confocal, detectamos sinal YFP concentrados nos cílios das células Sox2 +. Esta observação é consistente com um relatório recente que 12 descreveu o papel essencial dos cílios no desenvolvimento de meduloblastoma via dependente de Shh. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Fundada células tumorais sofrer expansão clonal. Depois de dissociação em suspensão única célula, células tumorais foram semeadas em uma placa de 24 poços a uma densidade clonal de 300 células por ml de meio de cultura. Em cada poço observamos colônias clonalmente expandida. Esta série de imagens de campo claro demonstrar alterações típicas ao longo de um período de 10 dias da cultura. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Analisa a diferenciação de células meduloblastoma estabelecida. Quando as células tumorais foram trocados a partir de EGF / bFGF contendo soro livre de médio a DMEM/10% FBS, YFP + células tumorais alteraram significativamente a sua morfologia e diferenciada em vários tipos celulares, incLuding Tuj1 + ou + NeuN neurônios, células GFAP + + CNPase astroglial ou oligodendrócitos.

<ol><li>Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma%3A+From+Molecular+Pathology+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy.</a> Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Neuronal+Precursor+Proliferation+in+the+Cerebellum+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li>
<li>Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).</li>
<li>Wallace, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje-cell-derived+Sonic+hedgehog+regulates+granule+neuron+precursor+cell+proliferation+in+the+developing+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum.</a> Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).</li>
<li>Fan, X., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medullablastoma+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Medullablastoma Stem Cells.</a> J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).</li>
<li>Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+Role+for+Hedgehog+Pathway+Activation+in+Desmoplastic+Medulloblastoma+by+Identifying+GLI1+Target+Genes.+International+journal+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer.</a> 124 (1), 109-109 (2009).</li>
<li>O'Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+anatomic+and+molecularly+targeted+imaging+in+the+diagnosis+and+surveillance+of+embryonal+tumors+of+the+nervous+and+endocrine+systems+in+children.+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+metastasis+reviews%22%5BJournal%5D)">Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review.</a> Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).</li>
<li>Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+Growth+Factor+2+Is+Required+for+Progression+to+Advanced+Medulloblastoma+in+patched1+Heterozygous+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice.</a> Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).</li>
<li>Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Origins+of+Medulloblastoma+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Origins of Medulloblastoma Subtypes.</a> Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).</li>
<li>Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+CD15%2B+Cancer+Stem+Cells+in+Patched-1+Deficient+Mouse+Medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma.</a> Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).</li>
<li>Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Somatic+Mouse+Model+to+Survey+Tumorigenic+Potential+Applied+to+the+Hedgehog+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway.</a> Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).</li>
<li>Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+and+opposing+roles+of+primary+cilia+in+medulloblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development.</a> Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Descrevemos uma forma eficiente para isolar, enriquecer e manter as células-tronco do tecido meduloblastoma tumor primário recuperados de camundongos mutantes com constitutivamente ativa Hedgehog sinalização. Descobrimos que um passo crítico no sucesso estabelecer uma linha saudável tumor de células-tronco é o tratamento Accutase usado durante a dissociação do tecido do tumor primário. Em nossa experiência, quando o tecido do tumor primeiro dissociar do cerebelo, 4 minutos de tratamento Accutase 50% a 37 ° C, seguidos d...

<table><tbody><tr><td>Meio Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B27(-RA)</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td>50%</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td> 0.1%</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2mM</td></tr><tr><td>Placas Primaria</td><td>Fisher Scientific</td><td>087724C</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo Sox2</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4343</td><td>Camundongo, 1:1000</td></tr><tr><td>anticorpo Nestina</td><td>DSHB</td><td>rat401</td><td>Camundongo, 1:200</td></tr><tr><td>anticorpo YFP</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A11122</td><td>Coelho, 1:2000</td></tr><tr><td>anticorpo GFAP</td><td>Neuromics</td><td>CH22102</td><td>Galinha, 1:1000</td></tr><tr><td>anticorpo Tuj1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5076</td><td>Camundongo, 1:2000</td></tr><tr><td>anticorpo NeuN</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB377</td><td>Camundongo, 1:2000</td></tr><tr><td>anticorpo CNPase</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB326</td><td>Camundongo, 1:1000</td></tr></tbody></table>

