Name: Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprenda a fabricar géis de matriz injetáveis a partir de tecido pericárdio descelularizado para engenharia de tecido cardíaco em modelo animal. Este método demonstra a formação de arcabouço fibroso poroso com infiltração vascular in vivo.

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Esta pesquisa foi financiada em parte pelo Programa Novo Diretor do NIH Innovator Award, que faz parte do Roteiro NIH para Pesquisa Médica, através de concessão de número 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. gostaria de agradecer a NSF para uma Bolsa de Investigação Pós-Graduação.

1. Pré-processamento de preparação dos tecidos <ol class="lalpha"><li> Antes de utilizar este protocolo, é preciso ter já decelularizado o tecido de escolha. Para este exemplo, suína fresca e as amostras de pericárdio humanos são decelularizado usando lavagens hipotônica e hipertônica em água deionizada (DI) e dodecil sulfato de sódio (SDS). </li><li> Especificamente, primeiro lave o pericárdio suíno em água DI por 30 minutos, em seguida, agitar continuamente em SDS 1% em tampão fosfato salino (PBS) por 24 horas, seguido de água a 5 horas DI enxaguar. Para pericárdio humano, primeiro lave em água DI por 30 minutos, em seguida, agitar continuamente em SDS 1% em PBS durante 60-65 horas, seguido de uma noite DI enxaguar. Remova todas as amostras de sua solução final e enxaguar novamente sob execução DI água 1. </li><li> Para verificar decelularização, remover um pequeno pedaço fresco, congelá-lo em outubro médio de congelamento, e demorar 10 secções de tecido mM cada 100 mm em toda a amostra para exame através de análise histológica, conforme relatado anteriormente 34-36. </li><li> Use hematoxilina e eosina (H &amp; E) as manchas de examinar o tecido para a ausência de núcleos. Pode-se também usar um Hoescht fluorescentes 33342 mancha (1,0 mcg / mL) para DNA para verificar a H &amp; resultados E; brevemente, corrigir as seções, hidratar e enxaguar em água, mancha por 10 minutos e depois enxágüe bem e armazenar no escuro. Alternativamente, pode-se usar um kit como o sangue Dneasy Qiagen e kit de tecidos, que é projetado para quantificar o conteúdo de DNA total de uma amostra. </li></ol> 2. Preparação de ECM injetável <ol class="lalpha"><li> Liofilização <ol class="lroman"><li> Após preparação adequada, congelar as amostras decelularizado com nitrogênio líquido ou por meio do armazenamento a -80 ° C. Lyophilize as amostras até que esteja completamente seco. Dependendo do seu sistema e do conteúdo de água das suas amostras, isso pode demorar de 12 a 72 horas. </li></ol></li><li> Moagem <ol class="lroman"><li> Uma vez completamente seca, um moinho Wiley Mini é usado para moer o ECM seco em um pó fino. Escolha o tamanho da peneira adequada para seus propósitos, aqui, a malha calibre 40 é usado. Uma vez que a maioria da amostra veio através do filtro, remova a jarra de coleta com o pó ECM moído. Se houver apenas uma pequena amostra, o resto da amostra pode ser extraído da fábrica em uma variedade de maneiras, aqui, um Q-ponta é usada para remover a ECM preso atrás das lâminas estacionárias do moinho. </li><li> Certifique-se sempre que a usina está limpo e livre de detritos. Também é importante certificar-se que tanto a usina e sua amostra são totalmente seca; toda a umidade fará com que o ECM para agregar e se aglutinarem, evitando moagem de sucesso. A ECM pode pegar a umidade do ar e assim deve ir diretamente do liofilizador à fábrica. </li></ol></li><li> Digestão <ol class="lroman"><li> Para formar a ECM injetável, o pó é digerido pepsina. O seguinte protocolo foi modificado a partir Freyetes, et al. (2). </li><li> É importante manter como um produto estéril possível, já que serão injetados in vivo e contaminação podem causar complicações. Assim, use frascos estéreis e pesar colheres e filtrar todas as soluções antes de usar. Um passo após moagem e liofilização, antes da digestão também irá ajudar a manter a esterilidade. </li><li> Pesar a quantidade desejada de pó ECM em um frasco de cintilação apropriado. Para volumes totais menores que 1 mL, recomenda-se utilizar um frasco de 2 ml e para volumes maiores, um frasco de 20 mL. Isso garante que há bastante líquido no fundo do frasco para misturar de forma eficaz. </li><li> Pesar a