Estudo Influência Heterogeneidade células gliais no crescimento Axon Usando um método de co-cultura New

O objetivo geral deste procedimento é estudar a influência da heterogeneidade glial sobre o crescimento de axônios de gânglios da raiz dorsal e a despolarização celular. Isso é realizado primeiramente transformando as células gliais do córtex de ratos neonatos. O segundo passo do procedimento consiste em cultivar e purificar os neurônios do gânglio da raiz dorsal de embrião de rato.

O terceiro passo do procedimento é adicionar os neurônios de gânglios dorsais purificados sobre as células glias. O passo final do procedimento é observar o crescimento dos axônios nas células nervosas e realizar a coloração celular e a análise de quantificação. Em última instância, os resultados podem ser obtidos.

Esse estudo demonstra que o crescimento dos neurônios de gânglios da raiz dorsal é influenciado por células gliais heterogêneas por meio de gravação com lapso de tempo e microscopia de imunofluorescência. Olá, sou do laboratório de neuroimagem do Departamento de Neurologia da UCRA. Hoje mostraremos um procedimento para estudar a influência heterógena das células gliais sobre o crescimento em um novo método de cultura de neurônios.

Em nosso laboratório, utilizamos este novo método para estudar a interação entre neurônios e células gliais. Vamos, então, realizar o estudo. Para estabelecer uma co-cultura de células gliais e neurônios do gânglio da raiz dorsal ou DRGs, começaremos cultivando as células gliais sob uma capela de cultura celular. Forre o fundo de placas de cultura pré-esterilizadas de 24 poços com lamínulas circulares de vidro esterilizadas, recubra as lamínulas nos poços de uma placa de cultura de seis poços com polilisina e incube por duas horas à temperatura ambiente.

Lave as lamínulas e as placas de cultura duas vezes com água destilada e deixe secar ao ar. Em seguida, pipete 200 microlitros ou dois mililitros de meio Eagle modificado por dcos ou DMEM com 10% de soro bovino fetal ou FBS em cada placa de 24 poços ou de seis poços, respectivamente. Incube as placas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono no dia seguinte.

Esterilize a capela de fluxo positivo. Ligue a luz UV por 20 minutos e, em seguida, pulverize todas as superfícies sob a capela com etanol 70% e aguarde 15 minutos antes do uso. Inicie com as cabeças de dois filhotes de rato P2 a P6 que foram anestesiados por hipotermia.

Em seguida, decapite na base do forame magno com tesoura cirúrgica. Abra o crânio ao longo da sutura sagital usando tesoura de íris e remova o crânio. Retire o prosencéfalo e coloque em Leibovitz L-15 gelado e repita com a segunda cabeça.

Em seguida, trabalhe sob um microscópio estereoscópico. Remova cuidadosamente a dura-máter e as membranas e vasos sanguíneos que recobrem o cérebro. Isole o córtex e lave várias vezes com meio L 15.

Use tesouras de microcirurgia para cortar o córtex em pequenos pedaços. Em seguida, incube em meio L 15 contendo 0,125% de trips em EDTA a 37 graus Celsius por 15 minutos. A seguir, transfira os blocos de tecido para um tubo de 50 mililitros contendo 20 mililitros de DMEM com 20% de FBS.

Adicione DS para uma concentração final de 10 microgramas por mililitro. Em seguida, use uma pipeta de vidro polida ao fogo para agitar a solução tecidual aproximadamente 20 vezes, a fim de separar as células. Por fim, lave as células uma vez com DMEM contendo 10% de FBS e determine o número de células com um hemocitômetro.

Em seguida, semeie as células a 5.000 a 10.000 células por centímetro quadrado e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Substitua o meio duas vezes por semana para isolar, purificar e cultivar os DRGs. Primeiro, prepare placas de 24 poços com lamínulas de vidro revestidas com polilisina, conforme demonstrado anteriormente.

