Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco
14 de agosto de 2010
Este protocolo envolve um não-radioativo In-situ Processo de hibridação que permite a identificação simultânea de duas espécies de transcrição, com uma resolução única célula, em seções finas do cérebro dos vertebrados.
Olá, sou pesquisador pós-doutorando no laboratório de AL, na Universidade de Rochester. Mostraremos a vocês o processo de hibridização por digestão dupla em seções cerebrais congeladas frescas para detectar simultaneamente dois transcritos de MRN com resolução em nível celular. Este método pode auxiliar em questões no campo da neurociência, como aquelas relacionadas à organização anatômica, funcional, molecular e neuroquímica de um circuito cerebral específico.
Embora este método possa fornecer informações sobre a coagulação gênica em neurônios do cérebro AV, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como roedores, bem como a uma variedade de tecidos neurais. Para iniciar este procedimento, hidrate uma quantidade adequada de pó SDX G 50 com RNAs por meio de água.
Misture brevemente a solução e armazene em temperatura ambiente por dois a cinco minutos. Este passo separa as microesferas SDX da dextrose presente no pó sedex comercial após a precipitação com Sedex G 50. Remova o sennet e repita o processo três a cinco vezes; após a lavagem final, ressuspenda a solução de SX G 50 em tampão TE numa proporção de um para um entre volume de tampão e volume de microesferas e armazene a quatro graus Celsius até o uso.
Em seguida, prepare as colunas. Coloque algodão hidrófilo esterilizado em uma seringa estéril de um mililitro e comprima-o com o êmbolo para formar uma camada compacta na base. Em seguida, coloque a seringa em um tubo cônico de 15 mililitros.
Encha as colunas com solução Sedex G 50 por meio de centrifugação a 1000 rotações por minuto durante 30 segundos, utilizando uma centrífuga Beckman equipada com rotor fixo angular C 0 6 5 0. Após a centrifugação, lave cada coluna aplicando 200 microlitros de tampão de lavagem das colunas e centrifugando por dois minutos a 1000 rotações por minuto.
Como antes. Finalmente, aplique 200 microlitros de tampão bloqueador da coluna a cada coluna e centrifugue por dois minutos a 1000 rotações por minuto. Repita este passo quatro a cinco vezes para equilibrar a coluna.
Armazene as colunas preparadas a quatro graus Celsius até que a sonda RIBA seja marcada e pronta para purificação para a hibridização por dupla fluorescência em C dois ou procedimento D FISH mostrado aqui, duas sondas de RNA são preparadas, uma marcada com doxigenina ou DIG e a outra com biotina. Inicie o marcamento das sondas preparando as soluções de marcação de sonda de riboprobe e incubando as reações de marcação em banho-maria a 37 graus Celsius por duas horas. Ao final da incubação de duas horas, adicione um microlitro de TRNA a 20 microgramas por microlitro e 39 microlitros de tampão bloqueador da coluna a cada reação de marcação.
Em seguida, prepare as colunas EDEX G 50 para purificação da sonda adicionando 50 microlitros de tampão bloqueador a cada coluna e centrifugando por três minutos a 2000 rotações por minuto. Repita este passo duas a três vezes para equilibrar as colunas. Quando as colunas estiverem prontas, coloque um novo tubo EEND orph na base da coluna.
Aplicar a solução da sonda à coluna Sedex G 50 e centrifugar por três minutos a 2000 rotações por minuto. Para obter os 50 microlitros purificados da solução de sonda de Ribo, avaliar a qualidade e o rendimento da sonda de ribo marcada e purificada. Antes de prosseguir para a hibridização usando um criostato, coletar duas ou três secções cerebrais em lâminas charge super frost plus.
A espessura da seção deve ser de 10 a 12 mícrons. As lâminas podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius até o uso. Incube as seções em solução fria de paraformaldeído a 3%, recém-preparada, por cinco minutos.
Em seguida, lave brevemente as seções duas vezes em PBS. A seguir, desidrate as seções por meio de uma série padrão de álcoois com soluções de etanol a 70, 95 e 100% por dois minutos em cada solução. Após a desidratação das seções, incube-as em solução de acetilação recém-preparada por 10 minutos.
Em seguida, lave as seções três vezes em SSPE 2x e desidrate as seções após a acetilação novamente por meio da série padrão de álcoois, conforme acabou de ser mostrado. Agora inicie a hibridização com a sonda ribo. Aplique um volume adequado da solução de hibridização ao tecido, cubra as lâminas com lamínulas e coloque as lâminas em um suporte metálico para lâminas.
Mergulhe o porta-lâminas em um banho de óleo mineral ajustado a 65 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, remova cuidadosamente o porta-lâminas do banho de óleo mineral e enxágue brevemente em clorofórmio para remover o excesso de óleo dos lâminas.
Coloque as lâminas em uma solução SSPE 2 vezes durante cinco a 10 minutos para remover a lamínula. Após a remoção da lamínula, transfira as lâminas para uma nova solução SSPE 2 vezes e mantenha-as por uma hora à temperatura ambiente. No início deste passo de incubação, aqueça previamente a solução de SSPE 2 vezes mais 50% formamida à mesma temperatura utilizada na hibridização. Prossiga ao final da incubação de uma hora.
