Gramicidina baseado em Ensaio de fluorescência; para determinar Moléculas Pequenas Potencial para Modificação de Propriedades bicamada lipídica

O objetivo geral deste procedimento é medir alterações induzidas por fármacos nas propriedades da bicamada lipídica conforme detectadas por proteínas que atravessam a bicamada. Isso é realizado primeiramente produzindo vesículas unilaminares grandes carregadas com Fluor. O segundo passo do procedimento consiste em dopar as vesículas com gramin.

O terceiro passo do procedimento é adicionar um quenchador externo e medir a taxa de quenching do fluoro interno. Quatro. O passo final do procedimento é quantificar a alteração no quenching de fluor por atividade gramin ajustando uma função exponencial esticada ao curso temporal da fluorescência. Em última análise, os resultados podem ser obtidos para avaliar se os arquivos amfi podem alterar as propriedades da bicamada lipídica.

Olá, eu sou Ola Anderson. Olá, eu sou Helson. Olá, eu sou Richie Kapo.

E eu sou Leah Sanford do laboratório do Dr. Olaf Anderson do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Weill Cornell Medical College. Hoje vamos mostrar um procedimento para medir alterações nas propriedades da bicamada lipídica. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os efeitos de fármacos e moléculas pequenas sobre as propriedades da bicamada lipídica.

Então, vamos começar. No primeiro dia deste procedimento, retire o lipídio do congelador e deixe equilibrar à temperatura ambiente. Após a equilibração, adicione 0,6 mililitros de uma solução de lipídio em clorofórmio a 25 miligramas por mililitro a um frasco redondo de 25 mililitros. Em seguida, seque a solução sob gás nitrogênio, girando continuamente o frasco, até que todo o clorofórmio tenha evaporado.

E um filme branco fino de lipídio reveste toda a metade inferior do frasco; seque o lipídio adicionalmente em um dessecador sob vácuo durante a noite. Prepare uma solução de 100 milimolar de nitrato de sódio, 25 milimolar de A NTS e 10 milimolar de HEPES com pH 7. Ao ajustar o pH desta solução, evite qualquer solução contendo cloreto.

Como o quenching de tálio forma um complexo insolúvel com o cloreto no segundo dia, reidrate os lipídios em 1,67 mililitros dessa solução eletrolítica para obter uma suspensão de lipídios a 10 milimolar. Uma vez atingida a concentração correta, cubra com filme aderente e vortexe a suspensão completamente, protegendo a amostra da luz com papel alumínio e deixe envelhecer à temperatura ambiente durante a noite.

No terceiro dia, sonique a mistura por um minuto em um sonicador de baixa potência. Em seguida, congele e descongele a amostra com cinco minutos em gelo seco, seguidos por cinco minutos em água morna; repita o ciclo de congelamento e descongelamento quatro a cinco vezes. Extruda a suspensão lipídica utilizando um extrusor mini Avanti.

Monte o extrusor mini com um filtro de policarbonato de 0,1 mícron e suportes de filtro, e extruda a suspensão de um lado para o outro 21 vezes, de modo que uma suspensão quase translúcida acabe no êmbolo oposto, resultando em uma suspensão de vesículas grandes unilamelares ou LUV. Remova os A NTS externos passando a suspensão extrudada por uma coluna de troca dialítica PD 10 que tenha sido equilibrada com tampão de sódio. Adicione 1,5 mililitros da suspensão de LUV mais um mililitro de tampão de sódio à coluna.

Após a solução ser completamente incorporada à coluna, elua os lipossomos com três mililitros de tampão de sódio e colete o eluato. A solução estoque resultante de LUV preenchida com A NTS deve conter cerca de quatro a cinco milimolares de lipídio e apresentar-se translúcida. Branca leitosa.

Proteja a solução da luz com papel alumínio e armazene a 13 graus Celsius por 24 horas antes do uso, agitando vigorosamente em vórtex. A solução estoque de LUV preenchida com A NTS. Como os UUVs têm densidade maior que um grama por mililitro e ou sedimentam.

Em seguida, dilua a solução estoque de LUV preenchida com A NTS na proporção de 1 para 20 com tampão de sódio. Incube três quartos dos lipossomos com 260 nanogramas de abidin em DMSO. Adicione o mesmo volume de DMSO sem gramin ao quarto restante.

Para manter a concentração do solvente constante em todas as amostras, permita que o gramin equilibre entre as monocamadas interna e externa das vesículas lipídicas por 24 horas a 13 graus Celsius. Aqui, utiliza-se um espectrofluorímetro de fluxo interrompido Photophysics SX Point 20 com controle de temperatura para medir a taxa de extinção da fluorescência. Para começar, ligue os instrumentos uma hora antes para permitir o aquecimento dos mesmos.

