Demonstrando um multi-resistente Mycobacterium tuberculosis Ampliação Microarray
25 de abril de 2014
Um microarray amplificação combina assimétrica PCR amplificação e hibridização microarray em uma única câmara, que simplifica significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final. Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de diagnósticos à base de microarray que podem ser rotineiramente usados em ambientes com recursos mais baixos.
O objetivo geral do experimento a seguir é genotipar a microbactéria tuberculose multirresistente, usando um microarray de amplificação. Isso é obtido realizando uma PCR assimétrica multiplex sobre o topo de um microarray dentro de uma única câmara de reação microfluídica. Lá, a amostra é simultaneamente amplificada, rotulada com tamanho selecionado, feita de fita simples e hibridizada com o microarray.
Em seguida, depois que o microarray é lavado, um leitor mostra se a microbactéria tuberculose está presente e se contém uma mutação de DNA conhecida por conferir resistência à rifampicina iso, niazi etambutol ou estreptomicina. A vantagem desse método sobre os métodos existentes de sonda de linha de microarray ou hibridização de ácido nucleico é que um microarray de amplificação simplifica significativamente a interação do usuário com o teste. Ainda assim, ao fornecer a sensibilidade analítica da PCR e a capacidade de multiplexação de um microarray Para este procedimento, tenha um espaço de trabalho limpo limpo com solução descontaminada e tenha ácidos nucléicos puros o suficiente para PCR multiplex.
Depois de descongelar e misturar todas as soluções de estoque, monte a mistura principal de PCR. Ao preparar esta mistura, faça pelo menos um volume extra de mistura para o teste de TB mostrado aqui. Além disso, adicione T polimerase extra à mistura principal.
Além da quantidade de aderência fornecida com os reagentes de estoque, misture alíquotas de um microlitro de DNA de amostra para 49 microlitros de master mix. Adicione cuidadosamente 48 microlitros de cada mistura de reação ao centro do microarray apropriado. Não toque no próprio microarray.
Em seguida, cubra e sele cuidadosamente o microarray incorretamente. A aplicação da lamínula pode introduzir bolhas que podem levar a artefatos, evaporação, amplificação deficiente ou hibridização não uniforme. Qualquer uma dessas condições pode levar a um resultado errôneo.
Em seguida, carregue a micro taxa no termociclador. Com os substratos contra o bloco de calor, a opção de tampa aquecida deve estar desligada. Para laboratórios que seguem as precauções universais de PCR, é mais eficiente incluir vários microarrays de amplificação por lâmina e processar vários testes simultaneamente.
Agora, execute o programa de ciclagem térmica apropriado. Este programa tem 50 ciclos de amplificação, que podem parecer altos, mas necessários devido à população predominantemente de amplicon de fita simples criada pela reação. Quando a reação estiver completa, remova os microarrays e desligue o termociclador.
Abra cuidadosamente a câmara de microarray com plano e fórceps. Remova o deslizamento, a tampa e a junta. O microarray pode ser danificado por esta etapa, portanto, tenha cuidado incorretamente.
A remoção do conjunto da junta pode causar danos físicos ao microarray. Tenha cuidado para não dobrar ou flexionar a lamínula e tome muito cuidado para evitar arranhar a superfície do microarray com a pinça, agora transfira os substratos do microarray para um suporte de lâmina de histologia. Banhe os substratos no tampão de lavagem por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação suave, siga o banho de solução de lavagem com mais duas ou três lavagens, todas em água deionizada.
Seque os microarrays antes de prosseguir com a imagem. Um fluxo suave de ar comprimido pode ser usado para esse fim nesta demonstração, os parâmetros são específicos para o teste MDR TB e um gerador de imagens portátil de campo Econ DX 2100. Uma luz azul no gerador de imagens indica que ele está pronto.
Ligue o computador. Abra o software do sistema fornecido por um contador e aguarde o software anunciar que estabeleceu uma conexão com a câmera. Em seguida, insira o microarray seco no gerador de imagens.
Com o microarray voltado para a lente e longe do usuário. O software agora fornecerá uma imagem de visualização no menu suspenso. Selecione o script de análise MDR TB.
