Gramicidina baseado em Ensaio de fluorescência; para determinar Moléculas Pequenas Potencial para Modificação de Propriedades bicamada lipídica

O objetivo geral deste procedimento é medir as mudanças induzidas por drogas nas propriedades da bicamada, conforme detectado por proteínas que abrangem a bicamada. Isso é feito primeiro fazendo grandes sles unilaterais carregados de flúor. O segundo passo do procedimento é dopar as vesículas com gramina.

A terceira etapa do procedimento é adicionar um atenuador externo e medir a taxa de extinção do flúor interno. Quatro. A etapa final do procedimento é quantificar a mudança na atividade de extinção de flúor por gramina, ajustando uma função exponencial esticada ao curso do tempo de fluorescência. Em última análise, os resultados podem ser obtidos para avaliar se os arquivos amfi podem alterar as propriedades da bicamada lipídica.

Olá, sou Ola Anderson. Olá, eu sou Helson. Olá, sou Richie Kapo.

E eu sou Leah Sanford do laboratório do Dr. Olaf Anderson no Departamento de Fisiologia e Biofísica do Weill Cornell Medical College. Hoje mostraremos um procedimento para medir as mudanças nas propriedades da biocamada lipídica. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar os efeitos de drogas e pequenas moléculas nas propriedades biliares lipídicas.

Então vamos começar No primeiro dia deste procedimento, retire o lipídio do freezer e deixe-o equilibrar à temperatura ambiente. Uma vez equilibrado, adicionar 0,6 mililitros de 25 miligramas por mililitro, solução lipídica e clorofórmio a um balão de fundo redondo de 25 mililitros. Em seguida, secar a solução em nitrogênio gasoso, girando continuamente o balão até que todo o clorofórmio tenha evaporado.

E uma fina película branca de lipídios reveste toda a metade inferior do frasco, seca ainda mais o lipídio em um desidratado sob vácuo durante a noite. Preparar uma solução de nitrato de sódio a 100 milimolares de pH sete. Ao ajustar o pH desta solução, evite qualquer solução que contenha cloreto.

Como o Quencher de tálio forma um complexo insolúvel com o cloreto no segundo dia, reidratar os lipídios em 1,67. Um mililitros desta solução eletrolítica para obter uma suspensão lipídica de 10 milimolares. Uma vez atingida a concentração correta, cobrir com filme e vortex a suspensão, proteger completamente a amostra da luz com papel alumínio e deixá-la envelhecer à temperatura ambiente durante a noite.

No terceiro dia, sonice a mistura por um minuto em sonicado de baixa potência. Em seguida, congele e descongele a amostra com cinco minutos em gelo seco, seguido de cinco minutos em água morna, repita o ciclo de congelamento e descongelamento quatro a cinco vezes. Faça a extrusão da suspensão lipídica usando uma mini extrusora Avanti.

Configure a mini extrusora com um filtro de policarbonato de 0,1 mícron e os suportes do filtro extrudam a suspensão para frente e para trás 21 vezes, de modo que uma suspensão quase translúcida acabe na seringa oposta, resultando em uma grande vesícula ular ou suspensão LUV. Remova o A NTS externo executando a suspensão extrudada sobre uma coluna dulante PD 10 que foi equilibrada com tampão de sódio. Adicione 1,5 mililitros da suspensão LUV mais um mililitro de tampão de sódio à coluna.

Depois que a solução estiver totalmente incorporada à coluna, eluir os lipossomas com três mililitros de tampão de sódio e coletar o eluato. A solução estoque de LUV preenchida com A NTS resultante deve conter cerca de quatro a cinco lipídios milimolares e parecer translúcida. Branco leitoso.

Proteja a solução da luz com papel alumínio e armazene a 13 graus Celsius 24 horas antes de usar completamente o vórtice. A solução estoque LUV preenchida com A NTS. Como os UUVs têm uma densidade superior a um grama por mililitro e / ou sedimento.

Em seguida, diluir a solução-mãe de LUV cheia de A NTS. Um a 20 com tampão de sódio incubam três quartos dos lipossomas com 260 nanogramas de abidina em DMSO. Adicione o mesmo volume de DMSO sem grama ao quarto restante.

Para manter a concentração de solvente constante em todas as amostras, deixe a gramina se equilibrar entre as monocamadas interna e externa das vesículas lipídicas por 24 horas a 13 graus Celsius. Aqui, um espectrofluorímetro de espectro de fluxos interrompidos SX ponto 20 de fotofísica aplicada com controle de temperatura é usado para medir a taxa de extinção de fluorescência. Para começar, ligue os instrumentos com uma hora de antecedência para permitir o aquecimento do instrumento.