quantidade desejada de pepsina em um frasco de cintilação. Adicionar 0,1 M HCl de modo que a pepsina é a uma concentração de 1 mg / mL. Certifique-se que a pepsina é totalmente dissolvido (sem partículas) antes de usar este pode ser acelerada por vórtex a solução de pepsina. </li><li> Adicione a solução de pepsina / HCl para o frasco de cintilação com o pó ECM para que o MEC está em uma concentração de 10 mg / mL. </li><li> Mexa solução continuamente por 60-65 horas, periodicamente, raspando as laterais do frasco com uma colher ou espátula pesar. </li></ol></li><li> Ajuste de pH <ol class="lroman"><li> Esta etapa é realizada para trazer o material da matriz líquido para pH fisiológico e para inativar a pepsina, mantendo-o de clivagem da ECM mais. Novamente, certifique-se de usar as soluções feitas com água filtrada Millipore. </li><li> 1 M NaOH é adicionado a 1 / 10 do volume original. Teste o pH neste ponto e adicione pequenas quantidades (2-10 L) de NaOH ou HCl tal que o pH desejado (7,4) é atingido. Mantenha o controle de todas as pequenas quantidades adicionadas para a neutralização ou removidas para testes de pH. Uma vez que a solução foi neutralizada, adicione PBS 10x de ser 1 / 10 do volume final (09/01 o volume atual). Determinar a concentração do ECM injetáveis ​​e em seguida, adicione 1x PBS para alcançar desejado co finaisncentration, aqui 6 mg / mL. </li><li> Caracterização da ECM injetável pode ser feito via SDS-PAGE, Ensaio GAG Blyscan colorimétrico, e espectroscopia de massa. </li><li> Neste ponto, o material da matriz pode ser injetado in vivo para formar um andaime para engenharia de tecidos do miocárdio. </li></ol></li><li> Biotina-Labeling <ol class="lroman"><li> A ECM pode ser marcado com biotina antes da injeção para fácil visualização da ECM injetado. </li><li> Prepare uma solução 10mM de Biotina e adicionar à ECM injetável na proporção de 0.3mg/mg. O ECM deve estar na concentração desejada para a injecção. Se injetar em uma concentração de 6 mg / mL, adicionar 40 mL Biotina por 1 mL de ECM. Antes da injecção, mantenha a solução biotina-ECM no gelo por pelo menos 1 hora. </li></ol></li><li> Todas as etapas de processamento pode ser realizado à temperatura ambiente. Para manter a matriz injetável de gelificação, o passo de ajuste de pH pode ser feito em gelo. </li></ol> 3. Miocárdio Injeções <ol class="lalpha"><li> Preparação da injecção <ol class="lroman"><li> Para as fêmeas (225-250 g) usado aqui, 75 injeções mL de pH 7,4 ECM injetável foram preparadas em 0,1 mL seringas derrubado com 30 agulhas. Se ratos machos (375-400 g) foram utilizados, 90 mL pode ser injetado. </li><li> Todos os materiais cirúrgicos devem ser esterilizados antes da cirurgia, aqui usamos um pacote autoclavado cirúrgica que contém todas as ferramentas necessárias. </li></ol></li><li> No dia da cirurgia, um Harlan ratos Sprague-Dawley anestesiados com isoflurano é de 5%, intubados, utilizando um otoscópio, e depois mantida em 2,5% de isoflurano durante todo o procedimento. </li><li> Adicionar pomada lágrima artificial para os olhos do animal para se proteger contra o ressecamento e cabelo. Administrar 3 ml de solução de Ringer Lactato para hidratação durante a cirurgia. Isto deve ser feito através de injecção subcutânea na área abdominal inferior. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal na mesa cirúrgica e suavemente para baixo fita membros. Use tesouras para remover os pêlos no abdômen e cabelos vácuo livre antes da lavagem. </li><li> Fazer uma série de pequenas injeções (aproximadamente 50 mL cada) de lidocaína a 2% ao longo de uma diagonal do processo zyphoid para a parte inferior direita do abdômen. Em seguida, esfregue três vezes com betadine, começando no meio e se movendo para fora. Repita com etanol 70%. Cobrir o animal com uma cortina cirúrgica com uma janela de pré-fabricados circular; segura com pinças, se necessário. </li><li> Usando um bisturi n º 10 faça uma incisão de 3-4 cm a partir do processo xifóide até o lado inferior do lado direito do abdômen. Localize apêndice xifóide e dissecar verticalmente para baixo através do músculo para a direita, tomando cuidado para evitar o grande navio à direita. Depois de ter dissecado através do músculo, use uma tesoura para cortar lateralmente através do músculo, expondo o diafragma. Ter cuidado para evitar o