Name: Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a mapear concentrações de oxigênio em células vivas usando microscopia de ressonância paramagnética eletrônica. Este método demonstrado em cianobactérias permite imagens tridimensionais em escala micrométrica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi parcialmente financiado por bolsa nenhuma. 213/09 do israelense Science Foundation, conceder nenhum. 2005258 desde a fundação BSF, não conceder. 201665 a partir do Conselho Europeu de Investigação (ERC), e pelo Instituto de Nanotecnologia Russell Berrie no Technion. Reconhecemos a ajuda do Prof Noam Adir e Salame Faris pela Faculdade Schulich de Química da Technion sobre o fornecimento e manuseio das cianobactérias. A ajuda eo apoio de Svetlana Yoffis da Unidade de Fabricação Technion Micro-Nano é muito apreciada.

1. Visão geral do ESR Micro-imagem Primeiro, nós fornecemos uma breve explicação do ESR, microscopia ESR, e os vários componentes do nosso sistema, e em seguida iremos descrever as experiências de imagem real. Ressonância paramagnética eletrônica é uma técnica espectroscópica em que a radiação eletromagnética em uma freqüência específica é absorvida pelas moléculas com spins elétron desemparelhado, colocada sob um campo magnético externo estático (Figura 1). ESR é empregada em grandes áreas da ciência, como química, biologia, física e ciência dos materiais, para a detecção e identificação de radicais livres e centros paramagnéticos. É um poderoso método para estudar o ambiente de moléculas paramagnéticas em espécies vivas e fornece informações sobre a acidez (pH), viscosidade, oxigênio e espécies reativas de oxigênio concentrações 3. Para amostras heterogêneas, ESR informação espectral pode ser obtido de uma forma espacialmente resolvidos (ie, através da obtenção de uma imagem), através do uso de gradientes de campo magnético 4. Isto é muito semelhante ao método mais comum de ressonância magnética (MRI), que gira principalmente observa próton. Até agora, as técnicas de imagem, ESR foram aplicados para espécimes vivos com tamanho relativamente grande de alguns centímetros e milímetros escala resolução. (Por exemplo, veja a Figura 2, retirados de referência 5.) Desenvolvimento relativamente recente no ESR imagem é a extensão de sua capacidade de olhar para pequenos animais em milímetros escala resolução para as medições de amostras milímetros e sub-milímetro de tamanho com escala mícron resolução. Este campo é conhecida como microscopia de ESR, que hoje pode fornecer imagens 3D ESR com uma resolução de 1 mícron aproximando 2 (ver exemplos representativos na Figura 3). ESR de um microscópio é essencialmente similar a um espectrômetro de ESR convencionais. Ele tem um ímã para a geração do campo estático, um sistema de microondas para a excitação de spin e detecção do sinal, uma sonda para a realização da amostra, e um console informatizado para controlar o processo de aquisição e manipulação de dados. Outros componentes de imagem a única ESR em geral e existentes também em microscopia ESR são fontes de campo magnético de gradiente, que são parte do sistema eletrônico, e bobinas de gradiente que estão localizados na sonda de imagem. Mais detalhes sobre o nosso sistema específico são mostrados no filme de protocolo e descrito na referência 2. 2. ESR Preparação da Amostra Micro-imagem Esta etapa descreve o método para preparação de amostras para o experimento ESR micro-imagem. No final desta fase as células são colocadas no fundo de um recipiente de vidro ESR especialmente preparado amostra microscopia juntamente com uma solução tampão por tritila radical 6. Este protocolo descreve a medição de células de cianobactérias e, portanto, para outros tipos de células, ajustes adequados podem ser necessários na fase de preparação da amostra. <ol><li> Primeiro, alguns quadrados de papel absorvente com um tamanho de 400 ~ 400 m são tomadas e inserido em um tubo Eppendorf, que é posteriormente preenchida com 1,2 mL da suspensão cianobactérias (a uma concentração de 40 mg / mL). </li><li> A suspensão é centrifugada por 2 minutos a 6000 RPM em microcentrífuga. </li><li> Depois disso, o buffer sobrenadante é completamente removido, exceto para ~ 50 mL que são deixados para evitar a desidratação cianobactérias. Como resultado deste processo, o papel absorvente agora saturados pelas células de cianobactérias. </li><li> Usando uma pinça fina, algumas fibras são extraídas do papel e colocados no fundo de um suporte de copo-como amostra preparada especialmente de vidro 7. Seguinte ao de 3 mm de tritila em BG-11 solução de 8, 9 (ver Esquema 1) é adicionado ao porta-amostras com a ajuda de uma seringa bem. O titular é então selada com cola curável UV, deixando uma pequena saída de ar aberto. <table border="1"><tbody><tr><td> Stock 4 </td><td> Stock 3 </td><td> Stock 2 </td><td> Stock 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 EDTA Mg 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> 0.6g/liter citrato férrico de amônio </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Ácido cítrico: 