Name: O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a gerar culturas de fatias organotípicas do hipocampo para modelar lesões neuronais em resposta a estímulos neurotóxicos. Este método preserva a arquitetura hipocampal e permite quantificar a morte neuronal nas regiões CA1, CA3 e dentada.

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Financiado pelo NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes

1. Preparação Antes de começar, montar os instrumentos necessários cirúrgica, dissecção e meios de cultura, e sete dias de ratos velhos ou filhotes de rato. O protocolo é o mesmo para mouse e preparações de ratos. (I) Os materiais e equipamentos <ul><li> Tesoura operacional (comprimento em linha reta 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Micro dissecando tesoura, (comprimento 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Aço Carbono Dumont Pinças (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Vidro modificado "transferência" pipetas (parte inferior da pipeta Pasteur removido e suavizada pela borda) </li><li> Aclar filme plástico cortadas a 2 "em x 2" em praças (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA) </li><li> Cobrir esponjas 4 em por 3 in (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA) </li><li> 30 milímetros Millicell insere membrana (0,4 mm; Millipore, Bedford, MA) </li><li> Mcllwain helicóptero Tecido com dois gumes lâmina de barbear (McIlwain helicóptero tecido, empresa Vibratome, St. Louis, MO) </li><li> Microscópio invertido com CCD da câmera e software de análise de imagem </li></ul> (Ii) Média Dissecação (DM; 1 litro em pH 7,3) <table border="0"><tbody><tr><td> Salina balanceada de Hank </td><td> 1 frasco (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4,2 mM) </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 2,83 g </td></tr><tr><td> Glicose (33,3 mM) </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / (100x) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> BSA (0,3%) </td><td> 300 mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td> 1,44 g </td></tr></tbody></table> (Iii) meio de cultura (400 mL) <table border="0"><tbody><tr><td> MEM (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> *** Sal Balanço de Hank (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> Soro de cavalo (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> HEPES buffer (1 M; Invitrogen 15630-080) </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / (100x) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> *** Adicionar 12,8 g de glicose para Salt 500 mL de Hank Balance antes de fazer meio de cultura </td></tr></tbody></table> (Iv) Animais 7 dias de idade ou filhotes de ratos rato pós-parto, geralmente uma ninhada por experimento. 2. No Dia da Cultura <ol><li> Todas as ferramentas de dissecação e Aclar filme deve ser embebido em álcool etílico 70% por 30 minutos antes de começar. A superfície do capô, a dissecção da lâmina, e helicóptero tecido deve ser desinfetado com etanol. </li><li> Prepare vários (3-4) 6 placas de cultura de tecidos bem, adicione um meio de cultura mL por poço, e inserir uma membrana Millipore permeáveis ​​em cada poço. Coloque 6-bem placas no 37 ° incubadora até que esteja pronto para transferir fatias. </li><li> Prepare vários (4-6) 60 mm com placas DM e colocar no gelo. </li><li> Rapidamente decapitar com uma tesoura e mergulhe em 70% o álcool etílico, e rapidamente expor o cérebro com uma incisão sagital do crânio. Remova cuidadosamente o cérebro e coloque imediatamente em DM frio. Separá-lo em dois hemisférios e coloque cada lado medial do hemisfério para baixo em uma esponja de cobertura para 2-3 segundos. </li><li> Levantar delicadamente e coloque o hemisfério para a praça Aclar filme e coloque no helicóptero tecidos; corte coronal do cérebro em 350 seções mM. Quando terminar, retire com cuidado a praça Alcar com o hemisfério seccionados e submergir em DM frio. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, separar as seções do hipocampo. Para ratos, deve haver cinco seções que abrangem rostral hipocampo caudal, e para mouse deve haver seções 3-4. </li><li> Tirar as placas de 6 poços com inserções de membrana do 37 ° de cultura de tecidos incubadora. Transferência de fatias do hipocampo individualmente para a membranas permeáveis ​​usando a pipeta de transferência de vidro. Se demasiado DM é liberado para a membrana, remover o excesso de DM com uma pipeta Pasteur. Coloque cinco fatias do hipocampo em cada membrana. Permitir que pelo menos três poços por condição, ou 15 fatias. </li><li> Incubar as placas de cultura a 37 ° em 5% CO incubadora umidificada por 12-14 dias antes do início do experimento de toxicidade. O meio de cultura podem ser mudadas duas vezes por semana. </li></ol> 3. Induzir e quantificação lesão neuronal do hipocampo em Cultura Slice <ol><li> Depois de 12-14 dias em cultura, adicionar 5 mg / mL de iodeto de propídio (PI) para o meio de cultura. Esta etapa irá permitir a visualização e quantificação de morte celular basal. </li><li> No dia seguinte, quantificar PIfluorescência na sub-região CA1 (e / ou CA3 ou denteado se desejado) de cada fatia do hipocampo e obter média das medições de fluorescência PI representando a morte de células basais (referido como tempo = 0 horas, ou T 0). Para aquisição de imagem e quantificação, usamos OpenLab software (Improvisação, UK), mas a aquisição de imagens e outros softwares de análise podem ser usados ​​para quantificar a intensidade de fluorescência. </li><li> Imediatamente após a aquisição da imagem de T 0 PI fluorescência, induzir lesão neuronal pelo seu método de escolha (temos usado 10 mM NMDA, oxigênio glucose-privação, ou LPS para uma hora como indutores de toxicidade neuronal 2,5). Após o estímulo tóxicos, substituir média com meio fresco contendo 5 mg / mL PI e manter fatias durante a noite. </li><li> No dia 3, significa quantificar PI fluorescência da condição experimental em 24h, ou T 24. </li><li> Após esta aquisição de imagem, mudar imediatamente médio e adicionar 10 mM NMDA e 5 mg / mL PI e fatias de incubar durante a noite para atingir a morte neuronal máxima. </li><li> No dia 4, significa quantificar PI fluorescência da morte neuronal máxima, definida como T max. Calcular a morte celular por cento da seguinte forma: (T 24 - T 0) / (T max-T 0). </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) da linha de tempo para a geração de hipocampo e subsequente lesão experimental e de aquisição de imagem. (B) Imagens representativas de fatias do hipocampo basally (T 0), 24 horas após uma exposição de uma hora a 10 mM NMDA (T 24), e após mais 24 horas ou 10 mM NMDA para obter lesão neuronal máxima (T max).

