Name: Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Aprenda a hibridização in situ por fluorescência dupla em seções frescas de cérebro para detectar dois transcritos simultaneamente com resolução de célula única. Este método avança estudos em neurociência molecular.

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Trabalho suportado por concessões de NIH / NIDCD ea Fundação Schmitt para RP.

Este protocolo foi desenvolvido e aperfeiçoado com base no padrão radioativos e não radioativos métodos de hibridização in-situ, anteriormente desenvolvido por nós e outros para detectar uma ou duas espécies transcrição no tecido cerebral 1-7. O protocolo descrito a seguir tem um comprimento total de 2 ou 3 dias, dependendo do número de interrupções processual escolhida pelo usuário final. Todas as etapas detalhadas abaixo devem ser realizados à temperatura ambiente, com exceção da etapa de hibridização riboprobe e pós-hibridação lavagens. As soluções e buffers exigido para todos os passos envolvidos neste método podem ser encontrados no final do presente protocolo. 1. Preparação do tecido e Seccionamento <ol><li> Decapitar e extrair o cérebro do sujeito rapidamente, e colocá-lo em um molde de plástico de tamanho adequado. </li><li> Cobrir o cérebro com Tissue-Tek meio de incorporação e rapidamente coloque o molde de plástico em um banho dry-ice/alcohol para o congelamento rápido. Tecido congelado pode ser armazenado a -80 ° C até o uso. </li><li> Utilizando um criostato, recolher 2 ou 3 seções do cérebro por slide em Superfrost cobrado Além disso slides. Espessura das seções devem ser 10-12 mM. Lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C até o uso. </li></ol> 2. Preparação de Sephadex G50 Colunas para Purificação Probe "Colunas Sephadex podem ser adquiridos de fontes comerciais, no entanto, oferecemos a seguir uma alternativa de baixo custo para a geração de colunas, o que será necessário para a purificação da sonda. <ol><li> Quantidade adequada de hidrato de Sephadex G50 em pó com RNase-free, água DEPC-tratados (por exemplo, 2 g de pó em 100 ml de água tratada DEPC-), brevemente solução misturar e armazenar à temperatura ambiente para precipitar o excesso Sephadex G50. </li><li> Remover o sobrenadante (camada superior de água), após precipitação Sephadex G50. </li><li> Repita o processo acima 3-5 vezes. </li><li> Após a lavagem final, re-suspender a Sephadex G50 solução em tampão TE (1:1), e armazenar a 4 ° C até o uso. </li><li> Lugar autoclavado lã de vidro para uma seringa estéril 1 ml e comprimi-lo com o êmbolo para fazer uma camada compacta na parte inferior, e em seguida coloque a seringa em um tubo Falcon 15 ml. </li><li> Misture bem a solução de Sephadex G50 em TE. Encha a seringa / coluna com esta solução. </li><li> Centrifugar a coluna por 30 segundos a 1000 rpm. </li><li> Repita este procedimento até que a coluna é quase completamente preenchida com Sephadex G50 contas. </li><li> Aplicar 200 mL de tampão de lavagem coluna para a coluna e centrifugar por 2 min a 1000 rpm. Descartar por escoamento. </li><li> Aplicar 200 mL de tampão de bloqueio coluna para a coluna e gire-a para 2 min a 1000 rpm. Repita este passo 4-5 vezes para equilibrar coluna. As colunas podem ser armazenados a 4 ° C até o uso se selado com Parafilm. </li></ol> 3. Rotulagem e Purificação de Riboprobes Abaixo detalhamos a geração e purificação de riboprobe único. Para dFISH, a preparação de cada sonda irá envolver a mesma metodologia, exceto