Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens tridimensionais em escala micrométrica da concentração de oxigênio no ambiente imediato de células vivas por meio da microscopia de ressonância de spin eletrônico ou ESR. O protocolo será demonstrado em cianobactérias, que são células fotossintéticas comuns. Isso é alcançado primeiramente preparando uma amostra de células de cianobactérias dentro do porta-amostras da microscopia ESR.

Incorporado em uma solução estável de radical orgânico. O porta-amostras é colocado dentro da sonda de imagem, que é inserida no eletroímã estático do sistema de microscopia de RPE. Agora, várias imagens microscópicas tridimensionais de RPE da solução de radical orgânico são adquiridas pelo microscópio de RPE.

Isso é realizado para várias variantes de sequências de pulsos e frequentemente sob diversas condições externas, como em condições de luz e escuridão. Em seguida, as imagens de dados brutos são processadas pelo computador para extrair os tempos de relaxação tridimensionais com resolução espacial do radical. Esses tempos de relaxação fornecem uma medida direta da concentração de oxigênio por meio de calibração pré-existente, levando a mapas tridimensionais completos de oxigênio das amostras medidas sob diversas condições externas.

Obtêm-se resultados que demonstram claramente a ausência de produção de oxigênio pelas cianobactérias quando nenhuma luz é aplicada. Além disso, mostra-se que sob irradiação luminosa, são criados gradientes significativos de oxigênio e heterogeneidade de oxigênio próximos às células de cianobactérias. Olá, sou Al do laboratório de BLA na Faculdade S de Química do Technion, o Instituto Israelense de Tecnologia em Haifa.

Hoje vamos mostrar um procedimento para mapear concentrações de oxigênio próximas a células vivas de maneira tridimensional com alta resolução espacial por meio da microscopia de ponta de prova. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a taxa de consumo de oxigênio e a atividade metabólica de células. Então, vamos começar.

A ressonância de spin eletrônico ou RSE é uma técnica espectroscópica na qual radiação eletromagnética em uma frequência específica é absorvida por espécies paramagnéticas que possuem spin de elétron desemparelhado, colocadas sob um campo magnético estático externo. É um método poderoso para estudar o ambiente de moléculas paramagnéticas em espécies vivas, incluindo as concentrações de oxigênio e espécies reativas de oxigênio. Aqui é mostrada uma imagem típica da concentração de oxigênio em um camundongo com tumor, para amostras heterogêneas.

As informações espectrais de RPE podem ser obtidas de maneira espacialmente resolvida por meio do uso de gradientes de campo magnético. Um radical orgânico estável e livre foi injetado no camundongo e suas características de RPE fornecem a concentração de oxigênio no seu entorno. Os resultados baseados em RPE são sobrepostos a uma imagem anatômica de RMI.

Até o momento, tais técnicas de imagem por RPE de espécimes vivos foram realizadas apenas com amostras relativamente grandes em escala de milímetro. A microscopia de RPE envolve a medição de amostras com tamanho de milímetro e submilímetro, fornecendo imagens tridimensionais de RPE com uma resolução próxima a um mícron.

Aqui estão dois exemplos de imagens de RPE em escala micrométrica com alta resolução, de amostras geradas com pó NNC 60 e cristais paramagnéticos de cianeto férrico de lítio. Um microscópio de RPE é semelhante a um espectrômetro convencional de RPE, possuindo um ímã para gerar o campo estático, um sistema de micro-ondas para excitação de spins e detecção de sinal, uma sonda para segurar a amostra e um console informatizado para controlar o processo de aquisição e o tratamento de dados. Outros componentes do sistema incluem drivers de gradiente de campo magnético, que fazem parte do sistema eletrônico, e bobinas de gradiente localizadas na sonda de imagem.

As bobinas de gradiente também possuem uma abertura para permitir a irradiação luminosa da amostra. Um ar úmido controlado em temperatura é aplicado à amostra para garantir desidratação mínima durante o experimento. As principais características únicas da microscopia de RSE são o tamanho reduzido da sonda e das bobinas de gradiente, a maior sensibilidade ao spin do sistema e a alta intensidade dos drivers de gradiente de campo magnético. Antes do início deste procedimento, prepare uma suspensão de cianobactérias numa concentração de 40 miligramas por mililitro.