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Esquema 1. Preparação de BG-11 médio. </li></ol> 3. ESR Micro-imagem Experimentos <ol><li> Para começar o experimento de imagem, ligar o sistema ESR micro-imagem e inserir a amostra no ressonador que vai dentro da sonda de imagem. </li><li> Agora, usando o software de controle de computador, defina o sistema em "Tune" e encontrar o modo de freqüência de microondas de ressonância da sonda, que será usado para as medições ESR. </li><li> Em seguida, defina o campo magnético estático sobre o valor que corresponda à freqüência de microondas aplicada, definir os parâmetros de tempo para a seqüência de pulso e observar o sinal de ESR para se certificar de que o sistema funcione bem e que a amostra é bem preparado. </li><li> Em seguida, defina os parâmetros de imagem, tais como o número de pixels, a força do gradiente, bem como a duração dos pulsos de gradiente para seus valores necessários. </li><li> Após a instalação, coletar três imagens 3D ESR por uma imagem echo Hahn seqüência de pulsos (Figura 4) com interpulso separação, valores de  500, 600 e 700 ns. </li><li> Luz projetada na amostra é ligado ou desligado, dependendo das condições necessárias experimental. </li><li> Durante a aquisição, os dados são salvos automaticamente. Teses arquivos de dados brutos são então processadas via Matlab script de software para fornecer imagens da concentração por tritila radical eo tempo de relaxamento T mapa 2, que é traduzido em uma imagem concentração de oxigênio através de pré-existentes de calibração. </li></ol> 4. Resultados representante Os resultados do experimento são várias tridimensional ESR micro-imagens gravadas em diferentes valores de τ. Típico imagens brutas dados são fornecidos na Figura 5. As três principais imagens, medido em condições escuro, são muito semelhantes, exceto para a redução da intensidade do sinal. Por outro lado, a imagem muda padrão sob irradiação de luz devido aos tempos de relaxação diferentes em diferentes partes da amostra. Estes dados podem ser processados ​​1 para obter uma imagem amplitude, como mostrado na Figura 6 e também imagens do tempo de relaxação, T 2 (Figura 7). A T 2 imagens são traduzidas em valores de concentração de oxigênio através de uma curva de calibração pré-existente que liga a concentração de oxigênio para o tempo de relaxamento através da equação: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Equação 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 1"> Aqui, T 2 0 é o tempo de relaxação spin-spin da sonda sob condições anóxicas (dependendo da concentração da sonda, C, e seu coeficiente de difusão, D), e k é uma constante de proporcionalidade. Na maioria dos casos, o coeficiente de difusão não varia muito para amostras ao vivo (embora, se necessário, ele pode, em princípio, ser diretamente avaliada também por ESR 6, 10), ea concentração de spin é obtida durante o processo de imagem. Portanto, essa relação pode ser utilizada para medir diretamente a concentração de oxigênio. Voltando à Figura 6, é evidente a partir da imagem amplitude que as células de cianobactérias foram localizados principalmente no lado direito do titular da amostra. Além disso, com base na Figura 7, é claro que a luz inicia a produção de O 2 e provoca um aumento significativo da concentração da solução 2 O, principalmente nos voxels perto do cianobactérias. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Níveis de energia em elétrons de ressonância spin. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: imagem de concentração típica de oxigênio de um rato do rolamento do tumor. A imagem da esquerda mostra as informações anatômicas, com base em uma imagem de ressonância magnética. Um estável livre radical orgânico foi injetado para o mouse e as suas características ESR fornecer a concentração de oxigênio em seu ambiente (direita). ESR baseado em resultados são sobrepostos a imagens anatômicas de ressonância magnética. Campo de visão é de 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Dois exemplos de alta resolução ES micro-escalaR imagens de amostra photolithographically gerados com N @ C 60 em pó (à esquerda) e cristais paramagnéticos LiPc (à direita) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Típica Hahn imagem seqüência de pulsos mostrando o microondas (MW) e gradiente, G x, y G e G z pulsos. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: Típica-prima de dados ESR micro-imagens: a, b e c são dados brutos da amostra cianobactéria sem iluminação de luz medido para τ = 500600700 ns, respectivamente. Itens d, e, e são os mesmos que a, b e c, mas com iluminação de luz. Intensidade é plotado em escala arbitrária (mas é consistente dentro de cada conjunto de três imagens escuras ou claras de dados brutos) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6: imagem de amplitude correspondente à concentração de radicais na solução (escala arbitrária). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7: T 2 imagens e os correspondentes [O 2] valores no escuro (à esquerda) e leve (à direita) condições.