Insira um tempo de exposição entre 100 e 500 milissegundos. Pixels superexpostos serão lidos. Ajuste a exposição para minimizá-los.
Quando a saturação estiver definida para minimizar a superexposição, inicie a análise. O software coloca uma grade de TB MDRT nas pontuações das imagens, amostras e intensidades de fundo e, em seguida, relata os resultados da resistência aos medicamentos e da genotipagem. Depois que a análise for concluída e salva, remova o chip do gerador de imagens e inicie uma nova sessão de análise para analisar a próxima matriz.
Continue a análise para cada um dos microarrays processados. Salvando os dados a cada vez. A análise qualitativa de imagens pode fornecer informações sobre fontes de ruído experimental ou variabilidade que são difíceis de identificar em tabelas de dados geradas por software de análise de imagens automatizadas.
Uma matriz de alta qualidade sem artefatos é vista aqui. Vários artefatos podem levar à introdução de bolhas que criam halos. Apesar dos artefatos de matriz, o software ainda recuperará valores de serem verificados.
Um algoritmo de relatório de diagnóstico, apesar de obter valores, reconheceria essa matriz como inválida. Uma série de diluição de DNA genômico selvagem tipo H 37 RA foi usada em um modelo de PCR de microarray a 6,25 picogramas, o equivalente a 1.250 células. Todas as sondas foram detectadas.
Um valor de SNR acima de três é um resultado positivo, e os valores registrados foram muito maiores. Em seguida, os isolados de referência da Organização Mundial da Saúde foram genotipados. Polimorfismos de nucleotídeo único presentes na matriz foram detectados como a mutação correspondente no genoma da TB MDR.
Vários exemplos de detecção de mutações vizinhas próximas também foram evidentes. Uma discussão é fornecida no protocolo de texto. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de três horas e meia a seis horas e meia, dependendo da concentração de DNA, do ensaio específico, da eficiência e uniformidade do termociclador e da sensibilidade e especificidade analítica ou clínica desejadas.
Além disso, o número de ciclos de amplificação e os tempos de hibridização pós-amplificação podem ser prontamente reduzidos ou aumentados para obter as características de desempenho desejadas.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo apresenta um novo método de microarranjo com amplificação para genotipagem do Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas. Ao integrar a amplificação por PCR assimétrica e a hibridização em microarranjo em uma única câmara, o fluxo de trabalho é significativamente simplificado, tornando-o adequado para ambientes com recursos limitados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Genética
- Diagnóstico
Contexto
- O Mycobacterium tuberculosis multirresistente representa um desafio significativo para a saúde pública.
- Os métodos tradicionais de detecção podem ser complexos e intensivos em recursos.
- Existe a necessidade de métodos diagnósticos simplificados em ambientes com recursos limitados.
- Este estudo explora uma nova abordagem utilizando microarranjos de amplificação.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para genotipagem de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas.
- Simplificar a interação do usuário com o teste diagnóstico.
- Combinar os processos de amplificação e hibridização em uma única reação microfluídica.
Métodos Utilizados
- PCR assimétrica multiplex realizada em um microarranjo.
- Amplificação, marcação, seleção de tamanho e hibridização simultâneas.
- Enxágue do microarranjo após a hibridização.
- Uso de um leitor para detectar a presença de Mycobacterium tuberculosis e mutações associadas.
Resultados Principais
- O método de microarranjo de amplificação simplifica o processo diagnóstico.
- Mantém a sensibilidade analítica da PCR.
- Permite capacidade de multiplexação semelhante à dos microarranjos tradicionais.
- Os resultados indicam detecção eficaz de mutações de resistência a medicamentos.
Conclusões
- A microplaca de amplificação é uma ferramenta promissora para o diagnóstico da tuberculose.
- Este método poderia aumentar as capacidades de teste em ambientes com recursos limitados.