Transfira as lâminas para a solução de SSPE duas vezes pré-aquecida e incube por 1,5 hora. No início desta etapa de incubação, pré-aqueça uma solução de SSPE 0,1 vezes à mesma temperatura utilizada na etapa de hibridização. Conclua as lavagens pós-hibridização transferindo as lâminas para a solução de SSPE 0,1 vezes PRÉ-AQUECIDA e incube por 30 minutos.
Repita esta lavagem uma vez. Os cortes cerebrais estão agora prontos para detecção e visualização das sondas ribossômicas hibridizadas: adicione 0,3% de peróxido de hidrogênio ao tampão TNT e incube as lâminas nesta solução por 10 minutos. Em seguida, lave as lâminas no tampão TNT três vezes, por 10 minutos cada vez, utilizando uma caneta de descontaminação.
Desenhe um poço ao redor da área contendo as seções cerebrais. Aplique 150 microlitros de tampão TNB em cada lâmina e incube as seções nesta solução por 30 minutos. Certifique-se de que as seções não sequem durante este passo.
Em seguida, aplique 150 microlitros de solução TT NB contendo anticorpo anti-DIG conjugado à peroxidase e armazene as lâminas em uma câmara úmida por duas horas. Ao final da incubação de duas horas, lave as seções em tampão TNT três vezes por 10 minutos. Em cada lavagem, aplique 150 microlitros de solução trabalho de T IDE conjugado ao Alexa 5 9 4 em cada lâmina e armazene as lâminas em uma câmara úmida por uma hora.
Após uma hora, lave as seções em tampão TNT três vezes, durante 10 minutos cada. Incube as seções em solução de peróxido de hidrogênio 0,3% em tampão TNT por 10 a 30 minutos a cada vez. O tempo de incubação na solução de peróxido de hidrogênio depende da abundância de mRNA e deve ser testado previamente ao D fish.
Em seguida, lave as seções em tampão TNT três vezes, por 10 minutos cada vez. Aplique 150 microlitros de tampão TMB por lâmina e mantenha as lâminas em uma câmara úmida por 30 minutos. Remova o excesso de solução TMB inclinando as lâminas.
Adicione 150 microlitros de solução de TMB contendo anticorpo secundário conjugado à peroxidase e armazene as lâminas em uma câmara úmida por duas horas. Em seguida, lave as seções em tampão TNT três vezes durante 10 minutos. A cada lavagem, aplique 150 microlitros de uma solução trabalho de ácaro conjugado com Alexa 488 às lâminas e incube as seções por uma hora.
Em seguida, lave as seções em tampão TNT três vezes, durante 10 minutos cada vez. Agora que ambas as sondas ribonucleicas estão marcadas por anticorpos, incube as seções em 150 microlitros de solução hospedeira por dois minutos. Depois, lave as seções em tampão TNT três vezes, durante cinco minutos cada vez, adicione um meio de montagem compatível com fluorescência, como Vector Shield ou Prolonged Antifa, às seções, cubra com uma lamínula e observe ao microscópio de fluorescência.
Essas microfotografias representativas são de um experimento com peixe D utilizando cortes cerebrais de tentilhão-zebra, especificamente da região NCM, o análogo aviar da córtex auditiva de mamíferos. Cortes cerebrais foram hibridados com duas sondas, uma sonda ribonucleotídica biotinilada direcionada contra parvalbumina, um marcador para uma subpopulação de neurônios inibitórios, e uma sonda ribonucleotídica marcada com DIG direcionada contra o gene dependente de atividade zinc, um marcador confiável para neurônios ativados pela exposição à canção. Uma sobreposição das duas imagens mostra uma população celular de neurônios inibitórios que são ativados pela experiência auditiva.
As setas indicam células marcadas exclusivamente com a sonda ribo para par. As setas de albúmina indicam células marcadas exclusivamente com a sonda RIBA para zinco; neurônios representativos que coexpressam ambos os transcritos de interesse são marcados com asterisco. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter sua bancada limpa e usar soluções, plásticos e vidrarias livres de contaminação.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como detectar simultaneamente duas espécies de MA, com resolução de única célula em cortes cerebrais recém-congelados, para estudar a co-regulação gênica no cérebro de roedores. Obrigado por assistir ao vídeo. Boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este protocolo envolve um procedimento de hibridização in situ não radioativo que permite a identificação simultânea de duas espécies de transcritos, com resolução em nível de única célula, em cortes finos do cérebro de vertebrados. Este método pode ajudar a responder questões relacionadas à organização anatômica, funcional, molecular e neuroquímica dos circuitos cerebrais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise de expressão gênica
- Técnicas de hibridização in situ
Contexto
- Este método permite a detecção de múltiplos transcritos em um único experimento.
- Pode ser aplicado a diversos tecidos neurais, incluindo aqueles provenientes de roedores.
- Compreender a expressão gênica em neurônios é fundamental para a pesquisa em neurociência.