Para iniciar o preparo da amostra para microimagem por RPE, pegue alguns quadrados de papel absorvente com tamanho aproximado de 400 por 400 mícrons usando pinças finas. Em seguida, insira-os em um tubo einor. Posteriormente, encha o tubo com 1,2 mililitros da suspensão de cianobactérias.

Em seguida, centrifugue a suspensão por dois minutos a 6.000 RPM em uma microcentrífuga; após a centrifugação, remova completamente o sobrenadante, exceto por aproximadamente 50 microlitros, que devem ser mantidos para evitar a desidratação das cianobactérias. Esse processo resulta na saturação do papel absorvente com as células de cianobactérias. A seguir, prepare um suporte para amostras de vidro especialmente preparado, retire algumas fibras do papel usando pinças finas e coloque-as no fundo do suporte para amostras.

Em seguida, adicione três milimolares de tridel e solução BG 11, que é preparada conforme descrito no protocolo escrito, utilizando um oitavo de uma seringa. Então, feche o porta-amostras com cola curável por UV, aplicando a cola entre as bordas do porta-amostras de vidro e sua tampa de lamínula correspondente, deixando uma pequena saída de ar aberta. Por fim, cure a cola com luz UV por dois segundos.

Para iniciar o experimento de imageamento, ligue o sistema de microimageamento por RPE e insira a amostra no ressonador que fica dentro da sonda de imageamento. Em seguida, utilizando o software de controle do computador, configure o sistema no modo de ajuste e localize a frequência de micro-ondas de ressonância da sonda, que será utilizada para as medições de RPE. Após isso, ajuste o campo magnético estático ao valor que corresponde à frequência de micro-ondas aplicada.

Defina os parâmetros de temporização para a sequência de pulsos e observe o sinal de RPE para garantir que o sistema funcione corretamente e que a amostra esteja bem preparada. Em seguida, defina os parâmetros de imageamento, como o número de pixels, a intensidade dos gradientes e a duração dos pulsos de gradiente, para os valores exigidos. Após a configuração, adquira três imagens tridimensionais de RPE por meio de uma sequência de pulsos de imageamento por eco de Han, com valores de separação interpulsos tau de 500, 600 e 700 nanossegundos.

Neste momento, ligue a projeção de luz na amostra, se necessário para as condições experimentais durante toda a aquisição, pois os dados são automaticamente salvos. Após o processo de aquisição de dados, os arquivos de dados brutos são processados por meio de um script do software MATLAB. Utilizando o software, gere imagens da concentração do radical tril e do tempo de relaxação.

T dois é usado para mapear e então traduzir essas imagens em uma imagem de concentração de oxigênio por meio de uma curva de calibração preexistente que relaciona a concentração de oxigênio ao tempo de relaxação. Aqui, T dois zero é o tempo de relaxação spin-spin do sensor sob condições anóxicas, dependendo da concentração C do sensor e de seu coeficiente de difusão D. São apresentadas imagens típicas de dados brutos provenientes de diversos experimentos tridimensionais de imageamento por RPE realizados em cianobactérias. Essas imagens foram adquiridas com diferentes valores de tau sob condições de escuridão ou luz.

Em condições de escuridão, os resultados são muito semelhantes, exceto pela diminuição da intensidade para os valores maiores de T devido ao tempo de relaxação spin-spin, T dois. Inversamente, sob irradiação luminosa, o padrão da imagem muda devido aos diferentes tempos de relaxação ao longo da amostra. Esses dados são então processados para obter uma imagem de amplitude a partir dessa imagem.

É evidente que a cianobactéria está localizada principalmente no lado direito do porta-amostras. As duas imagens são convertidas em valores de concentração de oxigênio por meio de uma curva de calibração pré-existente que relaciona a concentração de oxigênio ao tempo de relaxamento. Os resultados são apresentados para cianobactérias na presença e na ausência de luz.

É evidente que a produção de oxigênio é iniciada pela luz e provoca um aumento significativo na concentração de oxigênio na solução. Isso leva a uma diminuição do radical T dois, principalmente nos vóxeis próximos às fibras de papel absorvente contendo as cianobactérias. Acabamos de mostrar como preparar uma amostra contendo células vivas com radical livre estável para mapeamento da concentração de oxigênio por microscopia de R E S E. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de mantê-lo o mais curto possível para garantir a reprodutibilidade e evitar a degradação da amostra.

É isso aí. Obrigado por nos assistir e boa sorte com seu experimento.