Avaliação da dinâmica imunologicamente relevantes Terciário características estruturais do HIV 1-V3 loop Sequence R2 Crown por Ab initio Folding

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar as preferências estruturais dinâmicas da sequência do peptídeo V três coroas da cepa R dois do HIV via dobramento AR e correlacionar os resultados com sensibilidades de neutralização conhecidas da cepa R dois. Isso é conseguido selecionando um fragmento apropriado da coroa R dois V de três alças para dobrar AR bonni. Como segunda etapa, é realizada a simulação da dobragem, que busca todas as confirmações possíveis do fragmento de coroa R two e registra, as confirmações mais prováveis em um arquivo de pilha.

Em seguida, as confirmações registradas são analisadas para determinar a preferência estrutural dinâmica da coroa R dois V três que pode explicar sua sensibilidade à neutralização. São obtidos resultados que compartilham uma preferência por uma fita beta rígida posições 12 a 14 do V três loops com base na estrutura secundária, preferência e distribuição de energia da pilha de confirmações pesquisadas. Olá, sou Timothy Cardozo, falando com você do meu laboratório no Departamento de Farmacologia da Escola de Medicina da Universidade de Nova York.

Hoje mostraremos um procedimento para dobramento de proteína abio de uma alça flexível em uma proteína viral imunogênica do HIV um conhecida como GP one 20. A alça flexível é conhecida como a alça V três desta glicoproteína do envelope superficial do vírus HIV um e sua ponta é conhecida como a coroa da alça V três. Esta é a região que estaremos dobrando.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para nos ajudar a identificar caminhos produtivos para projetos bem-sucedidos de vacinas contra o HIV. Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, selecione a sequência V de três coroas a ser dobrada in silico.

Estudos anteriores deste laboratório indicam que as posições 10 a 22 de qualquer sequência de três loops em V fornecem os melhores resultados, executam os experimentos de dobragem de armenio com os menus suspensos fáceis de usar na interface gráfica do usuário ou na GUI do software de modelagem molecular ICM Pro. Primeiro, a estrutura atômica tridimensional do peptídeo correspondente a essa sequência deve ser incorporada ao ás espacial virtual do computador. Para construir a estrutura atômica tridimensional, vá no menu de arquivo e selecione novo.

Isso revelará uma tela com várias guias. Selecione a guia peptídica e cole ou digite a sequência na caixa de texto. Clique em OK para construir a estrutura tridimensional do peptídeo.

A estrutura aparecerá na janela gráfica do ICMs. Uma vez que a estrutura tridimensional tenha sido construída, vá para o menu de mecânica molecular e selecione minimizar, que aparecerá como um menu lateral. No menu lateral, escolha global.

Isso revelará uma tela com vários campos de entrada e caixas de seleção já selecionadas para os parâmetros padrão. Se necessário, altere a seleção para escolher o peptídeo a ser dobrado. Ajuste a duração e a precisão da simulação alterando o número de movimentações globais e o número de chamadas mínimas locais, respectivamente.

Selecione tudo para todo o dobramento de átomos do peptídeo. Em seguida, selecione salvar filme para criar um arquivo de filme da dobra. Por fim, clique em aplicar para iniciar a dobragem na janela gráfica.

O algoritmo começa a dobrar o peptídeo em diferentes confirmações, calculando e registrando a energia do peptídeo para cada confirmação. Uma vez concluída, a confirmação energeticamente mais estável do peptídeo, bem como confirmações alternativas com quase a mesma energia, serão identificadas e visualizadas no computador Realizando o dobramento do peptídeo. Usar o pegajoso demonstra como é a dobragem, mas não permite a seleção de parâmetros ideal para dobrar a coroa V de três laços.

Para isso, é melhor realizar a dobra a partir da linha de comando não gráfica Usando um script, um script é simplesmente uma série de comandos de texto salvos linha por linha em um documento ou arquivo de texto que são alimentados no programa ICM automaticamente e executados um após o outro para dobrar o V três loop usando um script de linhas de comando. Primeiro, escreva um arquivo de texto para ser salvo no disco rígido do computador em um diretório local. Como antes, comece construindo o peptídeo no espaço virtual do computador.

Em seguida, dê um nome à simulação e defina o número de variáveis livres, que são as ligações químicas no peptídeo deixadas livres para girar no dobramento. Em seguida, especifique por quanto tempo a simulação será executada para dobrar o dobramento ideal do loop V três. Isso dependerá do número de variáveis livres identificadas na etapa anterior para determinar a precisão da busca confirmacional no experimento, definir o número de etapas de busca a serem realizadas em cada mínimo local.

