Name: Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprenda microscopia intravital para medir fluxo sanguíneo capilar em músculo esquelético de animais vivos. Esta técnica permite observação contínua da microcirculação com múltiplos parâmetros quantitativos.

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Agradecemos a JW Lichtman ao conselho dele para a observação in vivo dos músculos.

RBC coloração da membrana <ol><li> Os glóbulos vermelhos do mouse foram corrigidos a partir da cepa do mouse mesmo com heparinização. </li><li> Rato RBC foram coradas com corante PKH26 (551/567 nm; kit linker Red fluorescentes das células, Sigma, EUA). </li><li> RBC foram lavados em PBS e incubadas com solução de 2μM PKH26 corante por 5 minutos em temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de plasma (inactivado pelo calor durante 1 hora a 65 ° C antes) e incubadas por 1 minuto. </li><li> A RBC manchadas foram lavadas 5 vezes com PBS. </li></ol> Preparação do mouse <ol><li> Três a seis meses, do sexo masculino C57BL/10 camundongos foram utilizados neste estudo. Nós ratos anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital (50mg/kgBW). </li><li> Camundongos foram, em seguida, intubados com um tubo de polietileno 20-gage, ventilação mecânica, e aquecido a 37 ° C em um aquecedor de folha de Kapton ligado a um sensor termopar e sistema de feedback controlador de temperatura. </li><li> O lado ventral do pescoço foi raspada. Os músculos direito e esquerdo esternomastoideu foram expostos. Os músculos foram apoiados por um suporte de aço inoxidável e com superfused estéril solução de Ringer Krebs. </li></ol> Injeção <ol><li> Hemácias coradas foram aquecidos a 37 ° C, diluído com Krebs Ringer. 50uL da RBC coradas (hematócrito 12%) foi injetado em rato da veia peniana. </li></ol> Na observação microscópica vivo dos músculos esqueléticos Seguimos Jeff W. Lichtman método &#39;s com modificação 1: <ol><li> Animais foram colocados em uma almofada de aquecimento em cima de um palco de ferro hand-made de um microscópio Nikon Eclipse 800. Água-dipping lentes objetivas foram utilizados para a observação ao vivo epi-fluorescente. Observamos PKH26 dentro RBC manchada fluxo de vascular sob luz fluorescente de uma lâmpada de mercúrio. Identificamos arteríolas primário, secundário arteríolas, veias e capilares por suas direções de fluxo de hemácias e arquiteturas. </li><li> Uma Câmera SIT intensificou (Hamamatsu Photonics, C2400, Japão) e vídeo frame-grabber foram instalados para captação do sinal de baixa intensidade na taxa de vídeo em tempo real (30 frames por segundo). As imagens foram gravadas em DVD como arquivos de vídeo. </li></ol> A estimulação muscular <ol><li> Um pulso elétrico foi gerada utilizando um estimulador de nervo periférico (Innervator 252, Fisher &amp; Paykel Healthcare, Nova Zelândia), e entregue à superfície do músculo através de uma sonda revestida inoxidável. A extremidade da sonda menos foi colocada na parte proximal do músculo e um final mais foi colocada na parte distal do músculo. Estímulos tétano foram dados a uma taxa de 50Hz por 5 segundos. Os estímulos elétricos não causar danos musculares, direto na vizinhança da área de contato. </li></ol> RBC análise de fluxo <ol><li> Imagens de vídeo gravadas DVD foram transferidos ficheiros de imagem de vídeo através de software Savant quadro grabber (Vídeo Savant, EUA). Imagens de vídeo foram revistos em velocidade ajustada para visualizar individuais RBC manchado. RBC fluxo foi medida pela contagem RBC, que voou através de uma arteríola foco principal por minuto. </li></ol>

<ol><li>Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+neuromuscular+junctions+over+periods+of+several+months+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice.</a> J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).</li>
</ol>

Todos os procedimentos relacionados aos experimentos com animais foram analisados ​​e aprovados pelo Subcomitê sobre Cuidados Pesquisa Animal do Massachusetts General Hospital.

Entre os principais pontos techinical são as seguintes: (1) manutenção do estado fisiológico do animal (pH ventilação, da temperatura do corpo perfusative solução,), (2) volume de injeção da RBC manchado, e (3) condições para a observação (lente ideal intensidade de seleção, a fluorescência). Potencial de aplicações futuras são as seguintes: (a) combinação com pharmacophysiological e / ou molecular intervenções biológicas, (b) a observação a longo prazo de arterio / arteriolo-esclerose e neovascularização.