enriquecimento de isolamento, e manutenção de células-tronco meduloblastoma

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Tumores cerebrais têm sido sugeridos para possuir uma pequena população de células-tronco que são a causa raiz de tumorigênese. Neurosphere ensaios têm sido geralmente adotado para estudar a natureza das células-tronco neurais, incluindo aquelas derivadas de tecidos normais e tumorais. No entanto, quantidades apreciáveis ​​de diferenciação e morte celular são comuns na cultura neurospheres provavelmente devido ao sub-ótimas condições tais como a acessibilidade de todas as células dentro de agregados esfera para meio de cultura. Meduloblastoma, o tumor mais comum do SNC pediátrica, é caracterizada pela sua rápida progressão e tendência a se espalhar ao longo do eixo cérebro-espinhal inteira com o resultado clínico sombrio. Meduloblastoma é um tumor neuroepiteliais do cerebelo, responsável por 20% e 40% dos tumores intracranianos e fossa posterior na infância, respectivamente 1. É agora bem estabelecido que a sinalização Shh estimula a proliferação de precursores granulares do cerebelo neurônio (CGNPs) durante o desenvolvimento do cerebelo 2-4. Numerosos estudos utilizando modelos de ratos, em que a via de Shh é constitutivamente ativado, ligaram sinalização Shh com meduloblastoma 5-9. Um relatório recente mostrou que um subconjunto de células derivadas de meduloblastoma Patched1 ratos LacZ / + são as células-tronco cancerosas, que são capazes de iniciar e propogating tumores 10. Aqui nós descrevemos um método eficiente para isolar, enriquecer e manter células-tronco tumorais derivados de modelos do rato várias meduloblastoma, com constitutivamente ativado via de Shh devido a uma mutação no Smoothened (11, doravante referida como SmoM2), um GPCR, que é fundamental para Shh ativação da via. Em todos os tecidos meduloblastoma isoladas, foram capazes de estabelecer numerosas colônias altamente proliferativa. Estas células robustamente expressa vários marcadores de células-tronco neurais, tais como nestina e Sox2, pode sofrer passagens em série (maior que 20) e foram clonogênica. Embora essas células-tronco cultivadas tumor eram relativamente pequenos, muitas vezes com bipoar nuclear elevada relação entre citoplasmática quando cultivadas em condições favorecendo o crescimento de células-tronco, que alterou drasticamente sua morfologia, estendida vários processos celulares, achatada e retirou-se do ciclo celular após a mudança para uma célula meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino. Mais importante, estas células-tronco tumorais diferenciado em Tuj1 + ou + NeuN neurônios, astrócitos GFAP + e + CNPase oligodendrócitos, ressaltando assim a sua potência multi-. Além disso, essas células eram capazes de propagar meduloblastomas secundário quando ortotopicamente transplantadas em camundongos host.

Este protocolo descreve o isolamento, enriquecimento e manutenção das células do tumor meduloblastoma-tronco derivadas de camundongos mutantes com ectópica atividade da via sonic hedgehog.

Enriquecimento de isolamento, e Manutenção de Células-Tronco Meduloblastoma

Sugeriu-se que os tumores cerebrais possuam uma pequena população de células-tronco que são a causa raiz da tumorigênese. Ensaios de neuroesferas têm sido...

O objetivo geral deste procedimento é isolar, enriquecer e manter células de meduloblastoma de camundongo com propriedades de células-tronco. Isso é realizado primeiramente por meio da dissecação do tecido de meduloblastoma de um camundongo geneticamente modificado. O segundo passo do procedimento consiste na dissociação mecânica e enzimática do tecido tumoral dissecado.O terceiro passo do procedimento é a centrifugação das células tumorais dissociadas, seguida pela remoção da solução enzimática. O passo final do procedimento é o plaqueamento das células tumorais em placas de cultura de tecidos gelatinizadas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a formação de células-tronco de meduloblastoma altamente proliferativas, clonogênicas e multpotentes, capazes de sofrer múltiplos subcultivos e propagar tumores secundários por meio de ensaios de aloenxerto.A principal vantagem desta técnica em relação ao método existente, como o método de cultura de neuroesferas para células-tronco cancerígenas, é que esta técnica permite acesso equivalente aos nutrientes, reduzindo assim a diferenciação espontânea. Na apoptose, os modelos de blastos estoma frequentemente alugados

isolation-enrichment-and-maintenance-of-medulloblastoma-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve o isolamento e dissociação do mouse tecido meduloblastoma, e subsequente allografting das células tumorais em camundongos imunocomprometidos destinatário a fim de iniciar meduloblastoma secundário.

