Electroeluting fragmentos de DNA

Hi.Today mostraremos como a eletrolução é realizada para purificar fragmentos de DNA, como digestão e produtos de PCR. Para outros fins, como clonagem e sequenciamento, a eletrolução pode ser um dos métodos de escolha. Com base na carga elétrica negativa do DNA, uma alta barreira celular é colocada dentro do campo elétrico, soltando os fragmentos e impedindo sua migração.

Este método permite a purificação de uma ampla gama de tamanhos de fragmentos de DNA de diferentes fontes com uma eficiência relativamente alta de até 80%Seu baixo custo. Representam outra vantagem da eletrolução quando comparada a outros métodos de purificação como colunas, kits de resina, entre outros. A amostra de DNA é visualizada pela primeira vez por uma eletroforese em gel de Aris corada com brometo de tédio, a fim de visualizar e identificar o fragmento desejado a ser purificado, a eletroforese deve prosseguir.

Os fragmentos inferiores são bem separados, o tamanho inferior pode ser determinado com precisão. Após eletroforese. O fragmento desejado é cuidadosamente excisado do gel usando uma lâmina de barbear nova e tomando cuidado para virar a fatia de gel o mais próximo possível da faixa de interesse.

Este procedimento deve ser realizado com proteção adequada contra a luz ultravioleta e usando luvas. Depois de encher o eletro luter com o tampão de queima apropriado e ter o cuidado de derramá-lo sobre a superfície do platô médio, a fatia de gel é colocada dentro de uma das rodas o mais próximo possível do canal V. Não deve haver bolhas dentro do canal vch.

Isso pode ser evitado lavando o canal com buffer para remover qualquer ar preso. Em seguida, 100 microlitros da barreira alta de sal são adicionados cuidadosamente ao canal V do local proximal ao poço. A câmara é fechada e os eletrodos conectados à fonte de energia para iniciar a eletrolução em 100 a 120 volts.

O lapso de tempo dependerá do tamanho do fragmento para fragmentos grandes de até 20 kbs. 50 minutos a uma hora devem ser suficientes e pequenos fragmentos devem ser monitorados a cada 10 minutos com luz ultravioleta para evitar mais elion através da solução salina e na cadeia tampão adulta final. Neste caso, digerimos 560 nanogramas de plasmídeo com as enzimas ND um e entrada para liberar uma base de 900 por fragmento, o equivalente a 84 nanogramas de uma amostra.

Assim, depois de colocar a fatia de gel dentro do poço, a eletrolução prosseguirá por 25 minutos a 100 volts. Uma vez que a eletrossolução é concluída e os fragmentos de DNA ficam presos na almofada sul dentro do canal V, 400 microlitros de solução são recuperados do canal, do lado distal do receptáculo e colocados em um microtubo de 1,5 microlitro usando uma ponta fina presa a um micropoço, prossiga para a precipitação de álcool adicionando dois volumes de etanol absoluto frio e misturado por vórtice. Além disso, dois a três microlitros de glicogênio podem ser adicionados para melhorar o rendimento dos tubos clássicos de recuperação de DNA a menos 20 graus Celsius por uma hora ou, alternativamente, armazene a essa temperatura durante a noite centrifugue a quatro graus Celsius em velocidade máxima por 25 minutos.

Este sobrenadante cardio e lave adicionando um mililitro de frio, 70% de etanol Centrífuga a quatro graus Celsius em velocidade máxima por cinco a 10 minutos, descarte o sobrenadante e deixe secar em temperatura ambiente com os tubos em posição invertida, graxas gastas em 10 a 15 microlitros de água livre de núcleo e prossiga para determinar a concentração da amostra. Neste caso, a amostra purificada foi ressuspensa em 10 microlitros de água e quantificada em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nanômetros mostrando uma concentração de 6,3 nanogramas por microlitro, representando uma eficiência de 75%. Você pode estar pensando que seria melhor investir apenas 10 minutos do seu precioso tempo com um kit.

No entanto, apesar do tempo consumido neste processo, você poderá controlar muitas das variáveis que permitirão purificar uma gama mais ampla de amostras com tamanhos e fontes naturais. Como você pode ter visto no presente caso, foi observada uma eficiência de 75% igual ou melhor do que a maioria dos kits de purificação de DNA. Obrigado por se juntar a nós hoje.

Esperamos que você tenha achado este protocolo útil para seus projetos de pesquisa.