- São necessárias mais validações e otimizações para uso generalizado.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método de microarranjo de amplificação agiliza o genotipagem de TB-MR ao integrar PCR assimétrica, marcação e hibridização em uma única câmara microfluídica, reduzindo etapas manuais e permitindo implantação em ambientes com recursos limitados. A abordagem mantém a sensibilidade ao nível de PCR, ao mesmo tempo que permite detecção multiplexada de mutações que conferem resistência, oferecendo um caminho rumo a diagnósticos simplificados e escalonáveis para vigilância de doenças infecciosas. Ao minimizar a interação do usuário e o tempo de processamento, ela atende lacunas críticas em fluxos de trabalho de microbiologia translacional onde velocidade, reprodutibilidade e baixa dependência de infraestrutura são essenciais para validação inicial de alvos e desenvolvimento de ensaios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de alvos genéticos associados a mecanismos de resistência a medicamentos em Mycobacterium tuberculosis.
- Valor Operacional: Apoia a verificação de hipóteses por meio da detecção multiplex de SNPs em uma única reação, reduzindo a variabilidade decorrente da divisão de amostras.
- Valor Traducional: Oferece um sistema relevante para a doença na avaliação de mutações que conferem resistência, auxiliando na redução de riscos mecanicistas em programas de alvos anti-infecciosos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera sinais quantitativos de hibridização que se correlacionam com variantes alélicos, permitindo a discriminação específica de alelos.
- Valor Operacional: Combina amplificação e detecção em um sistema fechado, minimizando o risco de contaminação e melhorando a reprodutibilidade entre lotes.
- Prontidão do Ensaio: Utiliza uma mistura mestra assimétrica de 9 plex compatível com matrizes de baixa densidade, demonstrando multiplexação escalonável para painéis de genotipagem de patógenos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a doença: Genotipiza diretamente cepas de TB-MR utilizando isolados de referência da OMS, garantindo a relevância clínica das mutações detectadas.
- Confiabilidade preditiva: Alcança uma relação sinal-ruído (SNR) >3 como limiar de positividade, fornecendo um parâmetro quantitativo para avaliação do desempenho do ensaio.
- Continuidade do fluxo de trabalho: Gera resultados de genotipagem compatíveis com algoritmos downstream de interpretação de resistência, apoiando o alinhamento de biomarcadores translacionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere nos fluxos de trabalho de descoberta inicial a pré-clínico ao fornecer um resultado rápido de genotipagem em sistema fechado, que orienta decisões de validação de alvo e otimização de compostos líderes em programas anti-infecciosos.
- Biologia de Descoberta: Facilita a investigação em nível de vias de mecanismos de resistência por meio da detecção de múltiplas mutações em genes como rpoB, katG e embB.
- Triagem: Permite o perfilhamento de cepas em alto rendimento com tempo mínimo de manipulação, apoiando a triagem de isolados clínicos ou bibliotecas mutagenizadas.
- Análise: Fornece leituras fluorescentes multiplexadas que quantificam a eficiência de hibridização, permitindo a comparação da abundância de alelos mutantes entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Utiliza entradas de DNA clinicamente relevantes (tão baixas quanto 1.000 equivalentes celulares), integrando testes com amostras sintéticas e derivadas de pacientes.
- Reutilização em Escala: O formato de microarray com amplificação microfluídica é adaptável a outros painéis de patógenos, promovendo a reutilização da plataforma em diferentes alvos de doenças infecciosas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na genotipagem de resistência ao fornecer detecção simultânea e multiplexada de mutações.
- Valor Operacional: Elimina etapas separadas de amplificação e hibridização, diminuindo o tempo de manipulação e a variabilidade técnica.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais rápidas de prosseguir ou interromper na validação de alvos, fornecendo perfis de resistência em 6,5 horas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos que visam cepas resistentes, por meio da genotipagem confiável de isolados pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de microfluídica e na otimização de PCR assimétrica para manter a uniformidade da amplificação.
- Depende de termocicladores com ajustes de tampa reguláveis e detectores de fluorescência compatíveis para a detecção do ponto final.
- Necessita de protocolos de lavagem padronizados para evitar contaminação cruzada entre corridas em modos de processamento em lote.
- Deve levar em conta os limites de compatibilidade dos iniciadores em misturas mestras multiplex, já que o grau de multiplexação é limitado pela compatibilidade dos pares de iniciadores, e não pela densidade de sondas.
- O desempenho é sensível à qualidade e concentração da entrada de DNA, exigindo controle de qualidade do material genômico antes da amplificação.