fígado. </li><li> Usando um comprimento de 36 polegadas de sutura 3-0 Vicrile e um par de hemostats, agulha de uma unidade através do processo zyphoid e puxe o fio no meio. Fita adesiva nas extremidades da sutura em conjunto e corrigir isso para um ponto acima e atrás do animal, essencialmente, o levantamento do zyphoid cima e expondo o diafragma. Com outro comprimento de 36 polegadas de sutura 3-0 Vicrile, unidade de uma agulha através do músculo mais próximo ao apêndice xifóide e, novamente, puxe através de e fixar as extremidades para outro ponto à direita da mesa cirúrgica, totalmente expondo a cavidade cirúrgica. </li><li> Neste ponto, você deve ser capaz de ver o coração através do diafragma. Usando um pequeno par de dente micropinças rato, pegue o centro do diafragma, puxe-o para você e fazer uma pequena incisão com uma tesoura sem corte. É extremamente importante o uso de tesoura muito contundente para evitar picar os pulmões. Uma vez que este buraco tenha sido feito, os pulmões será recolhido, permitindo que você faça uma incisão 2-3 cm verticalmente através do diafragma para visualizar o coração. </li><li> Inserir um de 3 polegadas Q tip-à esquerda da cavidade para empurrar os pulmões para fora do caminho. Use uma pinça toalha para proteger a Q-ponta no lugar. Usar outro Q-ponta para mover o pulmão direito para fora do caminho, a fim de localizar o saco pericárdico. Usando um par de micropinças e um par de fórceps grande serrilhada, rasgam o saco pericárdico, expondo o ápice do coração. Se o animal já havia sido submetida a um procedimento de infarto, o pericárdio já estará ausente. </li><li> Agarre o ápice do coração com o micropinças dente de rato e injetar o material da matriz líquido de um terço do caminho para cima a partir do ápice. Inserir a agulha, paralelamente à superfície epicárdica e injetar com a borda chanfrada da agulha para a esquerda. Certifique-se de evitar a grande veia cardíaca. Aguarde alguns segundos antes de remover a agulha. Você deverá ver um branqueamento do tecido no local da injeção. </li><li> Limpar o sangue na cavidade e retire o grampo toalha e Q-ponta que estava segurando o pulmão direito. Use microhemostats curvas eo ratodente micropinças para fechar o diafragma. Faça um nó inicial e, em seguida, use a pinça serrilhada e microhemostats para fechar o diafragma com uma sutura contínua e uma agulha cónica. Antes de fechar totalmente, insira PE160 tubulação de sucção e usar uma seringa de 10 mL para evacuar a cavidade torácica como a sutura é apertada. </li><li> Quando devidamente evacuado e fechado, o diafragma deve ser côncavo. Um diafragma convexa indica que ainda há ar na cavidade. </li><li> Neste ponto, o isoflurano pode ser girado para baixo a 1%. </li><li> Retire ambos os 3-0 suturas Vicrile segurando a cavidade aberta. Use água estéril para hidratar o músculo, enxugando o excesso de distância com um Q-ponta ou gaze estéril. Use um novo comprimento de 3-0 sutura para fechar a camada muscular com sutura intermitente. </li><li> Neste ponto, o isoflurano pode ser desligado. </li><li> Limpe a área com água estéril e grampos usar para fechar a pele. Se grampos vai interferir com o estudo, 5-0 sutura prolina também pode ser usado. Nesse caso, use um reverso corte agulha (RC) para fechar a pele com suturas intermitente. Em ambos os casos, spot cola cirúrgica sobre a incisão fechada. </li><li> Usar um Q-ponta para ungir o local da incisão com uma pomada antibiótica tripla. </li><li> Permitir que o animal se recuperar em oxigênio a 100%. </li><li> Quando os animais começa a respirar em torno do ventilador, remova o tubo da traqueia. </li><li> Uma vez que os animais são esternal, administrar uma injecção subcutânea de 0,05 mg / kg de cloridrato de buprenorfina e devolvê-los à sua gaiola em uma toalha estéril. </li><li> Os animais devem receber pós-operatório de observação e cuidado. </li><li> Nos pontos de tempo de interesse, os animais são sacrificados e os corações removidos para análise. Seções transversais curto eixo são tomadas e podem ser corados com hematoxilina e eosina (H &amp; E) para análise de tecido grosseiro. Em pontos de curto espaço de tempo, a região injetada aparecerá como uma rede, rosa fibroso que se espalhou intersticialmente. Em momentos posteriores, observa-se um afluxo de células e uma degradação da matriz