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existem dois pontos importantes a seguir para garantir resultados reprodutíveis e consistentes ao replicar as experiências. Primeiro, é importante deixar que a idade fatias do hipocampo por 12-14 dias antes da experimentação. Com isolamento fatia, há uma resposta significativa da microglia e microglia permanecerá ativado por algum tempo, com um retorno a um estado de repouso ramificada ocorrem de dia 10 in vitro 3,6. Em segundo lugar, com média de PI intensidade de fluorescência é proporcional ao núm...

o modelo de cultura organotípicas hippocampal slice para o exame das lesões neuronais

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Cultura fatia organotípicas hipocampo é um método in vitro para analisar os mecanismos de lesão neuronal em que a arquitetura básica e composição do hipocampo é relativamente preservado 1. O sistema de cultura organotípicas permite o exame dos efeitos neuronal, astrocíticos e microglia, mas como uma preparação ex vivo, não aborda os efeitos do fluxo de sangue, ou recrutamento de células inflamatórias periféricas. Para o efeito, este método de cultura é freqüentemente utilizado para examinar lesão hipóxico excitotoxic e aos neurônios piramidais do hipocampo, mas também tem sido usado para examinar a resposta inflamatória. Aqui nós descrevemos os métodos para a geração de culturas fatia do hipocampo do cérebro do roedor pós-parto, administrar estímulos tóxicos para induzir a lesão neuronal, e assaying e quantificar a morte neuronal no hipocampo.

O modelo de cultura organoptypic hipocampo é uma fatia<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo usado para examinar lesão neuronal em uma variedade de paradigmas. Neste artigo, vamos descrever os métodos de geração de culturas fatia e quantificar lesão neuronal.

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

A cultura de fatias hipocampais organotípicas é um método in vitro para examinar mecanismos de lesão neuronal no qual a arquitetura e a composição básicas de...

