Name: O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a gerar culturas de fatias organotípicas do hipocampo para modelar lesões neuronais em resposta a estímulos neurotóxicos. Este método preserva a arquitetura hipocampal e permite quantificar a morte neuronal nas regiões CA1, CA3 e dentada.

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Financiado pelo NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes

1. Preparação Antes de começar, montar os instrumentos necessários cirúrgica, dissecção e meios de cultura, e sete dias de ratos velhos ou filhotes de rato. O protocolo é o mesmo para mouse e preparações de ratos. (I) Os materiais e equipamentos <ul><li> Tesoura operacional (comprimento em linha reta 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Micro dissecando tesoura, (comprimento 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Aço Carbono Dumont Pinças (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Vidro modificado "transferência" pipetas (parte inferior da pipeta Pasteur removido e suavizada pela borda) </li><li> Aclar filme plástico cortadas a 2 "em x 2" em praças (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA) </li><li> Cobrir esponjas 4 em por 3 in (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA) </li><li> 30 milímetros Millicell insere membrana (0,4 mm; Millipore, Bedford, MA) </li><li> Mcllwain helicóptero Tecido com dois gumes lâmina de barbear (McIlwain helicóptero tecido, empresa Vibratome, St. Louis, MO) </li><li> Microscópio invertido com CCD da câmera e software de análise de imagem </li></ul> (Ii) Média Dissecação (DM; 1 litro em pH 7,3) <table border="0"><tbody><tr><td> Salina balanceada de Hank </td><td> 1 frasco (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4,2 mM) </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 2,83 g </td></tr><tr><td> Glicose (33,3 mM) </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / (100x) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> BSA (0,3%) </td><td> 300 mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td> 1,44 g </td></tr></tbody></table> (Iii) meio de cultura (400 mL) <table border="0"><tbody><tr><td> MEM (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> *** Sal Balanço de Hank (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> Soro de cavalo (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> HEPES buffer (1 M; Invitrogen 15630-080) </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / (100x) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> *** Adicionar 12,8 g de glicose para Salt 500 mL de Hank Balance antes de fazer meio de cultura </td></tr></tbody></table> (Iv) Animais 7 dias de idade ou filhotes de ratos rato pós-parto, geralmente uma ninhada por experimento. 2. No Dia da Cultura <ol><li> Todas as ferramentas de dissecação e Aclar filme deve ser embebido em álcool etílico 70% por 30 minutos antes de começar. A superfície do capô, a dissecção da lâmina, e helicóptero tecido deve ser desinfetado com etanol. </li><li> Prepare vários (3-4) 6 placas de cultura de tecidos bem, adicione um meio de cultura mL por poço, e inserir uma membrana Millipore permeáveis ​​em cada poço. Coloque 6-bem placas no 37 ° incubadora até que esteja pronto para transferir fatias. </li><li> Prepare vários (4-6) 60 mm com placas DM e colocar no gelo. </li><li> Rapidamente decapitar com uma tesoura e mergulhe em 70% o álcool etílico, e rapidamente expor o cérebro com uma incisão sagital do crânio. Remova cuidadosamente o cérebro e coloque imediatamente em DM frio. Separá-lo em dois hemisférios e coloque cada lado medial do hemisfério para baixo em uma esponja de cobertura para 2-3 segundos. </li><li> Levantar delicadamente e coloque o hemisfério para a praça Aclar filme e coloque no helicóptero tecidos; corte coronal do cérebro em 350 seções mM. Quando terminar, retire com cuidado a praça Alcar com o hemisfério seccionados e submergir em DM frio. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, separar as seções do hipocampo. Para ratos, deve haver cinco seções que abrangem rostral hipocampo caudal, e para mouse deve haver seções 3-4. </li><li> Tirar as placas de 6 poços com inserções de membrana do 37 ° de cultura de tecidos incubadora. Transferência de fatias do hipocampo individualmente para a membranas permeáveis ​​usando a pipeta de transferência de vidro. Se demasiado DM é liberado para a membrana, remover o excesso de DM com uma pipeta Pasteur. Coloque cinco fatias do hipocampo em cada membrana. Permitir que pelo menos três poços por condição, ou 15 fatias. </li><li> Incubar as placas de cultura a 37 ° em 5% CO incubadora umidificada por 12-14 dias antes do início do experimento de toxicidade. O meio de cultura podem ser mudadas duas vezes por semana. </li></ol> 3. Induzir e quantificação lesão neuronal do hipocampo em Cultura Slice <ol><li> Depois de 12-14 dias em cultura, adicionar 5 mg / mL de iodeto de propídio (PI) para o meio de cultura. Esta etapa irá permitir a visualização e quantificação de morte celular basal. </li><li> No dia seguinte, quantificar PIfluorescência na sub-região CA1 (e / ou CA3 ou denteado se desejado) de cada fatia do hipocampo e obter média das medições de fluorescência PI representando a morte de células basais (referido como tempo = 0 horas, ou T 0). Para aquisição de imagem e quantificação, usamos OpenLab software (Improvisação, UK), mas a aquisição de imagens e outros softwares de análise podem ser usados ​​para quantificar a intensidade de fluorescência. </li><li> Imediatamente após a aquisição da imagem de T 0 PI fluorescência, induzir lesão neuronal pelo seu método de escolha (temos usado 10 mM NMDA, oxigênio glucose-privação, ou LPS para uma hora como indutores de toxicidade neuronal 2,5). Após o estímulo tóxicos, substituir média com meio fresco contendo 5 mg / mL PI e manter fatias durante a noite. </li><li> No dia 3, significa quantificar PI fluorescência da condição experimental em 24h, ou T 24. </li><li> Após esta aquisição de imagem, mudar imediatamente médio e adicionar 10 mM NMDA e 5 mg / mL PI e fatias de incubar durante a noite para atingir a morte neuronal máxima. </li><li> No dia 4, significa quantificar PI fluorescência da morte neuronal máxima, definida como T max. Calcular a morte celular por cento da seguinte forma: (T 24 - T 0) / (T max-T 0). </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) da linha de tempo para a geração de hipocampo e subsequente lesão experimental e de aquisição de imagem. (B) Imagens representativas de fatias do hipocampo basally (T 0), 24 horas após uma exposição de uma hora a 10 mM NMDA (T 24), e após mais 24 horas ou 10 mM NMDA para obter lesão neuronal máxima (T max).