eventual injetado após 2-3 semanas. Se o ECM foi marcado com biotina antes de injetar, pode ser mais diretamente visualizados através da coloração da biotina com a HRP-conjugado estreptavidina. Coloração imuno-histoquímica pode ser usado para identificar células específicas ou estruturas na região da injeção, aqui os slides foram co-marcadas com um isolectin FITC-conjugada que se liga às células endoteliais e verde fluorescente e um anticorpo anti-actina de músculo liso com um secundário Alexafluor anticorpo que relata o SMCs em vermelho. </li></ol> 4. Resultados representante Caracterização prévia de materiais de matriz preparada desta forma demonstrado a retenção de uma variedade de macromoléculas. Especificamente, as proteínas fibrosas e múltiplas glicoproteínas foram identificados através de espectrometria de massa (Tabela 1). Se os materiais de matriz processados ​​de acordo com este protocolo são encontrados para já não contêm uma matriz complexa de macromoléculas, pode ser que o protocolo decelularização empregada é muito dura. Depois de completamente liofilizado, a seca pericárdico ECM parece muito dura, papel amassado. Outros tipos de tecido vai se assemelham a embalagem amendoins. Se bem moído, a ECM deve cair pela peneira e ser coletadas no frasco na parte inferior. Se houver umidade deixada na amostra, o MEC vai se aglutinarem e ficar preso na câmara de moagem. Após a digestão, a solução de ECM deve ser uma cor leitosa e completamente livre de partículas visíveis. Também será ligeiramente mais viscoso do que o HCl sozinho. Se o MEC não digerir bem, ainda haverá grandes partículas no frasco, alternativamente, a ECM pode falhar para fora da solução. Após ajuste de pH, não há nenhuma mudança visível na solução, ea ECM ainda é um líquido turvo homogênea. Se ele começa a gel, a viscosidade aumenta e vai ser difícil ou impossível extrair o material para uma seringa. Se isso acontecer, execute o passo de ajuste de pH no gelo, com pré-refrigerados soluções. Uma vez que as injeções foram preparadas, mantê-los no gelo até o uso. Se a injecção for bem sucedida, a região em torno da ponta da agulha whitens e um bolo pequeno é visível. Se isso não for observado, a injeção pode ter ido para a câmara, em vez de na parede. Quando o animal até a sutura após a injeção, fechando o cuidado do diafragma é o passo mais importante. Se feito corretamente, o diafragma será apertado contra os pulmões e aparecerá côncavo. Se houver alguma fica ar dentro dos pulmões, o diafragma permanecerá convexo, ou ter uma área onde os balões para fora. Ao examinar a histologia da região de injeção em um ponto de início do tempo (30 minutos a 4 horas após a injecção), deve-se ver uma área, rosa fibroso que é desprovido de células este é o material da matriz remontado pós-injeção (Figura 2) . A rede muitas vezes se espalha intersticialmente e pode estar presente durante todo muitas seções. Um possvel explicação para ver apenas uma área muito pequena da matriz de gel é que uma parte da injeção intramural errou o alvo e foi injetado na câmara de LV ou vazou do local da injeção. Além disso, dependendo do tempo de gelificação, a difusão intersticial pode variar. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) resultados. (A) padrão de peso molecular. (B) Rat colágeno tipo I de cauda (2,5 mg / mL) em comparação com o ser humano solubilizados (C) e (D) suína pericárdico ECM (7 mg / mL). Observe a presença de colágeno, assim como várias outras proteínas e peptídeos nas amostras da matriz de pericárdio. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109table1.jpg" alt="Tabela 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Componentes ECM identificado com espectroscopia de massa. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 injeções do Miocárdio:. Gelificação em vivo. H &amp; E mancha de humanos (A) e suínos (B) injeções matriz de pericárdio que têm gelled in vivo após 45 minutos. Setas indicam a localização da matriz, manchado leve rosa do que o miocárdio. Barra de escala é 500 mm. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Infiltração de células Vascular. Manchas fluorescentes para os navios no ser humano injetado (AC) e géis suína (DF) matriz em duas semanas. Células endoteliais são marcadas de verde (A, D), enquanto as células do músculo liso são rotulados vermelha (B, E). Imagens fundidas são mostrados em C e F. bar escala é 100 mm. As linhas brancas pontilhadas indicam a área de injeção de matriz, como determinado pelo H &amp; E a análise de uma seção próxima. <img src="/files/ftp_upload/2109/2109fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Células-tronco dentro da matriz região da injeção. A Hoescht mancha de núcleos (azul) e c-kit (verde) identifica células-tronco em humanos (A) e suínos (B) as regiões de injeção matriz. Barra de escala é 50 mm.