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
<li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR%3A+when%2C+how+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR: when, how and why?</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li>
<li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEaton%2C+GR+%22EPR+imaging+and+in+vivo+EPR%22">EPR imaging and in vivo EPR</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li>
<li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE%5BTitle%5D)+AND+%22ESR.+J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li>
<li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+Assignments%2C+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo mostra como ESR micro-imagem pode ser aplicada para mapear a concentração de oxigênio próximo ao vivo pequenas amostras. A resolução espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 M é demonstrado, com quase micromolar sensibilidade concentração de oxigênio e sub-femtomole sensibilidade de oxigênio absoluto por voxel. O uso de ESR micro-imagem para o mapeamento de oxigênio perto células complementa as técnicas atualmente disponíveis com base em micro-eletrodos ou de fluorescência / fosforescência. Além disso, com a sonda paramagnética adequada, ela será prontamente aplicável para oxigênio intracelular micro-imagens, uma capacidade que outros métodos achar muito difícil de alcançar. Num futuro próximo pretendemos melhorar ainda mais esta metodologia para fornecer imagens de amostra ao vivo com uma resolução de alguns mícrons, fornecendo parâmetros de contraste, como a concentração de óxido de super, acidez (pH), coeficiente de difusão da sonda e, claro, a concentração de oxigênio. Estas capacidades são complementares à atual ótica metodologias baseadas tanto em termos de tipo de contraste e de amostras de características (por exemplo, não transparente amostras de espessura e, em alguns casos, as medidas contra intracelular extracelular).

<table><tbody><tr><td>Centrífuga </td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>Radicais triarilmetila (trifenilmetila) perdeuterados</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>Sintetizados em Novosibirsk utilizando o método descrito na referência &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Tampão BG-11</td><td></td><td></td><td>Para instruções de preparação, consulte o Esquema 1 e as referências 8, 9.</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>Curagem por ultravioleta</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63 ou NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

ressonância paramagnética eletrônica micro-imagem das espécies ao vivo para o mapeamento de oxigênio