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existem dois pontos importantes a seguir para garantir resultados reprodutíveis e consistentes ao replicar as experiências. Primeiro, é importante deixar que a idade fatias do hipocampo por 12-14 dias antes da experimentação. Com isolamento fatia, há uma resposta significativa da microglia e microglia permanecerá ativado por algum tempo, com um retorno a um estado de repouso ramificada ocorrem de dia 10 in vitro 3,6. Em segundo lugar, com média de PI intensidade de fluorescência é proporcional ao núm...

o modelo de cultura organotípicas hippocampal slice para o exame das lesões neuronais

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Cultura fatia organotípicas hipocampo é um método in vitro para analisar os mecanismos de lesão neuronal em que a arquitetura básica e composição do hipocampo é relativamente preservado 1. O sistema de cultura organotípicas permite o exame dos efeitos neuronal, astrocíticos e microglia, mas como uma preparação ex vivo, não aborda os efeitos do fluxo de sangue, ou recrutamento de células inflamatórias periféricas. Para o efeito, este método de cultura é freqüentemente utilizado para examinar lesão hipóxico excitotoxic e aos neurônios piramidais do hipocampo, mas também tem sido usado para examinar a resposta inflamatória. Aqui nós descrevemos os métodos para a geração de culturas fatia do hipocampo do cérebro do roedor pós-parto, administrar estímulos tóxicos para induzir a lesão neuronal, e assaying e quantificar a morte neuronal no hipocampo.

O modelo de cultura organoptypic hipocampo é uma fatia<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo usado para examinar lesão neuronal em uma variedade de paradigmas. Neste artigo, vamos descrever os métodos de geração de culturas fatia e quantificar lesão neuronal.

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

A cultura de fatias hipocampais organotípicas é um método in vitro para examinar mecanismos de lesão neuronal no qual a arquitetura e a composição básicas de...

O objetivo geral deste procedimento é gerar culturas organotípicas de fatias do hipocampo que possam ser utilizadas para modelar lesões neuronais em resposta a uma variedade de estímulos, incluindo NMDA, excitotoxicidade, privação de oxigênio e glicose ou estímulos inflamatórios, como lipopolissacarídeo ou peptídeo beta amiloide. Isso é realizado primeiramente isolando o cérebro pós-natal e seccionando cada hemisfério para gerar fatias coronais. O segundo passo do procedimento consiste em isolar as regiões do hipocampo e cultivá-las em inserts de membrana em placas de seis poços. Após o cultivo das seções, as mesmas são coradas com iodeto de propídio e o nível de morte neuronal espontânea é calculado.Por fim, os cortes são tratados com um agente neurotóxico e restainados para medir a resposta de toxicidade ao tratamento. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a porcentagem de morte neuronal nas regiões CA1, CA3 e giro denteado do hipocampo sob diferentes condições experimentais, por meio da quantificação da fluorescência do iodeto de propídio utilizando microscopia de imunofluorescência. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como

the-organotypic-hippocampal-slice-culture-model-for-examining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um método para preparar organotípicas fatias do hipocampo que pode ser facilmente adaptado a outras regiões do cérebro. Fatias de cérebro são colocadas em membranas porosas e meios de cultura está autorizado a formar uma interface. Este método preserva a arquitetura bruta do hipocampo para até duas semanas em cultura.