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</ol>

Use animal: Todos os experimentos deste estudo foram realizados de acordo com as directrizes publicadas pela Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Califórnia, San Diego e da Associação Americana para Credenciamento de Laboratório Animal Care.

Este método permite a geração de biologicamente derivada, andaimes injetável para a engenharia de tecidos do miocárdio. Embora estes métodos foram desenvolvidos inicialmente para a fabricação e testes in vivo de um gel matriz do miocárdio e apresentou aqui com um gel matriz de pericárdio, este protocolo pode ser adaptado para uso com qualquer tecido, desde que o tecido pode ser adequadamente descelularizados. Decelularização deve ser realizada e verificada antes da utilização destes métodos, como a presença de ...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagentes:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p6887-1G</td><td>Liofilizado </td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>21217</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidina-HRP</td><td>Thomas Scientific</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipamento:&lt;/strong&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moedor Wiley Mini</td><td>Thomas Scientific</td><td>3383L10</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador Labconco</td><td>Labconco Corp.</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Suprimentos cirúrgicos:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-154-16</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Ringer com lactato</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>003966</td><td></td></tr><tr><td>KY Jelly</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>28658</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaína, 2%</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>17767</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina cloridrato</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>Pomada de lágrima artificial</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9860843</td><td></td></tr><tr><td>Pomada antibiótica tripla</td><td>Fisher Scientific</td><td>19082795</td><td></td></tr><tr><td>Isóflurano</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>60307-120-25</td><td></td></tr><tr><td>Otoscópio </td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>008699</td><td></td></tr><tr><td>Válvula de três vias</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>006245</td><td></td></tr><tr><td>Sutura 3-0 Vicrile</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>J327H</td><td></td></tr><tr><td>Sutura 5-0 Proline</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>s-1173</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de corte reverso (RC)</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8684G</td><td></td></tr><tr><td>Microhemostáticos </td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinça micro dentada</td><td>Fine Science Tools</td><td>11084-07</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi nº 10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10110-01</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura romba</td><td>Fine Science Tools</td><td>14108-09</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura curva afiada</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinça grande serrilhada</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de sucção PE160</td><td>BD Biosciences</td><td>427430</td><td></td></tr><tr><td>Tosquiadeira </td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>21608</td><td></td></tr><tr><td>Grampos cirúrgicos/aplicador de grampos </td><td>Ethicon Inc.</td><td>PRR35</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Suprimentos gerais:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de agitação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl 0,1 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH 1 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 0,1 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cola cirúrgica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campo cirúrgico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grampos para toalha</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirador de mão pequeno </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para engenharia de tecidos do miocárdio