<table><tbody><tr><td>Corante PKH26 </td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>551/567 nm; Kit vermelho fluorescente para marcação celular</td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/10 </td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>Machos com três a seis meses de idade</td></tr><tr><td>pentobarbital </td><td></td><td></td><td></td><td>anestésico, 50mg/kg de peso corporal, i.p.</td></tr></tbody></table>

medição in vivo micro-circulação no músculo esquelético por intra-vital microscopia

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

FUNDAMENTO: Os fatores de Regulamentação e fisiologia detalhada na microcirculação vivo permaneceram não totalmente esclarecido depois de muitas diferentes modalidades de imagem tinha inventado. Enquanto muitos parâmetros macroscópicos do fluxo de sangue refletem a velocidade de fluxo, as mudanças na velocidade do fluxo sanguíneo e de glóbulos vermelhos (RBC) de fluxo não mantém relação linear nas observações microscópicas. Há relatos de discrepância entre velocidade e fluxo RBC RBC, fluxo e volume de fluxo RBC plasma, e de heterogeneidade espacial e temporal da regulação do fluxo nos tecidos periféricos em observações microscópicas, uma base científica para a exigência de estudos mais detalhados na regulação da microcirculação usando microscopia intravital. MÉTODOS: Foram modificados método de Jeff Lichtman de observação microscópica em vivo dos músculos esternomastoideu mouse. Os ratos são anestesiados, ventilados, e injetados com PKH26L-fluorescente hemácias marcadas para observação microscópica. RESULTADO E CONCLUSÕES: hemácias fluorescente etiquetado são detectados e distinguidos bem por um microscópio de campo amplo. Contração muscular evocado pelo aumento da estimulação elétrica induzida em RBC fluxo. Quantificação de outros parâmetros, incluindo RBC velocidade ea densidade capilar foram viável. Camundongos bem tolerada a cirurgia, a injeção de hemácias marcadas, observação microscópica e estimulação elétrica. Nenhum músculo ou danos dos vasos sanguíneos foi observada, sugerindo que o nosso método é relativamente menos invasivo e adequado para observações a longo prazo.

Um novo método versátil para a observação da microcirculação é apresentado. Ele é considerado adequado para observação a longo prazo, e para combinação com pharmacophysiological ou molecular intervenções biológicas.

Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

CONTEXTO: Os fatores regulatórios e a fisiologia detalhada da microcirculação in vivo permaneceram não totalmente esclarecidos após muitas modalidades diferentes de ...

Olá, meu nome é Aki, sou pesquisador colaborador da Harvard Medical School, no Massachusetts General Hospital. Neste periódico em vídeo, apresentarei um novo método de microscopia in vivo. Com esta técnica, podemos medir o fluxo sanguíneo quantitativo na microsecreção.O objetivo do nosso experimento é estabelecer um sistema para a medição contínua da microsecreção in vivo. Projetamos este estudo para visualizar o fluxo sanguíneo ao nível dos capilares e anteriores nos músculos de animais vivos sob o microscópio, comparado ao método convencional de medição iônica in vivo, como ultrassom sanguíneo ou tensão de oxigênio; o nosso permitirá a medição de múltiplos parâmetros do fluxo sanguíneo, nomeadamente o fluxo de hemácias ou velocidade de obstrução e o fluxo plasmático. A medição desses parâmetros revelará alterações na microcirculação com maior detalhe.Em seguida, nosso método é aplicado para detectar alterações no fluxo sanguíneo em resposta à estimulação fisiológica em tecidos musculares vivos. Nosso método é mais simples e menos invasivo do que a microscopia convencional in vivo, de modo que os músculos ficam diretamente acessíveis e somos capazes de aplicar estimulação fisiológ

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Biologia

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

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A camada de superfície endotelial glicocálice / endotelial está idealmente estudada por microscopia intravital. Microscopia intravital é tecnicamente desafiante em um órgão em movimento, tais como o pulmão. Demonstramos como brightfield simultânea e microscopia de fluorescência pode ser utilizado para estimar a espessura da camada endotelial da superfície em um movimento...

Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial

Neste artigo, apresentamos um método para analisar microvasos tumorais in vivo utilizando dinâmica com contraste de fluorescência videomicroscopia. Dois parâmetros quantitativos foram adquiridos: densidade capilar funcional refletindo a vascularização do tumor, e perdas de índice que reflete o vazamento de parede endotelial.

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Microscopia intravital do cremaster microcirculação rato M. oferece um único e bem padronizados modelo in vivo para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas.

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In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

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Combinado de microscopia Intravital e ultra-sonografia contraste aprimorado do membro posterior Mouse para estudar a vasodilatação induzida por insulina e perfusão muscular

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Avaliação da função Microvascular de tecido adiposo humano usando tele-microscopia

Aqui, descrevemos uma abordagem simples e não-invasiva usando espectroscopia de infravermelho próximo para avaliar hiperemia reativa, acoplamento neurovascular e capacidade oxidativa do músculo esquelético em uma única visita clínica ou laboratório.

Acoplamento de Neurovascular do músculo esquelético, capacidade oxidativa e função Microvascular com 'Balcão único' espectroscopia de infravermelho próximo

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Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

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