Adicione 100 microlitros de meio NVF a cada lamínula e incube as placas a 37 graus Celsius no dia seguinte. Esterilize a cabine de fluxo laminar como anteriormente. Em seguida, inicie com embriões de rato de E12 a E15 que foram isolados do útero de uma rata prenhe eutanasiada com dióxido de carbono sob o microscópio estereoscópico.

Isole a medula espinhal com os gânglios da raiz dorsal conectados e transfira para placas de 35 milímetros contendo meio Leibovitz L-15 gelado. Usando pinças de microcirurgia, dissecar cuidadosamente os GDRs conectados da medula espinhal no meio L-15 gelado sem lesar os GDRs, cortando os axônios conectados.

Normalmente, 20 a 30 gânglios da raiz dorsal são isolados de uma medula espinhal quando todos os gânglios da raiz dorsal tiverem sido obtidos das medulas espinhais. Todos os gânglios da raiz dorsal isolados são colocados em tripsina 0,125% com EDTA e incubados por 20 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Lave as células uma vez com DMEM contendo 20% de soro bovino fetal, então adicione DNA e pipete várias vezes usando uma pipeta de vidro polida ao fogo para formar uma suspensão celular uniforme, conforme demonstrado com as células gliais. Realize uma segunda lavagem em meio MBF, conte as células e, em seguida, semeie-as sobre lamínulas previamente preparadas em placas de 24 poços, com 5.000 células por poço, e incube durante a noite para purificar os neurônios dos gânglios da raiz dorsal.

18 a 24 horas após a semeadura. Substitua o meio por meio neurobasal contendo 20 micromolares de cinco fluoro dois doxi uridina 72 horas depois. Substitua metade do meio por meio neurobasal sem FUDR.

O meio é então substituído a cada dois dias. Aproximadamente 20 dias após o plaqueamento das células gliais, elas atingirão confluência e estarão prontas para co-cultivo com neurônios, 24 horas antes da combinação dos dois tipos celulares.

Substitua o meio das células gliais pelo meio MBF. Prepare uma suspensão simples de células de GDRs purificados conforme demonstrado anteriormente. Determine a densidade celular.

Em seguida, semeie os neurônios a 500 células por centímetro quadrado sobre as células gliais. O crescimento axonal e a extensão dos neuritos sobre as células gliais podem ser analisados em diferentes pontos temporais utilizando software de análise de imagem e imunoquímica com anticorpos específicos para o tipo celular. Abaixo seguem exemplos de células gliais e neurônios do gânglio da raiz dorsal cultivados separadamente e em co-cultura, nas quais as células gliais tornam-se confluente após 20 dias.

Em cultura. Em um microscópio de contraste de fase, ficou evidente que diferentes subpopulações de células gliais formam padrões de crescimento e morfologias distintas. E por meio de imunocitoquímica, observou-se que astrócitos positivos para GFAP representavam mais de 90% da cultura.

Utilizando nosso método de tratamento com FUDR por 72 horas, a pureza dos neurônios de gânglios da raiz dorsal atingirá até 99% em seis dias e exibirá suas morfologias únicas com alta densidade de crescimento de neuritos em um co-cultivo de neurônios e células gliais. O adensamento de neurônios de gânglios da raiz dorsal e o crescimento de neuritos ocorrem prontamente sobre células gliais dentro de quatro horas após a semeadura; o adensamento neuronal e o crescimento de neuritos foram influenciados por subpopulações de células gliais, que formam subestruturas de padrões de crescimento especiais facilmente identificáveis em microscopia de contraste de fase. E por meio da imunocitoquímica, mostrarei como cultivar neurônios de gânglios da raiz dorsal com células claras para estudar a influência da heterogeneidade das células gliais sobre o crescimento neural.

Ao realizar esta sessão, é muito importante lembrar-se de manipular o tecido com muito cuidado e manter as células no meio. Nunca os exponha ao ar, nem deixe secar. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.