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Este protocolo fornece métodos para a preparação de um gel injetável matriz extracelular (ECM) para aplicações de engenharia de tecidos do miocárdio. Resumidamente, o tecido é decelularizado liofilizada, moída, enzimaticamente digerido, e então levadas ao pH fisiológico. A liofilização remove todo o conteúdo de água do tecido, resultando em ECM seco que podem ser moídos em um pó fino com um pequeno moinho. Depois da moagem, o pó ECM é digerida com pepsina para formar uma matriz de injetáveis. Após o ajuste para pH 7,4, o material da matriz líquido pode ser injetado no miocárdio. Resultados de ensaios de caracterização prévios mostraram que os géis matriz produzida a partir de decelularizado pericárdio e miocárdio conservar os componentes ECM nativa, incluindo diversas proteínas, peptídeos e glicosaminoglicanos. Dada a utilização deste material para engenharia de tecidos, na caracterização vivo é especialmente útil, aqui, um método para a realização de uma injeção intramural para o ventrículo esquerdo (VE) da parede livre é apresentado como um meio de analisar a resposta do hospedeiro ao gel matriz em um modelo animal de pequeno porte. Acesso à cavidade torácica é adquirida através do diafragma ea injeção é feita um pouco acima do ápice na parede livre do VE. O andaime biologicamente derivada pode ser visualizado por biotina rotulagem antes da injeção e, em seguida, coloração secções de tecido com um rabanete de cavalo conjugado com peroxidase neutravidin e visualização através de coloração diaminobenzidina (DAB). Análise da região de injeção também pode ser feito com coloração histológica e imuno-histoquímico. Desta forma, o gel previamente examinadas matriz de pericárdio e miocárdio foram mostrados a forma fibrosa, redes porosas e promover a formação de vasos na região da injeção.

Métodos para a preparação de um gel matriz injetável a partir de tecido decelularizado e injetá-lo em rato miocárdio<em&gt; In vivo</em&gt; São descritos.

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

Este protocolo fornece métodos para a preparação de um gel de matriz extracelular (ECM) injetável para aplicações de engenharia de tecido miocárdico.

Géis de matriz produzidos a partir de tecidos pericárdicos e miocárdicos descelularizados retêm componentes nativos da matriz extracelular, incluindo diversas proteínas, peptídeos e glicosaminoglicanos. Essas matrizes teciduais podem ser utilizadas na engenharia de tecidos. Neste vídeo, géis de matriz são fabricados mediante a descelularização de tecido pericárdico para obter matriz extracelular acelular.A matriz extracelular é então processada para criar uma versão líquida solubilizada. Em seguida, a matriz solubilizada é testada em um modelo animal pequeno para determinar sua viabilidade como um suporte injetável. A análise histológica e imunohistoquímica demonstra que, in vivo, o material injetado forma um suporte fibroso poroso que permite a infiltração de células vasculares.Olá, meu nome é Sonia Zeki. Sou aluna de pós-graduação no laboratório da Dra. Karen Chrisman na Universidade da Califórnia em San Diego. Hoje vamos fabricar ECM solubilizada a partir de tecido descelularizado e demonstrar testes in vivo para aplicações em engenharia de tecidos cardíacos.Essas técnicas são importantes para o desenvolvimento de uma terapia com biomaterial injetável para o tratamento da insuficiência cardíaca. Pós-infarto do miocárdio demonstrando o procedimento cirúrgico ser Pam, shoot McGuffin, um neurocirurgião veterinário em nosso laboratório. Então, vamos começar.Inicie este protocolo descelularizando o tecido para deixar apenas a matriz extracelular ou ECM; coloque inicialmente o pericárdio suíno em um béquer com água