que uma das sondas será marcada com digoxigenina (DIG) marcadas UTP enquanto o outro com biotina marcadas UTP. <ol><li> Preparar um concentrado (&gt; 150 ng / mL) e purificado solução linearizada cDNA de interesse para gerar um sentido (controle) ou riboprobes antisense. </li><li> Em um microtubo de 1,5 ml, adicionar 0,5-1 mg de purificada modelo de cDNA, 2 mL de tampão 5X sonda rotulagem, 1 ml de 10X DIG (ou biotina), rotulagem mix, 0,5 mL de RNasin e 1 ml da RNA polimerase adequada , e trazer o volume final da solução para 10 ml com RNAse-free (DEPC-tratados) de água. </li><li> Incubar a solução em um banho de água a 37 ° C por 2 horas. </li><li> Adicionar 1 ml de tRNA (estoque, 20 mcg / mL), e 39 mL de tampão coluna de bloqueio para a solução. </li><li> Prepare o Sephadex G50 coluna para purificação da sonda. Para este fim, adicionar 50 mL tampão de bloqueio para a coluna e gire-a por 10 segundos a 1000 rpm. Repita este passo 2-3 vezes para equilibrar a coluna (ou seja, o total de 50 mL aplicada à coluna são recuperados após o ciclo de centrifugação). </li><li> Aplique a solução sonda para a coluna de Sephadex G50 posição, um tubo de microcentrífuga novo na parte inferior da coluna, e girá-lo por 3 min a 1000 rpm para obter o purificada 50 ml de solução riboprobe. </li><li> Avaliar a qualidade e rendimento de riboprobe rotulados usando um padrão de formaldeído-agarose gel RNA, ou um espectrofotômetro. </li></ol> 4. Pós-fixação Acetilação e Hibridização <ol><li> Remove seções do freezer -80 ° C e permitir uma temperatura ambiente para equilibrar. Posteriormente, incubar seções em um frio, solução de paraformaldeído recém-made de 3% para 5 min. </li><li> Brevemente lavar seções em phosphate solução salina tamponada (PBS) por duas vezes. </li><li> Desidratar seções através de uma série de álcool normal (70, 95 e 100%; 2 min cada), e deixe-os secar ao ar. </li><li> Incubar seções em uma solução de acetilação de 10 min. </li><li> Enxágüe seções 3 vezes em 2X SSPE. </li><li> Desidratar seções, mais uma vez através da série de álcool padrão descrito acima, e permitir-lhes-ar seco. </li><li> Prepare um volume adequado de solução de hibridação e adicionar tanto riboprobes para a solução (concentração da sonda: 1 ng / mL para cada sonda). Volume total da solução de hibridização é determinada com base no número de seções para ser hibridizado (16 ml de solução de hibridização por seção). </li><li> Aplicar volume adequado da solução de hibridização para o tecido e lamínula slides garantir que nenhum ar overlay bolhas no tecido. </li><li> Coloque as lâminas em porta-lâminas de metal. Titular mergulhe em um banho de óleo mineral regulado a 65 ° C durante a noite. Garantir que as lamínulas são virados para cima (ou seja, o aspecto lateral do compartimento de slides deve estar em contato com o fundo do recipiente de óleo mineral). </li></ol> 5. Pós-hibridação Lava <ol><li> No dia seguinte, remova cuidadosamente o suporte de slides do banho de óleo mineral e enxaguá-lo brevemente em clorofórmio para remover o excesso de óleo do slides. </li><li> Coloque as lâminas em uma solução de SSPE 2X de 5-10 min. Lamínulas devem separar de slides enquanto em solução. </li><li> Transferir as lâminas para uma nova solução de SSPE 2x, e mantê-los por 1 hr em temperatura ambiente. </li><li> Transferência de seções em uma solução contendo 2X SSPE além de formamida 50%. A temperatura desta solução deve coincidir com a temperatura utilizada no processo de