Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

Géis de matriz produzidos a partir de tecidos pericárdicos e miocárdicos descelularizados retêm componentes nativos da matriz extracelular, incluindo diversas proteínas, peptídeos e glicosaminoglicanos. Essas matrizes teciduais podem ser utilizadas na engenharia de tecidos. Neste vídeo, géis de matriz são fabricados mediante a descelularização de tecido pericárdico para obter matriz extracelular acelular.

A matriz extracelular é então processada para criar uma versão líquida solubilizada. Em seguida, a matriz solubilizada é testada em um modelo animal pequeno para determinar sua viabilidade como um suporte injetável. A análise histológica e imunohistoquímica demonstra que, in vivo, o material injetado forma um suporte fibroso poroso que permite a infiltração de células vasculares.

Olá, meu nome é Sonia Zeki. Sou aluna de pós-graduação no laboratório da Dra. Karen Chrisman na Universidade da Califórnia em San Diego. Hoje vamos fabricar ECM solubilizada a partir de tecido descelularizado e demonstrar testes in vivo para aplicações em engenharia de tecidos cardíacos.

Essas técnicas são importantes para o desenvolvimento de uma terapia com biomaterial injetável para o tratamento da insuficiência cardíaca. Pós-infarto do miocárdio demonstrando o procedimento cirúrgico ser Pam, shoot McGuffin, um neurocirurgião veterinário em nosso laboratório. Então, vamos começar.

Inicie este protocolo descelularizando o tecido para deixar apenas a matriz extracelular ou ECM; coloque inicialmente o pericárdio suíno em um béquer com água desionizada e lave-o agitando durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após a lavagem, coloque o tecido em PBS 1× contendo 1% de SDS e 1% de penicilina-estreptomicina, agitando continuamente por 24 horas à temperatura ambiente. No dia seguinte, retorne o tecido para água desionizada e agite continuamente por cinco horas, agitando em um tubo de 50 mililitros até que todas as bolhas desapareçam.

A coloração com hematina e eosina deve revelar a ausência de núcleos no tecido descelularizado. Coloque o restante do tecido descelularizado em um tubo cônico de 15 a 50 mililitros. Em seguida, coloque o tecido no congelador a menos 80 graus Celsius.

Liofilize as amostras congeladas por liofilização sob pressão muito baixa e temperatura muito baixa até ficarem completamente secas. Dependendo do sistema utilizado e do teor de água das amostras, isso pode levar de 12 a 72 horas. Uma vez que o tecido descelularizado estiver completamente seco, transfira-o para um moinho Wiley Minim.

Com o auxílio de uma peneira de malha 40, triture o tecido até obter um pó fino. Assim que a maior parte da amostra tiver passado pelo filtro, remova o frasco de coleta. Esta amostra passa a ser denominada matriz extracelular ou pó de MEC.

Um segundo passo de liofilização pode ser realizado neste momento, caso não se prossiga imediatamente para a próxima etapa. Isso garante a precisão do peso registrado para solubilizar a MEC. Pese a quantidade desejada de pó de MEC em um frasco estéril.

Adicione solução estéril filtrada de cloreto de hidrogênio contendo um miligrama por mililitro. Pepcid ao frasco de cintilação com o pó de ECM de modo que o ECM fique numa concentração de 10 miligramas por mililitro. Adicione uma barra de agitação e coloque o frasco na placa de agitação.

Agite continuamente por 48 a 60 horas, raspando periodicamente as laterais do frasco com uma colher ou espátula estéril WHE, para garantir a digestão de todo o pó de MEC. Conforme o MEC for digerido, ele entrará em solução.

Uma vez que a MEC tenha sido solubilizada, coloque a amostra em gelo e ajuste o pH para 7,4 utilizando hidróxido de sódio e ácido clorídrico. Após o ajuste do pH, adicione PBS 10 vezes para que a concentração final da solução seja PBS 1 vez. Por exemplo, se você tiver 900 microlitros de solução de MEC, após os ajustes de pH, devem ser adicionados 100 microlitros de PBS 10 vezes.

Determine a concentração da solução de MEC solubilizada somando os volumes adicionados para neutralizar e os volumes removidos para testar o pH. Em seguida, adicione PBS em quantidade equivalente para atingir a concentração final desejada aqui. Seis miligramas por mililitro.

No dia da cirurgia, prepare uma injeção de 75 microlitros de MEC solubilizada em uma seringa de 0,1 mililitro com agulha de 30 graus. Mantenha a anestesia de uma rata Harlan dolly intubada com 2,5% de óxido de flúor. Aplique protetor ocular, depois verifique a anestesia realizando uma compressão do dedo do pé.

Administre três mililitros de solução de Ringer com lactato por injeção subcutânea na região abdominal inferior para hidratação. Em seguida, posicione o animal em posição supina sobre a mesa cirúrgica e prenda suavemente as patas com fita adesiva. Use uma tesoura elétrica para remover os pelos do abdômen e aspire os pelos soltos.

Realize uma série de injeções de 50 microlitros de lidocaína a 2% ao longo de uma diagonal que vai do processo xifoide até o lado inferior direito do abdômen. Em seguida, esfregue três vezes com Betadine, começando no centro e movendo-se para fora. Repita a esfregação com álcool isopropílico.