desionizada e lave-o agitando durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após a lavagem, coloque o tecido em PBS 1× contendo 1% de SDS e 1% de penicilina-estreptomicina, agitando continuamente por 24 horas à temperatura ambiente. No dia seguinte, retorne o tecido para água desionizada e agite continuamente por cinco horas, agitando em um tubo de 50 mililitros até que todas as bolhas desapareçam.A coloração com hematina e eosina deve revelar a ausência de núcleos no tecido descelularizado. Coloque o restante do tecido descelularizado em um tubo cônico de 15 a 50 mililitros. Em seguida, coloque o tecido no congelador a menos 80 graus Celsius.Liofilize as amostras congeladas por liofilização sob pressão muito baixa e temperatura muito baixa até ficarem completamente secas. Dependendo do sistema utilizado e do teor de água das amostras, isso pode levar de 12 a 72 horas. Uma vez que o tecido descelularizado estiver completamente seco, transfira-o para um moinho Wiley Minim.Com o auxílio de uma peneira de malha 40, triture o tecido até obter um pó fino. Assim que a maior parte da amostra tiver passado pelo filtro, remova o frasco de coleta. Esta amostra passa a ser denominada matriz extracelular ou pó de MEC.Um segundo passo de liofilização pode ser realizado neste momento, caso não se prossiga imediatamente para a próxima etapa. Isso garante a precisão do peso registrado para solubilizar a MEC. Pese a quantidade desejada de pó de MEC em um frasco estéril.Adicione solução estéril filtrada de cloreto de hidrogênio contendo um miligrama por mililitro. Pepcid ao frasco de cintilação com o pó de ECM de modo que o ECM fique numa concentração de 10 miligramas por mililitro. Adicione uma barra de agitação e coloque o frasco na placa de agitação.Agite continuamente por 48 a 60 horas, raspando periodicamente as laterais do frasco com uma colher ou espátula estéril WHE, para garantir a digestão de todo o pó de MEC. Conforme o MEC for digerido, ele entrará em solução.Uma vez que a MEC tenha sido solubilizada, coloque a amostra em gelo e ajuste o pH para 7,4 utilizando hidróxido de sódio e ácido clorídrico. Após o ajuste do pH, adicione PBS 10 vezes para que a concentração final da solução seja PBS 1 vez. Por exemplo, se você tiver 900 microlitros de solução de MEC, após os ajustes de pH, devem ser adicionados 100 microlitros de PBS 10 vezes.Determine a concentração da solução de MEC solubilizada somando os volumes adicionados para neutralizar e os volumes removidos para testar o pH. Em seguida, adicione PBS em quantidade equivalente para atingir a concentração final desejada aqui. Seis miligramas por mililitro.No dia da cirurgia, prepare uma injeção de 75 microlitros de MEC solubilizada em uma seringa de 0,1 mililitro com agulha de 30 graus. Mantenha a anestesia de uma rata Harlan dolly intubada com 2,5% de óxido de flúor. Aplique protetor ocular, depois verifique a anestesia realizando uma compressão do dedo do pé.Administre três mililitros de solução de Ringer com lactato por injeção subcutânea na região abdominal inferior para hidratação. Em seguida, posicione o animal em posição supina sobre a mesa cirúrgica e prenda suavemente as patas com fita adesiva. Use uma tesoura elétrica para remover os pelos do abdômen e aspire os pelos soltos.Realize uma série de injeções de 50 microlitros de lidocaína a 2% ao longo de uma diagonal que vai do processo xifoide até o lado inferior direito do abdômen. Em seguida, esfregue três vezes com Betadine, começando no centro e movendo-se para fora. Repita a esfregação com álcool isopropílico.Em seguida, cubra o animal usando um campo cirúrgico com uma janela circular pré-fabricada. Fixe com um campo cirúrgico. Usando um bisturi número 10.Faça uma incisão de três a quatro centímetros a partir do processo xifoide até o lado inferior direito do abdômen. Localize o processo xifoide e dissecção verticalmente para baixo através do músculo em direção à direita, tomando cuidado para evitar o vaso grande localizado à direita. Em seguida, use uma tesoura para cortar lateralmente através do músculo, expondo o diafragma.Tenha cuidado para evitar o fígado usando um fio de sutura Vicryl 3-0 com 36 polegadas de comprimento e um par de hemostatos. Passe uma agulha através do processo xifoide e puxe o fio de sutura pela metade. Una as pontas do fio com fita