Em seguida, defina outros parâmetros que foram otimizados para a simulação com base em pesquisas anteriores, incluindo a minimização da temperatura, gradiente e distribuição de probabilidade. Após a configuração dos parâmetros experimentais, indique quais cálculos de energia serão usados durante o dobramento. Aqui, a energia de Vander Vi é indicada pelo peptídeo interno da VW.

A energia é indicada por 14 ligações de hidrogênio a energia é indicada por HB eletrostático. A energia é indicada por El Salvação. A energia é denotada por SF e a entropia é denotada por EN. Especifique as configurações finais, incluindo os ângulos preferidos do backbone e da cadeia lateral a serem pesquisados e a confirmação inicial.

Por fim, escreva o comando para executar e salvar o cálculo. Depois que o script for escrito e salvo como um arquivo de texto, execute-o no prompt de empréstimo de comando do sistema operacional do computador. Como antes, a confirmação energeticamente mais estável do peptídeo, bem como confirmações alternativas com energia comparável, serão identificadas e salvas no arquivo do projeto para visualização no computador.

Depois que o cálculo for concluído, abra o arquivo selecionando arquivo aberto no menu suspenso EE. Exiba a molécula clicando na caixa de seleção ao lado dela no painel da área de trabalho, selecione a visualização de pilha de mecânica molecular. Para visualizar a pilha de classificação de energia das principais confirmações de peptídeos do dobramento, clique na ferramenta de plotagem no canto inferior direito do painel da pilha para plotar os resultados.

Primeiro clique em OK na janela resultante e, em seguida, clique na guia do meio do gráfico chamada melhor congo. Em seguida, clique na primeira linha da tabela de resultados da pilha, que é a confirmação de energia mais baixa encontrada na pesquisa. A estrutura peptídica será reorganizada em sua confirmação de energia mais baixa na janela gráfica.

Analise esta confirmação para características de fita beta ou alfa helicoidal, especialmente nas cinco primeiras posições do peptídeo. Selecionando esta região na sequência e clicando no ícone de stick no canto superior esquerdo da tela para exibir todos os átomos. Em seguida, a pilha de resultados de energia deve ser analisada para traçar as melhores confirmações.

Se a confirmação de energia mais baixa for separada por uma lacuna significativa das outras confirmações, isso indica uma tendência para uma estrutura rígida. Para avaliar os resultados, abra o frasco do projeto e escolha a visualização da pilha de mecânica molecular, uma tabela das confirmações da pilha aparecerá. Visualize as confirmações de pilha clicando no ícone do histograma de plotagem.

Por fim, clique em mecânica molecular para fazer um filme na pilha e visualizar as preferências de confirmação descobertas pela dobra aqui. Os resultados para a dobragem de R dois são mostrados. A confirmação não é alfa helicoidal e é uma bobina aleatória como esperado para V três coroas de alça, notadamente no fragmento no resíduo 12 a 14.

No loop V três, uma clara preferência de confirmação de fita beta é vista em toda a pilha e muito poucas confirmações helicoidais alfa são observadas. Uma confirmação de fita beta local é reconhecida por sua forma linear estendida. Esta é a localização da sequência incomum de isoleucina prolina metionina da cepa R dois, uma sequência rara em cepas de HIV nesta posição, e que foi hipotetizada como responsável pelas características incomuns de R dois.

Além disso, uma lacuna de energia de quase três unidades é vista entre a confirmação de energia mais baixa e a segunda confirmação de energia mais baixa. Assim, a estrutura só pisca a confirmação de energia mais baixa em menos de 1% do tempo, sugerindo que a coroa R dois V três e sua confirmação de deformação beta local nas posições 12 a 14 tem uma estrutura mais rígida em vez de ser completamente flexível por natureza. Acabamos de mostrar como dobrar uma sequência de coroa de três alças em V usando o algoritmo abio implementado no software ICM e mostramos como analisar os resultados usando a cepa R dois do vírus HIV.

Por exemplo, ao fazer este procedimento, é importante escolher cuidadosamente a identidade do peptídeo de dobramento correspondente a um fragmento da coroa V três, e também é importante interpretar os resultados em relação à preferência de confirmação e energia usando a consulta especializada de um modelador molecular. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.