Name: Electroeluting fragmentos de DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Aprenda a purificar fragmentos de DNA por eletroeluição com alta eficiência de até 80%. Este método de baixo custo é ideal para clonagem e sequenciamento em biologia molecular.

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Trabalho em laboratório Dr. Bermudez foi financiado pela Conacyt (Grant # 82622). Agradecemos Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez e Ximena Rodriguez-Torres para gravação de vídeo o procedimento electroleution.

<ol><li> A fim de selecionar fragmentos de DNA de interesse para ser purificado, estes devem ser resolvidos em gel de acrilamida ou agarose gel corado com brometo de etídio por eletroforese usando tampão TBE 0.5X (Tris Borato, EDTA) a 120 volts por 1 hora. Para isso, ~ 700 ng de plasmídeo pProEx-GdMre11S (6000 pb) previamente digerido com HindIII NdeI e foi usado para liberar um fragmento de 900 bp (560 ng de plasmídeo e 84 ng de fragmento). </li><li> O tanque electroeluter (Figura 1) deve ser preenchido com TBE 0.5X igualmente distribuídos em cada lado do planalto médio, tendo o cuidado de não derramar-lo para o planalto médio. </li><li> A banda selecionada (ou bandas) é cortada do gel, e colocados em câmara de amostra o mais próximo possível ao canal V (uma fatia por poço). Tampão de corrida deve ser adicionado a cada câmara, apenas o suficiente para cobrir a fatia de gel. </li><li> Cada canal V usada deve ser lavada com uma pipeta Pasteur para eliminar qualquer bolha de ar aprisionado. </li><li> Em seguida, 100 ul de 10 M NH 4 acetato (para facilitar a visualização de uma pequena quantidade de azul de bromofenol é adicionado, apenas o suficiente para colorir) são delicadamente adicionada dentro do canal V. </li><li> A tampa deve ser fechado com cuidado para evitar qualquer ressuspensão da almofada de sal. </li><li> Eletroeluição é iniciada a 100 volts por 25 minutos. </li><li> Quando estiver concluído electrolution, 400 ul são removidos do V-channel, e colocado em um tubo de microcentrífuga para ser precipitado com 2 volumes de etanol frio e glicogênio (recomendado para melhorar a recuperação do DNA) a 4 ° C por 1 hora ou durante a noite. </li><li> Centrifugar por 20 minutos, remova o sobrenadante e lavar com etanol 70%. </li><li> Tubo seco e quantificar DNA na OD 260 nm. </li><li> A recuperação obtida foi de 75% (63 ng recuperado quando 84 ng foram colocados no V-channel). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama Electroeluter. Anod um cátodo são indicados em cada lado do tanque de DNA, contido no gel cortado (ilustrado como um quadrado preto) vai migrar para o catodo, devido à sua carga negativa. Então ele vai ser preso na almofada de sal (representado como um triângulo invertido preto) localizado no V-canal.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A duração da corrida vai depender muito do tamanho dos fragmentos, normalmente por fragmentos até 20 kb 50 minutos a 1 hora é suficiente, enquanto que para pequenos fragmentos de luz UV monitoramento a cada 10 minutos é necessário para evitar que o fragmento de passar pelo almofada de sal e, conseqüentemente, para a câmara de tampão anódica diminuindo recuperação. É importante certificar-se que quando você definir a fonte de alimentação de 100 volts, há uma mAmp atual, pelo menos, de 10. A banda DNA pode ser monitorado usando uma lâmpada UV-mão e detectar quando este abandona a fatia de gel. O sal almofada também pode ser feita com 3 M acetato de sódio. Este procedimento permite a purificação do DNA ou RNA fragmentos de tamanhos diferentes, com boa recuperação (~ 80%) a ser marcado radioactivamente, digeridos por enzimas de restrição, processado por enzimas modificando, etc

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>acetato de NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>Electr&amp;#8211;luter</td><td>IBI</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

electroeluting fragmentos de dna

Electroeluting DNA Fragments

Fragmentos de DNA purificado são utilizados para fins diferentes em Biologia Molecular e eles podem ser preparados por vários procedimentos. A maioria deles requer uma eletroforese anteriores dos fragmentos de DNA a fim de separar a banda de interesse. Então, esta banda é retirado a partir de um gel de agarose ou acrilamida e purificado usando: ligação e eluição de vidro ou sílica partículas, DEAE-celulose membranas, &quot;esmagar e mergulhe método&quot;, eletroeluição ou muito frequentemente caros kits de purificação de comerciais. Assim, a seleção de um método vai depender principalmente do que está disponível no laboratório. O procedimento eletroeluição permite purificar DNA muito limpo para ser usado em um grande número de aplicações (seqüenciamento, marcação radioactiva, restrição enzimática, alteração enzimática, etc clonagem). Este procedimento consiste na colocação de banda DNA contendo fatias de agarose ou acrilamida em poços amostra do electroeluter, então corrente aplicação fará com que o fragmento de DNA para deixar a agarose e, portanto, ser preso em uma almofada de sal a ser recuperado mais tarde, por precipitação de etanol.

