Reação em cadeia da polimerase da microesfera para amplificar o DNA de fita simples

A microesfera-PCR usa uma esfera de tamanho micro acoplada a oligonucleotídeos em sua superfície, o que permite a amplificação preferencial do DNA de fita simples.

Para iniciar a microesfera-PCR, pegue uma mistura de reação contendo fitas de DNA de fita simples molde, primers diretos com uma etiqueta de nucleotídeo adicional, DNA polimerase termoestável, dNTPs e microesferas exibindo sondas de oligonucleotídeos de fita simples.

Coloque o tubo em um termociclador e funcione nas condições definidas.

No primeiro ciclo, na temperatura de recozimento, o DNA molde se liga à sonda na superfície da microesfera, de modo que o DNA molde funcione como a fita sensorial. Durante a extensão, a polimerase estende o DNA e o duplex permanece ligado à microesfera.

No ciclo seguinte, durante a desnaturação, o DNA molde se separa da microesfera, deixando a fita da sonda ligada à superfície - servindo como modelo para uma nova fita.

Durante o recozimento, o primer marcado se liga à fita antisense. Mais tarde, a polimerase o estende para sintetizar a fita sensorial com a etiqueta de nucleotídeos.

Repita o ciclo várias vezes para gerar várias cópias do DNA de fita simples sensorial, que vão para a solução, enquanto os contaminantes de fita dupla permanecem presos.

Transfira os produtos de PCR para um tubo contendo um tampão de carga. Carregue o produto e os marcadores em diferentes poços do gel e separe usando eletroforese em gel de agarose.

Os DNAs molde formam uma banda fraca de baixo peso molecular, enquanto uma banda intensa de alto peso molecular confirma a amplificação do DNA de fita simples.