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Este protocolo descreve uma ressonância paramagnética eletrônica (ESR) método de micro-imagem para mapeamento tridimensional de níveis de oxigênio no ambiente imediato de células vivas com escala mícron resolução 1. O oxigênio é uma das moléculas mais importantes no ciclo de vida. Ele serve como receptor de elétrons terminal da fosforilação oxidativa na mitocôndria e é usado na produção de espécies reativas de oxigênio. Medições de oxigênio são importantes para o estudo das funções mitocondrial e metabólicas, vias de sinalização, os efeitos de vários estímulos, permeabilidade da membrana e diferenciação doença. Consumo de oxigênio é, portanto, um marcador informativo do metabolismo celular, que é amplamente aplicável a vários sistemas biológicos a partir de mitocôndrias de células de organismos inteiros. Devido à sua importância, muitos métodos foram desenvolvidos para as medições de oxigênio em sistemas vivos. Tentativas atuais para fornecer imagens de alta resolução de oxigênio são baseados principalmente em fluorescência óptica e os métodos de fosforescência que não fornecem resultados satisfatórios como eles empregam sensores com alta foto-toxicidade e sensibilidade baixa de oxigênio. ESR, que mede o sinal das sondas paramagnéticas exógena na amostra, é conhecido para fornecer medições muito precisas da concentração de oxigênio. Em um caso típico, as medições ESR mapa LineShape ampliação da sonda e / ou tempo de relaxamento-encurtamento que estão ligados diretamente à concentração de oxigênio local. (O oxigênio é paramagnético, portanto, quando colidiu com a sonda paramagnética exógenos, que falta vezes o seu relaxamento.) Tradicionalmente, esses tipos de experimentos são realizados com baixa resolução, milímetro escala ESR para geração de imagens de pequenos animais. Aqui nós mostramos como ESR imagem também pode ser realizado na escala mícron para o exame de pequenas amostras de viver. ESR micro-imagem é uma metodologia relativamente nova que permite a aquisição de sinais espacialmente resolvido com uma resolução ESR se aproximando de 1 mícron em temperatura ambiente 2. O principal objectivo deste protocolo papel é mostrar como este novo método, juntamente com o recém-desenvolvidos de oxigênio-sensível sondas, pode ser aplicado para o mapeamento dos níveis de oxigênio em pequenas amostras de viver. A resolução espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 M é demonstrado, com quase micromolar sensibilidade concentração de oxigênio e sub-femtomole sensibilidade de oxigênio absoluto por voxel. O uso de ESR micro-imagem para o mapeamento de oxigênio perto células complementa as técnicas atualmente disponíveis com base em micro-eletrodos ou de fluorescência / fosforescência. Além disso, com a sonda paramagnética adequada, mas também irá ser facilmente aplicável para oxigênio intracelular micro-imagens, uma capacidade que outros métodos achar muito difícil de alcançar.

Este protocolo descreve um método para escala mícron imagem tridimensional da concentração de oxigênio no ambiente imediato de células vivas por microscopia eletrônica de spin ressonância.

Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

Este protocolo descreve um método de microimageamento por ressonância spin-eletrônica (ESR) para o mapeamento tridimensional dos níveis de oxigênio no ambiente imediato...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens tridimensionais em escala micrométrica da concentração de oxigênio no ambiente imediato de células vivas por meio da microscopia de ressonância de spin eletrônico ou ESR. O protocolo será demonstrado em cianobactérias, que são células fotossintéticas comuns. Isso é alcançado primeiramente preparando uma amostra de células de cianobactérias dentro do porta-amostras da microscopia ESR.Incorporado em uma solução estável de radical orgânico. O porta-amostras é colocado dentro da sonda de imagem, que é inserida no eletroímã estático do sistema de microscopia de RPE. Agora, várias imagens microscópicas tridimensionais de RPE da solução de radical orgânico são adquiridas pelo microscópio de RPE.Isso é realizado para várias variantes de sequências de pulsos e frequentemente sob diversas condições externas, como em condições de luz e escuridão. Em seguida, as imagens de dados brutos são processadas pelo computador para extrair os tempos de relaxação tridimensionais com resolução espacial do radical. Esses tempos de relaxação fornecem uma medida direta da concentração de oxigênio por meio de calibração pré-existente, levando a mapas tridimensionais completos de oxigênio das amostras medidas sob diversas condições externas.Obtêm-se resultados que demonstram claramente a ausência de produção de oxigênio pelas cianobactérias quando nenhuma luz é aplicada. Além disso, mostra-se que sob irradiação luminosa, são criados gradientes significativos de oxigênio e heterogeneidade de oxigênio próximos às células de cianobactérias. Olá, sou Al do laboratório de BLA na Faculdade S de Química do Technion, o Instituto Israelense de Tecnologia em Haifa.Hoje vamos mostrar um procedimento para mapear concentrações de oxigênio próximas a células vivas de maneira tridimensional com alta resolução espacial por meio da microscopia de ponta de prova. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a taxa de consumo de oxigênio e a atividade metabólica de células. Então, vamos começar.A ressonância de spin eletrônico ou RSE é uma técnica espectroscópica na qual radiação eletromagnética em uma frequência específica é absorvida por espécies paramagnéticas que possuem spin de elétron desemparelhado, colocadas sob um campo magnético estático externo. É um método poderoso para estudar o ambiente de moléculas paramagnéticas em espécies vivas, incluindo as concentrações de oxigênio e espécies reativas de oxigênio. Aqui é mostrada uma imagem típica da concentração de oxigênio em um camundongo com tumor, para amostras heterogêneas.As informações espectrais de RPE podem ser obtidas de maneira espacialmente resolvida por meio do uso de gradientes de campo magnético. Um radical orgânico estável e livre foi injetado no camundongo e suas características de RPE fornecem a concentração de oxigênio no seu entorno. Os resultados baseados em RPE são sobrepostos a uma imagem anatômica de RMI.Até o momento, tais técnicas de imagem por RPE de espécimes vivos foram realizadas apenas com amostras relativamente grandes em escala de milímetro. A microscopia de RPE envolve a medição de amostras com tamanho de milímetro e submilímetro, fornecendo imagens tridimensionais de RPE com uma resolução próxima a um mícron.Aqui estão dois exemplos de imagens de RPE em escala micrométrica com alta resolução, de amostras geradas com pó NNC 60 e cristais paramagnéticos de cianeto férrico de lítio. Um microscópio de RPE é semelhante a um espectrômetro convencional de RPE, possuindo um ímã para gerar o campo estático, um sistema de micro-ondas para excitação de spins e detecção de sinal, uma sonda para segurar a amostra e um console informatizado para controlar o processo de aquisição e o tratamento de dados. Outros componentes do sistema incluem drivers de gradiente de campo magnético, que fazem parte do sistema eletrônico, e bobinas de gradiente localizadas na sonda de imagem.As bobinas de gradiente também possuem uma abertura para permitir a irradiação luminosa da amostra. Um ar úmido controlado em temperatura é aplicado à amostra para garantir desidratação mínima durante o experimento. As principais características únicas da microscopia de RSE são o tamanho reduzido da sonda e das bobinas de gradiente, a maior sensibilidade ao spin do sistema e a alta intensidade dos drivers de gradiente de campo magnético. Antes do início deste procedimento, prepare uma suspensão de cianobactérias numa concentração de 