A fenda com espectrômetros para excitação deve ser de um para um e um filtro passa-alta de 455 nanômetros deve ser usado para registrar a emissão utilizando o software Pro Data SX. Primeiro, configure as condições de gravação, ajustando os comprimentos de onda de excitação do monocromador para 352 nanômetros. Utilize a configuração de retenção de pressão.

Defina o tempo para um segundo e os pontos para 5.000. Ajuste o número de repetições para nove nas corridas de tampão e para 13 nas corridas de quenching. Monitore a temperatura no perfil de unidade do software Essex.

O volume de impulso deve ser ajustado para 120 microlitros, o que mistura 60 microlitros de cada seringa. Isso resulta em um tempo morto de aproximadamente 1,2 milissegundos. Ajuste a alta tensão ou o ganho no detector de fluorescência para cerca de 420 volts.

O objetivo é obter uma leitura de fluorescência de cerca de oito equilibrar as UUVs carregadas com A NTS previamente preparadas por 10 minutos a 25 graus Celsius no escuro. Após o equilíbrio, vortexar a amostra e, em seguida, carregá-la na seringa esquerda. Na seringa direita, carregar tampão de sódio ou tálio. Quencher.

Remova todas as bolhas de ar movendo as seringas para frente e para trás. Ambas as seringas devem ser carregadas igualmente. Antes de fechar as válvulas para a primeira amostra, registre a fluorescência com o tampão de sódio.

Repita quatro vezes e ajuste o ganho conforme necessário. Em seguida, repita mais cinco vezes para as amostras restantes. Registre nove repetições com tampão de sódio.

Substitua o tampão de sódio pelo quenching de tálio e registre 13 repetições. Lave com água e prossiga com os controles da próxima amostra. Inclua amostras sem gramin e com solvente, sem gramin e com a concentração máxima do composto.

E com ambos gramin e solvente seguindo o ensaio de fluorescência, leia os dados no software MATLAB para análise. Para cada amostra, leia todas as repetições com tampão e com agente quenching; as primeiras quatro repetições estarão contaminadas pelo que estava anteriormente no tubo. Neste caso, o sinal provém da mistura da amostra de tampão de sódio com água da lavagem anterior.

As repetições de cinco a nove representam o sinal proveniente apenas da amostra. Portanto, sempre excluímos as quatro primeiras repetições em cada caso. Para evitar quaisquer artefatos de mistura, percorra manualmente os traços e remova quaisquer repetições ruins, como o traço vermelho que contém picos ou desvios devido a artefatos de mistura e/ou bolhas.

Em seguida, normalize as repetições do quenching ao valor inicial médio das repetições do tampão para cada amostra em cada condição experimental, combine as médias de todas as amostras em um único gráfico; amostras de visualização sem gramina devem ser semelhantes e mostrar quase nenhuma quenching de fluorescência. Há uma redução lenta no sinal fluorescente devido à entrada lenta do íon tálio nas vesículas para amostras com gram sidina. Se o curso temporal da fluorescência for visivelmente alterado pelo composto, então o composto altera as propriedades da bicamada lipídica na concentração testada; a seguir, ajuste uma exponencial esticada aos primeiros dois a 100 milissegundos das curvas normalizadas de quenching de fluorescência.

Para as repetições individuais, calcule a taxa em dois milissegundos. Em seguida, calcule as médias e os desvios padrão para uma amostra específica a partir das repetições individuais. O efeito da capsaicina, denotado aqui como cap, foi observado no curso temporal do quenching fluorescente na ausência ou presença de gramin, denotado como ga; o sinal fluorescente normalizado é mostrado ao longo de um segundo aqui. Pontos cinzas representam os resultados de todas as repetições, enquanto as linhas vermelhas correspondem às médias.

Os primeiros 100 milissegundos do sinal fluorescente normalizado são mostrados. Os pontos cinza são resultados de uma única repetição para cada condição. As linhas vermelhas são ajustes exponenciais esticados para essas repetições.

A linha azul tracejada indica a marca de dois milissegundos. O momento em que a taxa de extinção é determinada. A alteração relativa na taxa de extinção é determinada normalizando os dados com a amostra controle contendo gramin e sem modificador.

Quando a capsaicina se absorve à bicamada lipídica, ela altera as propriedades da bicamada. A mudança em direção a uma bicamada mais macia será refletida como um deslocamento no lado gram do equilíbrio entre monômero e dímero, favorecendo o dímero condutor. Acabamos de mostrar um procedimento para medir os efeitos perturbadores de uma molécula pequena na bicamada.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de usar os controles adequados para cada experimento, utilizando o mesmo lote de vesículas. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.