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

Este vídeo demonstra um método para preparar culturas organotípicas de fatias de hipocampo a partir do cérebro de um filhote de rato. Ele descreve as etapas envolvidas na dissecação do hipocampo, fatiamento e condições de cultura necessárias para promover a viabilidade celular e o crescimento nas fatias do hipocampo, gerando culturas de fatias organotípicas.

Preparação de culturas organotípicas de fatias do hipocampo de um filhote de rato

A co-cultura de fatia cerebral organotípicas com células de carcinoma permite visualizar as alterações morfológicas por fluorescência, bem como o campo brilhante (vídeo) microscopia durante o processo de invasão de células de carcinoma de tecido cerebral. Este modelo de sistema também permite abordagens taxas de célula e de reabastecimento e oferece uma ampla variedade de manipulações e análises.

Sistema de co-cultura com uma fatia organotípicas Cérebro e esferóide 3D de carcinomas de células

Nós desenvolvemos um modelo de fatia de cérebro que podem ser utilizados para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na lesão cerebral mediada por excitotoxicidade. Esta técnica gera tecido cerebral maduro viável e reduz o número de animais necessários para a experimentação, mantendo o circuito neuronal, interações celulares e compartimentos pós-sinápticos em parte intacta.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Uma técnica para estudar células NG2 e oligodendrócitos usando um sistema de cultura de fatias do prosencéfalo e cerebelo é descrita.  Este método permite o exame da dinâmica de proliferação e diferenciação de células dentro da linhagem de oligodendrócitos, onde o ambiente extracelular pode ser facilmente manipulado, mantendo a citoarquitetura do tecido.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

Um protocolo para culturas fatia organotípica entorhino-hipocampal, que permite a reprodução de muitos aspectos da lesão cerebral isquêmica, é apresentado. Ao estudar as mudanças do neurovasculature além de alterações nos neurônios, este protocolo é uma ferramenta versátil para estudar mudanças plásticas no tecido neural após lesão.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método permite a manipulação in vitro da neurogénese adulto e permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o hipocampo cultivadas.

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

Culturas de fatias hippocampal organotypic (OHSC) representam um modelo in vitro que simula a situação na vivo muito bem. Aqui descrevemos uma vibratome de base melhorada fatiar protocolo para obter fatias de alta qualidade para uso em avaliar o potencial neuroprotetor do romance substâncias ou o comportamento biológico das células tumorais.

Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

Um protocolo para preparar culturas de fatias flutuantes do cérebro humano adulto é apresentado. O protocolo é uma variação do método de cultura de fatia amplamente utilizado usando inserções de membrana. É simples, rentável, e recomendado para a execução de ensaios de curto prazo destinadas a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade.

Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

Aqui, descrevemos a preparação de fatias organotipicas do córtex-hipocampo rhinal. Sob uma privação gradual e controlada de soro, essas fatias retratam eventos epilépticos em evolução e podem ser consideradas um modelo ex vivo de episetogênese. Este sistema representa uma excelente ferramenta para monitorar a dinâmica da atividade espontânea, bem como para avaliar a progressão das características neuroinflamatórias ao longo do curso da epipesogênese.

Um Modelo de Epipetogênese em Culturas de Fatia Organotipica Do Cortex-Hipocampo Rhinal

Este artigo tem como objetivo descrever um protocolo sistemático para obter fatias cerebrais hipocampais horizontais em camundongos. O objetivo desta metodologia é preservar a integridade das vias de fibra hipocampal, como o caminho perfurante e o trato de fibra de musgo para avaliar processos neurológicos relacionados ao giro dento.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

Aprenda a gerar culturas de fatias organotípicas do hipocampo para modelar lesões neuronais em resposta a estímulos neurotóxicos. Este método preserva a arquitetura hipocampal e permite quantificar a morte neuronal nas regiões CA1, CA3 e dentada.

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

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