- A técnica fornece informações sobre a organização molecular dos circuitos cerebrais.
Objetivo do Estudo
- Detectar simultaneamente dois transcritos de mRNA em seções do cérebro.
- Explorar a regulação gênica em populações neuronais específicas.
- Aprimorar a compreensão da organização funcional do cérebro.
Métodos Utilizados
- Procedimento de hibridização in situ não radioativo.
- Preparação de cortes cerebrais frescos congelados.
- Digestão híbrida simultânea de transcritos.
- Visualização de transcritos com resolução em nível de célula única.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de duas espécies de transcritos em seções cerebrais.
- Demonstrou a aplicabilidade do método a diversos tecidos neurais.
- Forneceram informações sobre os padrões de expressão gênica em neurônios.
- Contribuíram para a compreensão da base molecular da função cerebral.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para o estudo da expressão gênica no cérebro.
- Pode ser utilizado em diversos contextos de pesquisa dentro da neurociência.
- Este método aprimora a capacidade de investigar circuitos neurais complexos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método dFISH permite a detecção simultânea de dois transcritos de mRNA com resolução de única célula em seções cerebrais congeladas frescas, apoiando a desmistificação mecanicista na validação de alvos ao revelar padrões de co-regulação gênica em populações neuronais definidas. A abordagem fornece confiança preditiva para ensaios subsequentes ao estabelecer relações espaciais e funcionais entre transcritos em circuitos sensoriais, orientando estratégias de triagem baseadas em hipóteses. Sua adaptabilidade entre espécies de vertebrados e tecidos não neurais aumenta a continuidade translacional e a reutilização da plataforma em fluxos de trabalho de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da visualização da coexpressão de genes marcadores (por exemplo, parvalbumina e zinco) em neurônios inibitórios ativados pela experiência sensorial.
- Valor Operacional: Permite a desmistificação biológica por meio da observação direta das relações espaciais dos transcritos em tecido congelado fresco, reduzindo a dependência de inferências indiretas.
- Valor Estratégico: Apoia a triagem de portfólios ao fornecer dados com resolução de única célula sobre a expressão gênica neuroquímica e dependente de atividade em circuitos relevantes para doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes, confirmando a especificidade da sonda e a eficiência de hibridização em cortes de cérebro.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio de etapas otimizadas de marcação, purificação e hibridização de sondas, utilizando colunas Sedex G 50 e condições controladas de tampão.
- Valor Estratégico: Destaca a prontidão para triagem e a reutilização da plataforma, demonstrando aplicabilidade em camundongos, ratos, aves cantoras e a expectativa de extensão a outras espécies de vertebrados e tecidos não neurais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância da doença por meio da exploração da organização anatômica e das propriedades neuroquímicas nos circuitos sensoriais centrais, associando a co-regulação gênica a resultados funcionais.
- Valor Operacional: Descreve o valor da continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo a análise longitudinal do impacto da experiência sensorial na expressão gênica no mesmo formato tecidual.
- Valor Estratégico: Enfoca o valor preditivo de redução de riscos ao fornecer insights mecanicistas sobre como estímulos sensoriais alteram programas transcricionais em subtipos neuronais definidos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos, apoiando a verificação de hipóteses e a clarificação de vias em alvos neurobiológicos antes da triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método auxilia no teste de hipóteses ao detectar transcritos co-regulados (por exemplo, zinco dependente da atividade e marcador de neurônios inibitórios, parvalbumina) em resposta à experiência sensorial.
- Triagem: Descreve a preparação do ensaio por meio de etapas reprodutíveis de purificação e hibridização de sondas que geram leituras fluorescentes quantitativas com resolução em nível celular.
- Análises: Destaca medições como intensidade do sinal fluorescente e padrões de co-localização (por exemplo, células coexpressoras marcadas com asterisco) que permitem comparação entre condições em diferentes grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica ao demonstrar sua aplicabilidade em cortes cerebrais congelados frescos de múltiplas espécies, apoiando a validação cruzada de espécies no engajamento do alvo.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável e não como uma técnica de uso único, dada sua adaptabilidade a diversos tecidos neurais e não neurais e ao fluxo de trabalho padronizado de purificação de sondas baseado em colunas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista em estudos de co-regulação gênica.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio da purificação de sondas em coluna e tampões definidos de hibridização e lavagem.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar ou não mais precisas, eficiência de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados ao confirmar padrões de coexpressão de alvos no início da descoberta.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados de transcritos com resolução espacial em circuitos cerebrais relevantes para doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em histologia molecular, marcação de sondas e microscopia de fluorescência.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo criostato, centrífuga, banho de óleo mineral e microscópio fluorescente com conjuntos de filtros apropriados.
- Requisitos de padronização entre equipes para preparação de sondas, condições de hibridização e limiares de detecção de sinal.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, incluindo ajustes para espessura do tecido, permeabilização e tempo de hibridização com base na espécie e abundância do alvo.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem: o tempo de incubação com peróxido de hidrogênio deve ser testado empiricamente antes da DISH, com base na abundância de mRNA, para evitar super ou subdetecção.