Em seguida, cubra o animal usando um campo cirúrgico com uma janela circular pré-fabricada. Fixe com um campo cirúrgico. Usando um bisturi número 10.

Faça uma incisão de três a quatro centímetros a partir do processo xifoide até o lado inferior direito do abdômen. Localize o processo xifoide e dissecção verticalmente para baixo através do músculo em direção à direita, tomando cuidado para evitar o vaso grande localizado à direita. Em seguida, use uma tesoura para cortar lateralmente através do músculo, expondo o diafragma.

Tenha cuidado para evitar o fígado usando um fio de sutura Vicryl 3-0 com 36 polegadas de comprimento e um par de hemostatos. Passe uma agulha através do processo xifoide e puxe o fio de sutura pela metade. Una as pontas do fio com fita adesiva e fixe-as em um ponto acima e atrás do animal, elevando o processo xifoide e expondo o diafragma com outro fio de sutura Vicryl 3-0 de 36 polegadas de comprimento.

Insira uma agulha através do músculo mais próximo do processo xifoide e, novamente, puxe e fixe a extremidade em outro ponto à direita da mesa cirúrgica, expondo completamente a cavidade cirúrgica. Em seguida, utilizando um pequeno par de pinças microcirúrgicas dentadas, segure o centro do diafragma, puxe-o para fora e faça uma incisão muito pequena com uma tesoura romba. Uma vez feito esse orifício, os pulmões irão retrair.

Realize uma incisão vertical de dois a três centímetros através do diafragma para visualizar o coração. Em seguida, insira um cotonete de sete centímetros à esquerda da cavidade e afaste os pulmões. Fixe o cotonete no lugar utilizando um prendedor de toalha.

Usando outro swab, mova o pulmão direito para o lado a fim de localizar a bolsa pericárdica. Em seguida, com um par de pinças microcirúrgicas e um par de pinças grandes serrilhadas, rasgue a bolsa pericárdica, expondo o ápice do coração. Segure o ápice do coração com a pinça microcirúrgica dentada da direita e insira a agulha para injetar a matriz solubilizada com a borda biselada voltada para a esquerda.

A um terço do caminho a partir do ápice, paralelo à superfície epicárdica. Certifique-se de evitar a veia cardíaca magna. Injete o gel de matriz solubilizado e aguarde alguns segundos antes de remover a agulha.

O tecido deve embranquecer no local da injeção; limpe o sangue na cavidade e remova o grampo de toalha e a gaze que seguram o pulmão direito usando hemostatos microcurvos, fazendo um nó inicial com um comprimento de 30 polegadas de sutura de prolina cinco zero. Em seguida, use pinças microcirúrgicas dentadas para fechar o diafragma com uma sutura contínua e uma agulha cônica antes de fechar completamente. Insira um tubo de sucção PE 160 e feche ao redor usando uma seringa de 10 mililitros para esvaziar a cavidade torácica.

À medida que o ponto é apertado, o diafragma deve ficar côncavo. Reduza o fluxo de flúor para 1%. Remova ambos os pontos de Vicryl 3-0 que mantêm a cavidade aberta. Hidrate o músculo, removendo o excesso com um cotonete ou gaze estéril.

Use um novo segmento de fio 3-0 para fechar a camada muscular com pontos intermitentes. Em seguida, desligue o isoflurano. Limpe a área e use grampos para fechar a pele.

Em seguida, aplique uma pomada antibiótica tríplice no local da incisão. Deixe o rato se recuperar sob oxigênio a 100%. Quando o animal começar a respirar ao redor do ventilador, remova o tubo traqueal.

Uma vez que o animal esteja novamente de pé, administre uma injeção subcutânea de 0,05 miligramas por quilograma de analgésico cloridrato de buprenorfina e devolva-o à gaiola de origem sobre uma toalha estéril. O tecido cardíaco de ratos injetados com géis de matriz solúvel foi seccionado e corado com hematoxilina, eosina e eoin para análise macroscópica do tecido em diferentes pontos temporais. Após a cirurgia, em pontos temporais iniciais, a região injetada aparece como uma rede fibrosa cor-de-rosa que se espalha intersticialmente em pontos temporais posteriores.

Observa-se influxo celular após duas semanas. É possível observar a degradação da matriz injetada. Se a matriz extracelular foi marcada com biotina antes da injeção, pode ser visualizada de forma mais direta por meio da coloração da biotina com estreptavidina conjugada à HRP, para visualizar o crescimento e a formação de vasos na região de injeção da matriz.

As lâminas aqui foram contracoradas com um fitzil. A selectina conjugada, que se liga a células endoteliais mostradas em verde, e um anticorpo antimusculatura lisa contra actina mostrado em vermelho. Células-tronco também podem ser identificadas próximas à região de injeção.

Aqui eles foram visualizados com uma coloração de imuno-histoquímica para C kit. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar matriz extracelular solubilizada a partir de tecido descelularizado e testá-la in vivo para aplicações em engenharia de tecidos cardíacos. Não se esqueça de que, embora utilizemos tecido pericárdico, este procedimento geral pode ser modificado para ser usado com qualquer fonte de tecido.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.