40 miligramas por mililitro.Para iniciar o preparo da amostra para microimagem por RPE, pegue alguns quadrados de papel absorvente com tamanho aproximado de 400 por 400 mícrons usando pinças finas. Em seguida, insira-os em um tubo einor. Posteriormente, encha o tubo com 1,2 mililitros da suspensão de cianobactérias.Em seguida, centrifugue a suspensão por dois minutos a 6.000 RPM em uma microcentrífuga; após a centrifugação, remova completamente o sobrenadante, exceto por aproximadamente 50 microlitros, que devem ser mantidos para evitar a desidratação das cianobactérias. Esse processo resulta na saturação do papel absorvente com as células de cianobactérias. A seguir, prepare um suporte para amostras de vidro especialmente preparado, retire algumas fibras do papel usando pinças finas e coloque-as no fundo do suporte para amostras.Em seguida, adicione três milimolares de tridel e solução BG 11, que é preparada conforme descrito no protocolo escrito, utilizando um oitavo de uma seringa. Então, feche o porta-amostras com cola curável por UV, aplicando a cola entre as bordas do porta-amostras de vidro e sua tampa de lamínula correspondente, deixando uma pequena saída de ar aberta. Por fim, cure a cola com luz UV por dois segundos.Para iniciar o experimento de imageamento, ligue o sistema de microimageamento por RPE e insira a amostra no ressonador que fica dentro da sonda de imageamento. Em seguida, utilizando o software de controle do computador, configure o sistema no modo de ajuste e localize a frequência de micro-ondas de ressonância da sonda, que será utilizada para as medições de RPE. Após isso, ajuste o campo magnético estático ao valor que corresponde à frequência de micro-ondas aplicada.Defina os parâmetros de temporização para a sequência de pulsos e observe o sinal de RPE para garantir que o sistema funcione corretamente e que a amostra esteja bem preparada. Em seguida, defina os parâmetros de imageamento, como o número de pixels, a intensidade dos gradientes e a duração dos pulsos de gradiente, para os valores exigidos. Após a configuração, adquira três imagens tridimensionais de RPE por meio de uma sequência de pulsos de imageamento por eco de Han, com valores de separação interpulsos tau de 500, 600 e 700 nanossegundos.Neste momento, ligue a projeção de luz na amostra, se necessário para as condições experimentais durante toda a aquisição, pois os dados são automaticamente salvos. Após o processo de aquisição de dados, os arquivos de dados brutos são processados por meio de um script do software MATLAB. Utilizando o software, gere imagens da concentração do radical tril e do tempo de relaxação.T dois é usado para mapear e então traduzir essas imagens em uma imagem de concentração de oxigênio por meio de uma curva de calibração preexistente que relaciona a concentração de oxigênio ao tempo de relaxação. Aqui, T dois zero é o tempo de relaxação spin-spin do sensor sob condições anóxicas, dependendo da concentração C do sensor e de seu coeficiente de difusão D. São apresentadas imagens típicas de dados brutos provenientes de diversos experimentos tridimensionais de imageamento por RPE realizados em cianobactérias. Essas imagens foram adquiridas com diferentes valores de tau sob condições de escuridão ou luz.Em condições de escuridão, os resultados são muito semelhantes, exceto pela diminuição da intensidade para os valores maiores de T devido ao tempo de relaxação spin-spin, T dois. Inversamente, sob irradiação luminosa, o padrão da imagem muda devido aos diferentes tempos de relaxação ao longo da amostra. Esses dados são então processados para obter uma imagem de amplitude a partir dessa imagem.É evidente que a cianobactéria está localizada principalmente no lado direito do porta-amostras. As duas imagens são convertidas em valores de concentração de oxigênio por meio de uma curva de calibração pré-existente que relaciona a concentração de oxigênio ao tempo de relaxamento. Os resultados são apresentados para cianobactérias na presença e na ausência de luz.É evidente que a produção de oxigênio é iniciada pela luz e provoca um aumento significativo na concentração de oxigênio na solução. Isso leva a uma diminuição do radical T dois, principalmente nos vóxeis próximos às fibras de papel absorvente contendo as cianobactérias. Acabamos de mostrar como preparar uma amostra contendo células vivas com radical livre estável para mapeamento da concentração de oxigênio por microscopia de R E S E. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de mantê-lo o mais curto possível para garantir a reprodutibilidade e evitar a degradação da amostra.É isso aí. Obrigado por nos assistir e boa sorte com seu experimento.