hibridização durante a noite. Mantenha slides nesta solução por 1,5 hr. </li><li> Transferência de seções para uma solução de SSPE 0,1 x pré-aquecida à mesma temperatura da hibridação. Incubar seções nesta solução por 30 min. Repita este passo para um adicional de 30 min. </li></ol> 6. Detecção e Visualização de Riboprobes <ol><li> Transferência de slides para o buffer TNT em que o peróxido de hidrogênio 0,3% foi adicionado, por 10 min. </li><li> Lave os cortes em TNT buffer, 3 vezes (10 min cada). </li><li> Usando uma caneta DAKO, desenhe um bem ao redor da área que contém as seções do cérebro. Importante, devem ser tomadas precauções para garantir que as seções não seca. </li><li> Aplicar 150 mL de tampão TNB a cada slide, e incubar seções nesta solução por 30 min, em câmara úmida. </li><li> Remoção da solução TNB excesso de slides de inclinação. </li><li> Aplicar 150 mL de solução contendo TNB conjugado com peroxidase de anticorpos anti-DIG e slides armazenar em câmara úmida por 2 horas. Concentração de anticorpos deve ser determinada individualmente para cada transcrição de interesse antes da realização dFISH. </li><li> Lave os cortes em TNT buffer; 3 vezes, 10 min cada. </li><li> Aplicar 150 mL de Alexa 594-conjugados solução tiramida trabalhando para cada slide, e armazená-los em câmara úmida por 1 hora. Esta solução deve ser preparada de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Lave os cortes em TNT buffer; 3 vezes, 10 min cada. </li><li> Seções incubar em tampão TNT para que o peróxido de hidrogênio 0,3% foi adicionado para 10-30 min. </li><li> Lave os cortes em TNT buffer; 3 vezes, 10 min cada. </li><li> Aplicar 150 mL de tampão TNB por lâmina, e mantê-los em câmara úmida por 30 min. </li><li> Remoção da solução TNB excesso de slides de inclinação. </li><li> Adicionar 150 mL de solução contendo TNB conjugado com peroxidase de anticorpos anti-biotina, e slides armazenar em câmara úmida por 2 horas. </li><li> Lave os cortes em TNT buffer; 3 vezes, 10 min cada. </li><li> Aplicar 150 mL de uma Alexa 488-conjugados solução tiramida trabalhando para os slides e seções incubar por 1 hora. Esta solução deve ser preparada de acordo com as recomendações do fabricante. </li><li> Lave os cortes em TNT buffer; 3 vezes, 10 min cada. </li><li> Adicionar 150 mL de solução de Hoechst (1:1000 em TNT buffer) para as seções e mantê-los na câmara úmida por 2 min. </li><li> Lavar as seções em TNT buffer; 3 vezes, 5 min cada. </li><li> Seções lamela com uma média de fluorescência compatível com a montagem (por exemplo, Vectashield ou prolongar Antifade). </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Mostramos aqui os resultados obtidos dFISH representante no cérebro de tentilhões-zebra. Mostrados são fotomicrografias obtidas a partir da nidopallium caudomedial (NCM), o análogo songbird do córtex auditivo de mamíferos. Seções do cérebro foram hibridizados com uma riboprobe biotinilado contra parvalbumina (A), um marcador para uma sub-população de neurônios inibitórios, e um DIG marcado ribosonda dirigida contra o dependente de atividade do gene Zenk (B), um marcador confiável para a canção-driven neurônios. C) Sobreposição de (A) e (B) mostra uma população de neurônios inibitórios que são ativadas pela experiência auditiva. Flechas e setas indicam células marcadas exclusivamente com cada um dos dois riboprobes, e asteriscos mostram neurônios representante co-expressar tanto transcrições de interesse. Barra de escala = 25 mm.