adesiva e fixe-as em um ponto acima e atrás do animal, elevando o processo xifoide e expondo o diafragma com outro fio de sutura Vicryl 3-0 de 36 polegadas de comprimento.Insira uma agulha através do músculo mais próximo do processo xifoide e, novamente, puxe e fixe a extremidade em outro ponto à direita da mesa cirúrgica, expondo completamente a cavidade cirúrgica. Em seguida, utilizando um pequeno par de pinças microcirúrgicas dentadas, segure o centro do diafragma, puxe-o para fora e faça uma incisão muito pequena com uma tesoura romba. Uma vez feito esse orifício, os pulmões irão retrair.Realize uma incisão vertical de dois a três centímetros através do diafragma para visualizar o coração. Em seguida, insira um cotonete de sete centímetros à esquerda da cavidade e afaste os pulmões. Fixe o cotonete no lugar utilizando um prendedor de toalha.Usando outro swab, mova o pulmão direito para o lado a fim de localizar a bolsa pericárdica. Em seguida, com um par de pinças microcirúrgicas e um par de pinças grandes serrilhadas, rasgue a bolsa pericárdica, expondo o ápice do coração. Segure o ápice do coração com a pinça microcirúrgica dentada da direita e insira a agulha para injetar a matriz solubilizada com a borda biselada voltada para a esquerda.A um terço do caminho a partir do ápice, paralelo à superfície epicárdica. Certifique-se de evitar a veia cardíaca magna. Injete o gel de matriz solubilizado e aguarde alguns segundos antes de remover a agulha.O tecido deve embranquecer no local da injeção; limpe o sangue na cavidade e remova o grampo de toalha e a gaze que seguram o pulmão direito usando hemostatos microcurvos, fazendo um nó inicial com um comprimento de 30 polegadas de sutura de prolina cinco zero. Em seguida, use pinças microcirúrgicas dentadas para fechar o diafragma com uma sutura contínua e uma agulha cônica antes de fechar completamente. Insira um tubo de sucção PE 160 e feche ao redor usando uma seringa de 10 mililitros para esvaziar a cavidade torácica.À medida que o ponto é apertado, o diafragma deve ficar côncavo. Reduza o fluxo de flúor para 1%. Remova ambos os pontos de Vicryl 3-0 que mantêm a cavidade aberta. Hidrate o músculo, removendo o excesso com um cotonete ou gaze estéril.Use um novo segmento de fio 3-0 para fechar a camada muscular com pontos intermitentes. Em seguida, desligue o isoflurano. Limpe a área e use grampos para fechar a pele.Em seguida, aplique uma pomada antibiótica tríplice no local da incisão. Deixe o rato se recuperar sob oxigênio a 100%. Quando o animal começar a respirar ao redor do ventilador, remova o tubo traqueal.Uma vez que o animal esteja novamente de pé, administre uma injeção subcutânea de 0,05 miligramas por quilograma de analgésico cloridrato de buprenorfina e devolva-o à gaiola de origem sobre uma toalha estéril. O tecido cardíaco de ratos injetados com géis de matriz solúvel foi seccionado e corado com hematoxilina, eosina e eoin para análise macroscópica do tecido em diferentes pontos temporais. Após a cirurgia, em pontos temporais iniciais, a região injetada aparece como uma rede fibrosa cor-de-rosa que se espalha intersticialmente em pontos temporais posteriores.Observa-se influxo celular após duas semanas. É possível observar a degradação da matriz injetada. Se a matriz extracelular foi marcada com biotina antes da injeção, pode ser visualizada de forma mais direta por meio da coloração da biotina com estreptavidina conjugada à HRP, para visualizar o crescimento e a formação de vasos na região de injeção da matriz.As lâminas aqui foram contracoradas com um fitzil. A selectina conjugada, que se liga a células endoteliais mostradas em verde, e um anticorpo antimusculatura lisa contra actina mostrado em vermelho. Células-tronco também podem ser identificadas próximas à região de injeção.Aqui eles foram visualizados com uma coloração de imuno-histoquímica para C kit. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar matriz extracelular solubilizada a partir de tecido descelularizado e testá-la in vivo para aplicações em engenharia de tecidos cardíacos. Não se esqueça de que, embora utilizemos tecido pericárdico, este procedimento geral pode ser modificado para ser usado com qualquer fonte de tecido.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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