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Esta técnica permite o uso de alta resolução, ângulo mágico de prótons girando MR espectroscopia (HRMAS 1H-MRS) para a caracterização molecular de...

Espectroscopia de Ressonância Magnética de viver Drosophila melanogaster Usando Angle Spinning Magia

Electron paramagnético espectroscopia de ressonância (EPR) foi utilizado para detectar o óxido nítrico a partir de células endoteliais de aorta bovina e anião radical superóxido por neutrófilos humanos, utilizando ferro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe...

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Microscopia de lapso de tempo de marcadores autofagia fluorescente etiquetado permite o monitoramento da resposta autofagia dinâmico com alta resolução temporal. Usando autofagia organela específica e marcadores numa combinação de três cores diferentes, pode-se seguir a contribuição de uma proteína para a formação autophagosome num contexto espacial e temporal robusta.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Um novo método de ressonância paramagnética eletrônica (EPR), rápidas digitalização EPR (RS-EPR), é demonstrado para 2D imagens espaciais espectral, que é superior à técnica tradicional de onda contínua (CW) e abre novos espaços para imagiologia in vivo. Os resultados são demonstrados a 250 MHz, mas a técnica é aplicável em qualquer frequência.

Rápida digitalização ressonância paramagnética eletrônica abre novos caminhos para criação de imagens fisiologicamente parâmetros importantes<em&gt; In Vivo</em

Descrevemos o uso de uma nova câmera vitalícia de luminescência de domínio de frequência para mapear distribuições 2D O2 com folhas de sensor óptico. Os procedimentos de análise do sistema de câmera e de imagem são descritos juntamente com a preparação, calibração e aplicação de folhas de sensor para visualizar o microambiente O2 na rizosfera das plantas aquáticas.

Imagens vitalícias de Luminescence de O2 com um sistema de câmera baseado em domínio de frequência

O protocolo descreve a geração de spheróides de alto rendimento para bioimpressão usando a análise multi-paramétrica de sua oxigenação e morte celular em um microscópio padrão de fluorescência. Essa abordagem pode ser aplicada para controlar a viabilidade dos esferoides e realizar a padronização, o que é importante na modelagem do tecido 3D, microambiente tumoral e biofabricação (micro)tecido bem sucedida.

Biofabricção assistida por microscopia de oxigênio acessível de esferoides multicelulares

Este artigo descreve o uso de um novo imageador óptico rápido para a imagem macroscópica da vida útil da fotoluminescência de amostras emissoras de decaimento longo. Os procedimentos de integração, aquisição e análise das imagens são descritos, juntamente com a preparação e caracterização dos materiais sensores para a aquisição de imagens e a aplicação do imageador no estudo de amostras biológicas.

Fluorescence Lifetime Macro Imager para aplicações biomédicas

Apresentamos um protocolo para visualizar diretamente as atividades metabólicas em células reguladas por aminoácidos usando microscopia Raman estimulada de espalhamento Raman estimulado com óxido de deutério (água pesada D2O) (DO-SRS), que é integrada à microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons (2PEF).

Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos

Mapas quantitativos de oxigênio 3D de tumores murinos foram fotografados de forma não invasiva usando ressonância paramagnética eletrônica de pulso. Ultrassom modo B e Power Doppler foram usados para anatomia e estrutura vascular. As imagens de ambas as modalidades foram sobrepostas, permitindo a análise multiparamétrica do tumor.

Avaliação da hipóxia tumoral: imagens de oxigênio 3D in vivo por ressonância paramagnética eletrônica 

Utilizando uma plataforma multimodal que combina modalidades de imagem óptica sem rótulo, desenvolvemos um protocolo para visualizar e quantificar a dinâmica e o metabolismo celular. Por meio de imagens via fluorescência multifotônica, geração de segundo harmônico e microscopia de espalhamento Raman estimulada, podemos gerar uma visão holística do ambiente celular e molecular.

Plataforma de imagem óptica multimodal para estudar o metabolismo celular

Introduzimos uma técnica inovadora de imagem chamada Tomografia de Interferência Óptica Multicamada (OMLIT), que permite a imagem não enviesada de todas as células em amostras cerebrais na mesoescala e pode ser integrada perfeitamente ao fluxo de trabalho de imagem da microscopia eletrônica serial de varredura baseada em fita na mesma amostra.

Um Método de Imagem Óptica Compatível com Microscopia Eletrônica de Varredura para Mapeamento Cerebral Mesoscópico de Todas as Células

Aprenda a mapear concentrações de oxigênio em células vivas usando microscopia de ressonância paramagnética eletrônica. Este método demonstrado em cianobactérias permite imagens tridimensionais em escala micrométrica.

Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

Explorar mais vídeos