<ol><li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li>
<li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22+Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li>
<li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digoxigenin%3Aanti-digoxigenin+%28DIG%29+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li>
<li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes%3A+facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li>
<li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li>
<li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li>
<li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+participate+in+the+brain%27s+response+to+birdsong+auditory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li>
<li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós temos usado esse protocolo para estudar como o cérebro dos vertebrados é neuroquimicamente e funcionalmente organizado, e para determinar como comportamentalmente relevante impacto estímulos sensoriais as máquinas genômica de neurônios no cérebro adulto 80-10. Temos utilizado com sucesso este método em tecido cerebral de camundongos, ratos e pássaros, mas antecipamos que este protocolo será facilmente adaptável às seções do cérebro obtidas a partir de uma variedade de espécies de vertebrados e, talvez, nã...

Soluções <ol><li> Tampão da coluna de lavagem: 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 mcg / mL tRNA, SDS 0,1% em 50 ml de água DEPC-tratada. </li><li> Tampão da coluna de bloqueio: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA em 50 ml de água DEPC-tratada. </li><li> TNT buffer: 60 ml de 1 M Tris-HCl, 18 ml de 5 M NaCl e 1,8 ml de Triton X-100 em 600 ml de água tratada DEPC-. </li><li> TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8,3 mg / mL BSA, 0,15 M NaCl e Triton 3% X-100 em DEPC tratados com água. </li><li> TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, acrescido de 1 mM EDTA, pH 7.5. </li><li> Acetilação solução: 2,7 ml de trietanolamina mais 0,5 ml de anidrido acético em 200 ml de água tratada DEPC-. </li><li> Solução de hibridização: formamida 50%, 2X SSPE, 2 mg / mL tRNA, 1 mg / mL BSA e 1 mg / mL poli A em água DEPC-tratada. Ela precisa de 16 l por seção. </li></ol>

fluorescência dupla in situ hibridação nas seções cérebro fresco

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Aqui nós descrevemos uma versão modificada de uma dupla de fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação método (dFISH) otimizado para a detecção de dois mRNAs de interesse em novas seções cérebro congelado. Nosso grupo tem utilizado com sucesso esta abordagem para o estudo de genes co-regulação. Mais especificamente, temos utilizado este método dFISH para explorar a organização anatômica, propriedades neuroquímicos, eo impacto da experiência sensorial no centro de circuitos sensoriais, em resolução única célula. Este protocolo foi validado no tecido cerebral de camundongos, ratos e pássaros, mas é esperado para ser facilmente adaptável a outras espécies de vertebrados, bem como para uma matriz de não-tecidos neurais. Neste filme, nós fornecemos uma demonstração detalhada dos principais passos deste procedimento.

Este protocolo envolve um não-radioativo<em&gt; In-situ</em&gt; Processo de hibridação que permite a identificação simultânea de duas espécies de transcrição, com uma resolução única célula, em seções finas do cérebro dos vertebrados.

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Aqui descrevemos uma versão modificada de um método de hibridização in situ fluorescente dupla (dFISH) otimizada para a detecção de dois mRNAs de interesse em amostras frescas de...

Olá, sou pesquisador pós-doutorando no laboratório de AL, na Universidade de Rochester. Mostraremos a vocês o processo de hibridização por digestão dupla em seções cerebrais congeladas frescas para detectar simultaneamente dois transcritos de MRN com resolução em nível celular. Este método pode auxiliar em questões no campo da neurociência, como aquelas relacionadas à organização anatômica, funcional, molecular e neuroquímica de um circuito cerebral específico.Embora este método possa fornecer informações sobre a coagulação gênica em neurônios do cérebro AV, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como roedores, bem como a uma variedade de tecidos neurais. Para iniciar este procedimento, hidrate uma quantidade adequada de pó SDX G 50 com RNAs por meio de água.Misture brevemente a solução e armazene em temperatura ambiente por dois a cinco minutos. Este passo separa as microesferas SDX da dextrose presente no pó sedex comercial após a precipitação com Sedex G 50. Remova o sennet e repita o processo três a cinco vezes; após a lavagem final, ressuspenda a solução de SX G 50 em tampão TE numa proporção de um para um entre volume de tampão e volume de microesferas e armazene a q

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples de células de imagem fluorescente etiquetado em fatias grossas semi-cérebro. Através da fixação, corte, limpeza e opticamente tecido cerebral descrevemos como imagens de epifluorescência ou confocal padrão pode ser usado para visualizar as células individuais e redes neuronal no tecido nervoso intacto.

Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinando hibridização de fluorescência dupla  in situ com imunomarcação para detecção da expressão de três genes em seções cerebrais de camundongos. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra o uso de hibridização in situ de fluorescência dupla para visualizar a expressão de dois alvos de RNA em seções cerebrais de camundongos. O protocolo envolve a detecção sequencial de RNA usando sondas marcadas com isotiocianato de fluoresceína e digoxigenina, seguida de...

 Realizando hibridização in situ de fluorescência dupla para detectar a expressão gênica em seções cerebrais de camundongos

Fonte: Baleriola, J., et. al., Detecção de mRNAs localizados axonalmente em seções cerebrais usando hibridização in situ de alta resolução.  J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra a detecção de mRNA dentro de axônios colinérgicos em fatias fixas de hipocampo de camundongo usando hibridização in situ fluorescente e coloração de anticorpos. A microscopia de fluorescência revela a localização espacial de mRNAs marcados com sonda e colina acetiltransferase em neurônios colinérgicos.

Imunocoloração de neurônios em fatias de cérebro de camundongo após hibridização in situ fluorescente

A hibridização in situ (ISH) de RNA permite a visualização de RNAs em células e tecidos. Aqui, mostramos como a combinação de RNAscope ISH com imuno-histoquímica ou corantes histológicos pode ser usada com sucesso para detectar mRNAs localizados em axônios em seções de cérebros de camundongos e humanos.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar especificamente diferentes regiões do sistema nervoso central C57BL/6 por meio de eletroporação in utero. Incluídas neste protocolo estão instruções detalhadas para transfecções de regiões que se desenvolvem no córtex, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo septal lateral e estriado.

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

A técnica de flutuação livre permite que os pesquisadores realizem colorações histológicas, incluindo imuno-histoquímica em seções de tecido fixas para visualizar estruturas biológicas, tipo de célula e expressão e localização de proteínas. Esta é uma técnica histoquímica eficiente e confiável que pode ser útil para investigar uma infinidade de tecidos, como cérebro, coração e fígado.

Coloração histológica usando seções de tecido flutuantes livres

Este protocolo descreve um método para combinar hibridização in situ fluorescente (FISH) e imunohistoquímica de fluorescência (IHQ) em cortes frescos congelados e fixos de camundongos em cérebros, com o objetivo de obter sinais de FISH multimarcados e IHC de fluorescência. IHQ teve como alvo proteínas citoplasmáticas e ligadas à membrana.

Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos

Apresentamos um protocolo detalhado para microscopia eletrônica e de luz correlativa pós-incorporação de Epon usando uma proteína fluorescente chamada mScarlet. Este método pode manter a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Esta técnica é passível de uma ampla variedade de aplicações biológicas.

Epon Post Embedding Correlative Light e Microscopia Eletrônica

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Este estudo apresenta um protocolo simplificado para processamento de tecidos envolvendo decapitação, fixação, criosecção, coloração de fluorescência, imunocoloração e imagem, que pode ser estendido para imagens confocais e multifotônicas. O método mantém uma eficácia comparável a dissecções complexas, ignorando a necessidade de habilidades motoras avançadas. A análise quantitativa de imagens fornece amplo potencial investigativo.

Crioseccionamento direto de cabeças de Drosophila para coloração e imunocoloração aprimoradas de fluorescência cerebral

Aprenda a hibridização in situ por fluorescência dupla em seções frescas de cérebro para detectar dois transcritos simultaneamente com resolução de célula única. Este método avança estudos em neurociência molecular.

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

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