O objetivo geral deste procedimento é gerar culturas organotípicas de fatias do hipocampo que possam ser utilizadas para modelar lesões neuronais em resposta a uma variedade de estímulos, incluindo NMDA, excitotoxicidade, privação de oxigênio e glicose ou estímulos inflamatórios, como lipopolissacarídeo ou peptídeo beta amiloide. Isso é realizado primeiramente isolando o cérebro pós-natal e seccionando cada hemisfério para gerar fatias coronais. O segundo passo do procedimento consiste em isolar as regiões do hipocampo e cultivá-las em inserts de membrana em placas de seis poços. Após o cultivo das seções, as mesmas são coradas com iodeto de propídio e o nível de morte neuronal espontânea é calculado.Por fim, os cortes são tratados com um agente neurotóxico e restainados para medir a resposta de toxicidade ao tratamento. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a porcentagem de morte neuronal nas regiões CA1, CA3 e giro denteado do hipocampo sob diferentes condições experimentais, por meio da quantificação da fluorescência do iodeto de propídio utilizando microscopia de imunofluorescência. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a cultura primária de neurônios, é que o mecanismo de lesão neuronal é examinado em uma preparação na qual a arquitetura básica do hipocampo permanece relativamente intacta.E o terceiro tipo inclui exercício. As microglías e ROY são preservadas antes de iniciar a dissecação. Insira uma membrana permeável Millipore em cada uma.Adicione um mililitro de meio de cultura a cada poço de várias placas de cultura tecidual de seis poços. Incube as placas em uma incubadora a 37 graus Celsius.Mergulhe brevemente a cabeça decapitada de uma pupa de rato de sete dias em etanol 70%. Para desinfetar, utilize tesoura de dissecação microcirúrgica para fazer uma incisão sagital através do crânio e expor o cérebro. Use pinça para remover rapidamente o cérebro e transfira-o para uma placa de 60 milímetros contendo meio de dissecação sobre gelo.Use pin&ccedil;as para separar o c&eacute;rebro em dois hemisf&eacute;rios. Coloque cada hemisf&eacute;rio com o lado medial voltado para baixo sobre uma esponja de cobertura seca por dois a tr&ecirc;s segundos para coletar qualquer umidade em excesso. Transfira o c&eacute;rebro para um quadrado de filme clar e coloque-o na plataforma de um cortador de tecidos, realizando cortes coronais em sec&ccedil;&otilde;es de 350 m&iacute;con come&ccedil;ando no rostral.E continue suavemente. Levante cuidadosamente o quadrado de A clar e mergulhe as fatias em um novo recipiente com meio de dissecação gelado. Sob um microscópio estereoscópico, identifique o hipocampo, uma estrutura com formato de C invertido localizada abaixo do córtex cerebral, adjacente ao estriado.Use uma pinça para separar o hipocampo de cada seção coronal. Use uma pipeta de Pasteur modificada conforme descrito no texto para transferir cinco fatias hipocampais para cada membrana. Insira nas placas de seis poços previamente aquecidas e preparadas.Remova qualquer meio em excesso da superfície da membrana. Incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 12 a 14 dias. Após 12 a 14 dias de cultivo, troque o meio conforme detalhado no texto acompanhante e adicione cinco microgramas por mililitro por pum de iodeto, abreviado como pi, para permitir a visualização e quantificação da morte celular basal.Incube as fatias durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono sob um microscópio de fluorescência invertido conectado a uma câmera CCD. Capture imagens da fatia com aumento de 40x neste momento. Registre a fluorescência de PI correspondente aos níveis basais de morte celular no tempo igual a zero hora ou T zero, imediatamente após a aquisição de imagens. As fatias induzem lesão neuronal com o método preferido para o experimento atual.Aqui, as fatias são incubadas com meio fresco contendo 10 micromolares de NMDA por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após o tratamento neurotóxico, substitua o meio por meio de cultura fresco contendo cinco microgramas por mililitro de pi.Incube as fatias durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono imagem da fluorescência de PI após tratamento neurotóxico. As medições médias de fluorescência para este ponto temporal representam os níveis de morte celular. Após 24 horas de lesão experimental, ou T 24 horas, substitua imediatamente o meio por meio de cultura fresco contendo 10 micromolar de NMDA e cinco microgramas por mililitro.Incubar as fatias com PI durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para atingir a morte neuronal máxima. Adquirir o conjunto final de imagens da fluorescência de PI, as medidas médias de fluorescência para este ponto temporal. Representar os níveis máximos de morte celular ou Tmax.Quantifique a fluorescência de PI na região de interesse utilizando um software de análise de imagem conforme descrito no texto acompanhante. Esta é uma imagem representativa da coloração por PI de morte neuronal basal na região CA1 do hipocampo. Aqui está uma imagem representativa da morte neuronal corada com PI.24 horas após um tratamento de uma hora com NMDA 10 micromolar, observe a coloração mais intensa, indicando um grau maior de morte celular. Esta imagem mostra a coloração máxima de PI após uma incubação noturna com NMDA 10 micromolar. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar cortes orgânicos de hipocampo e como mensurar o grau de lesão neuronal.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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