A fenda com relatores para excitação deve ser uma barra e um filtro passa-alto de 4 55 nanômetros deve ser usado para registrar a emissão usando o software pro data SX. Configure as condições de gravação primeiro, defina os comprimentos de onda de excitação do monocromador para 3 52 nanômetros. Use a configuração de retenção de pressão.

Defina o tempo para um segundo e aponte para 5.000. Ajuste o número de repetições para nove para execuções de buffer e para 13 para execuções de redução. Monitore a temperatura no software Essex verifique o perfil da unidade.

O volume do inversor deve ser ajustado para 120 microlitros, que mistura 60 microlitros de cada seringa. Isso dá um tempo morto de aproximadamente 1,2 milissegundos. Ajuste a alta tensão ou ganho no detector de fluorescência para cerca de 420 volts.

O objetivo é obter uma leitura de fluorescência de cerca de oito equilibrando os UUVs carregados com A NTS previamente preparados por 10 minutos a 25 graus Celsius no escuro. Uma vez equilibrada o vórtice da amostra, em seguida, carregue-a na seringa esquerda. Na carga da seringa direita, tampão de sódio ou tálio. Quencher.

Remova quaisquer bolhas de ar empurrando as seringas para frente e para trás. Ambas as seringas devem ser carregadas igualmente. Antes de fechar as válvulas para a primeira amostra, registre a fluorescência com tampão de sódio.

Repita quatro vezes e ajuste o ganho conforme necessário. Em seguida, repita mais cinco vezes para as amostras restantes. Registre nove repetições com tampão de sódio.

Substitua o tampão de sódio pelo extintor de tálio e registre 13 repetições. Enxágue com água e continue com os próximos controles de amostra. Incluir amostras sem gramina e com solvente, sem gramina e com a concentração máxima do composto.

E com gramina e solvente após o ensaio de fluorescência, leia os dados no software MATLAB para análise. Para cada amostra lida em todas as repetições de buffer e extintor, as primeiras quatro repetições serão contaminadas pelo que estava anteriormente na tubulação. Nesse caso, o sinal vem da amostra tampão de sódio misturada com água da lavagem anterior.

As repetições de cinco a nove representam o sinal apenas da amostra. Portanto, sempre excluímos as quatro primeiras repetições em cada caso. Para evitar artefatos de mistura, percorra manualmente os rastreamentos e remova quaisquer repetições incorretas, como o traço vermelho contendo picos ou desvios devido à mistura de artefatos e/ou bolhas.

Em seguida, normalize as repetições de têmpera para o valor inicial médio das repetições de buffer para cada amostra para cada condição experimental, combine as médias de todas as amostras em um gráfico de visualização de amostras sem gramina devem ser todas semelhantes e mostrar quase nenhuma extinção de fluorescência. Há uma redução lenta no sinal fluorescente devido à lentidão por causa do íon tálio nas vesículas para amostras com gram sidin. Se o curso do tempo fluorescente for visivelmente alterado pelo composto, o composto altera as propriedades da bicamada lipídica na concentração testada em seguida ajusta um exponencial esticado para os primeiros dois a 100 milissegundos das curvas de extinção de fluorescência normalizadas.

Para o indivíduo, repita e calcule a taxa em dois milissegundos. Em seguida, calcule as médias e desvios padrão para uma determinada amostra do indivíduo Repete o efeito da capsaicina denotada aqui como cap foi observado no curso do tempo de extinção fluorescente na ausência ou presença de gramina denotada como ga, o sinal fluorescente normalizado é mostrado ao longo de um segundo aqui. Os pontos cinzas representam os resultados de todas as repetições, enquanto as linhas vermelhas são as médias.

Os primeiros 100 milissegundos do sinal fluorescente normalizado são mostrados. Os pontos cinzas são resultados de uma única repetição para cada condição. As linhas vermelhas são ajustadas exponenciais esticadas para essas repetições.

A linha azul sufocada denota a marca de dois milissegundos. O momento em que a taxa de extinção é determinada. A mudança relativa na taxa de extinção é determinada normalizando os dados para a amostra de controle com gramin e nenhum modificador.

Quando a capsaicina é absorvida pela bicamada lipídica, ela altera as propriedades da bicamada. A mudança para a bicamada mais macia será refletida como uma mudança no lado de grama no equilíbrio do dímero mono em favor do dímero condutor. Acabamos de mostrar um procedimento para medir os efeitos perturbadores da bicamada de uma pequena molécula.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de usar os controles adequados para cada experimento usando o mesmo lote de vesículas. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.