Este procedimento permite a purificação de fragmentos de DNA com alto rendimento.

Electroeluting fragmentos de DNA

Fragmentos de DNA purificados são utilizados para diferentes finalidades em Biologia Molecular e podem ser preparados por diversos procedimentos. A maioria deles requer um...

Olá. Hoje vamos mostrar como a eletroeluição é realizada para purificar fragmentos de DNA, como produtos de digestão e PCR. Para finalidades posteriores, como clonagem e sequenciamento, a eletroeluição pode ser um dos métodos de escolha. Com base na carga elétrica negativa do DNA, uma barreira celular alta é colocada dentro do campo elétrico, retendo os fragmentos e impedindo sua migração adicional.Este método permite a purificação de uma ampla variedade de tamanhos de fragmentos de DNA provenientes de diferentes fontes, com uma eficiência relativamente alta de até 80%. Seu baixo custo representa outra vantagem da eletroeluição quando comparada a outros métodos de purificação, como colunas, kits com resina, entre outros. A amostra de DNA é inicialmente visualizada por eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio, a fim de visualizar e identificar o fragmento desejado a ser purificado, devendo a eletroforese prosseguir.Quando os fragmentos estão bem separados, os de tamanho inferior podem ser precisamente determinados. Após a eletroforese, o fragmento desejado é cuidadosamente excisado do gel usando uma lâmina de barbear nova e tomando o cuidado de cortar a fatia de gel o mais próximo possível da faixa de interesse.Este procedimento deve ser realizado com proteção adequada contra a luz UV e usando luvas. Após encher o eletrolisador com o tampão de eletroforese apropriado e tomar cuidado para derramá-lo sobre a superfície da plataforma central, o fragmento de gel é colocado dentro de uma das rodas o mais próximo possível do canal em V. Não deve haver bolhas dentro do canal em V.Isso pode ser evitado lavando o canal com tampão para remover qualquer ar aprisionado. Em seguida, 100 microlitros da barreira de alta salinidade são adicionados cuidadosamente ao canal V a partir do local próximo ao poço. A câmara é fechada e os eletrodos são conectados à fonte de energia para iniciar a eletrolise em 100 a 120 volts.O intervalo de tempo dependerá do tamanho do fragmento para fragmentos grandes de até 20 kbs. De 50 minutos a uma hora deve ser suficiente, e fragmentos pequenos devem ser monitorados a cada 10 minutos com luz UV para evitar maior eluição através da solução salina e para dentro da cadeia de tampão final. Neste caso, digerimos 560 nanogramas de plasmídeo com as enzimas ND uma e entry para liberar um fragmento de 900 pares de bases, equivalente a 84 nanogramas de uma amostra.Assim, após colocar o fragmento de gel na cavidade, a eletroeluição prosseguirá por 25 minutos a 100 volts. Uma vez concluída a eletroeluição e os fragmentos de DNA retidos no tampão sul na região do canal em V, recuperam-se 400 microlitros de solução do canal, do lado distal do recipiente, e transfere-se para um microtubo de 1,5 microlitro utilizando uma ponteira fina acoplada a uma micropipeta. Prossiga então para a precipitação alcoólica, adicionando dois volumes de etanol absoluto gelado e misturando em vórtex. Adicionalmente, podem-se adicionar dois a três microlitros de glicogênio para melhorar o rendimento da recuperação de DNA. Incube os tubos clássicos a menos 20 graus Celsius por uma hora ou, alternativamente, armazene nesta temperatura durante a noite. Em seguida, centrifugue a quatro graus Celsius na velocidade máxima por 25 minutos.Este sobrenadante cardíaco e lavagem adicionando um mililitro de etanol gelado a 70%. Centrifugue a quatro graus Celsius em velocidade máxima por cinco a 10 minutos, descarte o sobrenadante e deixe secar à temperatura ambiente com os tubos em posição invertida, ressuspenda o precipitado em 10 a 15 microlitros de água livre de nucleases e prossiga para determinar a concentração da amostra. Neste caso, a amostra purificada foi ressuspendida em 10 microlitros de água e quantificada em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nanômetros, mostrando uma concentração de 6,3 nanogramas por microlitro, o que representa uma eficiência de 75%. Você pode estar pensando que seria melhor investir apenas 10 minutos do seu precioso tempo com um kit.No entanto, apesar do tempo consumido neste processo, você será capaz de controlar muitas das variáveis que permitirão purificar uma ampla gama de amostras com diferentes tamanhos e origens naturais. Como você pode ter observado no presente caso, uma eficiência de 75% foi observada, igual ou superior à maioria dos kits de purificação de DNA. Obrigado por se juntar a nós hoje.Esperamos que você tenha encontrado este protocolo útil para seus projetos de pesquisa.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases

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