Allografting ortotópico intracraniana de Células Meduloblastoma em camundongos imunocomprometidos

Este protocolo vídeo demonstra o isolamento e expansão de células-tronco como de mutliforme glioblastoma humano ressecado cirurgicamente (GBM) tecido tumoral utilizando o método de cultura neurosphere ensaio.

Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere

A identificação de células de tumor cerebral de iniciação (BTICs), as células raras dentro de uma heterogeneidade de tumores que possuem propriedades de células-tronco, fornece novas pistas sobre patogénese humana de tumor cerebral. Temos refinado condições específicas de cultura para enriquecer para BTICs, e usam rotineiramente citometria de fluxo para enriquecer ainda mais essas populações. A auto-renovação e ensaios de análise por transcrição única célula de RT-PCR pode ser realizada...

Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Células-tronco cancerosas (CSCs) estão implicados na reincidência do tumor devido a chemoresistance. Nós otimizamos um protocolo para a seleção e expansão dos CSCs de linhas celulares de cancro do ovário. Ao tratar as células com a cisplatina quimioterapêutico e a cultura de uma célula-tronco nos meios de promoção para enriquecer culturas CSC não aderentes.

Enriquecimento para resistente à quimioterapia do cancro do ovário células-tronco de linhas de células humanas

Tumor-buscando terapêuticas tronco células mesenquimais (MSCs) mostram a promessa como um tratamento para glioblastoma invasiva. Transplante de ideal envolve entrega de MSCs na cavidade de ressecção do tumor em andaimes. Aqui, pré-clínicos técnicas para estudar o tratamento de MSC do glioblastoma são fornecidas incluindo: ressecção de tumor guiada por imagem; implantação do MSC-semeado andaimes; e terapia pós-operatória de rastreamento.

Ressecção guiada por imagem de Glioblastoma e intracraniana implantação de andaimes terapêuticos de células-tronco-semeado

Este protocolo permite a manutenção de células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes in vitro, imitando o microambiente de medula óssea usando ácidos graxos abundantes, colesterol, menores concentrações de citocinas e hipóxia.

Um método cultural para manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes

Aqui, descrevemos um método de geração de organoides de glioblastoma (GBM) a partir de amostras de pacientes primários ou culturas celulares derivadas do paciente e mantê-los até a maturidade. Esses organoides GBM contêm populações de células fenotipicamente diversas e recriam microambientes tumorais ex vivo.

Manutenção da Diversidade Celular Glioblastoma Humano Ex vivo usando cultura organoide tridimensional

O teor de hidroperóxido lipídico representa o indicador mais comumente usado de morte celular ferroptótica. Este artigo demonstra a análise passo a passo da citometria de fluxo do conteúdo de hidroperóxido lipídico nas células após a indução da ferroptose.

Revelando o fenótipo ferropótico do meduloblastoma

Aqui, descrevemos um sistema de nucleofecção projetado para aumentar a eficiência da entrega de genes em células-tronco neurais expandidas (NSCs) isoladas da zona subventricular murina adulta. Os resultados demonstram que este método melhora significativamente a perturbação gênica em NSCs, superando a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção e aumentando a taxa de sobrevivência celular.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

O presente protocolo descreve um método econômico para purificar, expandir e caracterizar células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) altamente homogêneas de camundongos. Essa abordagem facilita a aquisição de grandes quantidades de BMSCs com alto potencial de proliferação e diferenciação, apoiando modelos de camundongos e avançando na pesquisa pré-clínica.

Purificação, expansão e fenotipagem baseada em citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais da medula óssea derivadas de camundongos

Aprenda a isolar, enriquecer e manter células-tronco de meduloblastoma de modelos murinos geneticamente modificados. Este protocolo reduz diferenciação espontânea e morte celular, estabelecendo linhagens proliferativas e multipotentes para estudos de biologia tumoral.

Enriquecimento de isolamento, e Manutenção de Células-Tronco Meduloblastoma

Explorar mais vídeos