Análise direta de células individuais por Espectrometria de Massa à pressão atmosférica

O objetivo geral do experimento a seguir é ejetar o conteúdo de uma única célula viva e ionizar as biomoléculas liberadas para análise por um espectrômetro de massas à pressão atmosférica. Isso é alcançado mediante a seleção de uma única célula por meio de um microscópio de longa distância e a ablação da célula selecionada por um pulso a laser de comprimento de onda de 2,94 micrômetros, entregue através de uma fibra óptica afiada. A ablação de uma única célula resultará na formação de uma pluma microscópica de material particulado neutro para ionizar a pluma de ablação.

É interceptado por uma eletrosspray. As gotículas carregadas do spray coalescem com as partículas da pluma de ablação originada da célula. As gotículas resultantes são semeadas com as moléculas da célula e produzem os íons correspondentes.

São obtidos resultados que mostram um espectro de massas de uma única célula. O espectro contém inúmeras picos relacionados aos metabólitos e lipídios da célula. Olá, sou o Dr. Bin Drester do Laboratório Verese, do Departamento de Química da Universidade George Washington.

Hoje vamos mostrar o procedimento para análise direta de células vivas individuais por espectrometria de massas à pressão atmosférica. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar metabólitos e lipídios de células individuais de plantas e animais. Então, vamos começar.

A ablação a laser para ablação a laser, ionização por eletrosspray, espectrometria de massa ou MS preguiçosa é produzida por um pulso de laser de cinco nanosegundos em um comprimento de onda de 2,94 micrômetros. Óptica ajustável. Oscilador paramétrico sintonizável acionado por um laser de neodímio YAG é utilizado para ablação neste estudo.

Para começar, monte a extremidade gravada de uma fibra óptica em um micromanipulador e aproxime-a da superfície celular. Para uma deposição eficiente de energia, segure a extremidade não gravada da fibra óptica com um porta-fibra descoberto para o alinhamento óptico. O porta-fibra é montado em um tradutor de cinco eixos.

Cople a energia do laser à fibra focalizando o feixe com uma lente plano-convexa de fluoreto de cálcio ou de selênio de zinco com revestimento antirreflexo em sua extremidade não gravada, utilizando espelhos dourados protegidos para direcionar o feixe de laser do infravermelho médio até a lente de foco. Para manter a distância entre a ponta afiada da fibra e a superfície celular, utilize um microscópio de vídeo de longa distância montado em um ângulo de 15 a 30 graus medido a partir da superfície. Este sistema também é composto por uma lente objetiva corrigida ao infinito com aumento de cinco vezes, equipada com uma câmera CCD para monitoramento e captura de imagens.

Um segundo microscópio de vídeo é montado em ângulo reto em relação à superfície da amostra para visualizar as células de cima e selecioná-las para análise. Este sistema fornece retroalimentação visual para alinhar a ponta da fibra sobre a célula selecionada para ablação e análise. Ele consiste em um conjunto óptico de zoom de precisão sete vezes com uma lente objetiva de longa distância de trabalho corrigida ao infinito de dez vezes e uma câmera CCD.

O sistema de eletrosspray foi construído utilizando uma união metálica com perfluoro condutivo, elastômero, conexões ferais, tubos, porta de agulha com luva, bem como tubo de sílica FU. O emissor recomendado é feito de aço inoxidável e possui uma ponta afilada com 50 micrômetros de diâmetro; prepare uma solução de 50% de metanol com 0,1% de ácido acético para o eletrosspray. Bombeie a solução a uma taxa de 200 a 300 nanolitros por minuto por meio de uma bomba de seringa.

Usando uma seringa de 500 microlitros, uma alta tensão entre 2, 803, 000 volts será aplicada à junção metálica por uma fonte de alimentação regulada. Para gerar um eletrosspray estável, certifique-se de que todas as conexões elétricas estejam seguras e protegidas com o blindagem, corretamente aterradas, pois o contato direto com alta tensão exposta pode resultar em choque elétrico. Obtenha a amostra de tecido ou célula viva de uma fonte apropriada e mantenha-a conforme recomendado antes da análise.

Os bulbos de alho para esta demonstração foram adquiridos em uma loja local para o preparo da amostra. Corte longitudinalmente o bulbo de alho com um bisturi cirúrgico, seccionando um segmento de aproximadamente dois centímetros quadrados da escama de um bulbo de cebola. Em seguida, retire uma monocamada intacta do tecido epidermal interno. Utilize a superfície úmida da epiderme para montar o tecido em uma lâmina de microscópio de vidro previamente limpa.

Segure a lâmina com um suporte de placa de uso geral, montado em uma plataforma de translação de três eixos para posicionamento. Imediatamente após montar a amostra, adquira os espectros de massa para evitar a degradação celular. Comece ligando o laser, a eletrosspray e o espectrômetro de massa.

Otimize a geometria da fonte de íons lazy ajustando a posição do ponto de ablación em relação ao emissor de eletrosspray e à abertura do espectrômetro de massas. Para obter a máxima intensidade de íons, selecione a célula de interesse para análise utilizando o sistema de visualização em vista superior. Após a seleção, mova a platina da amostra para posicionar a célula selecionada diretamente abaixo da ponta afiada da fibra óptica.

Usando o microscópio com vista lateral, reajuste a distância entre a ponta e a superfície da célula para aproximadamente 20 mícrons. Uma vez na posição correta, aplique pulsos a laser na célula selecionada por meio da ponta da fibra gravada. Isso resulta na perfuração da parede celular e na ejeção do citoplasma na forma de material particulado.

Após a ionização posterior pelo eletrosspray, os íons produzidos são coletados pelo espectrômetro de massas e os espectros de massas são registrados. Após a aquisição dos dados, coloque o laser, o eletrosspray e o espectrômetro de massas em modo de espera ou desligue-os. Mantenha a amostra de tecido de Allium cepa ablacionada para observação opcional por microscopia óptica; a ablação bem-sucedida de uma única célula resulta na ruptura da parede celular e na coleta de um espectro de massas satisfatório.

Aqui estão os resultados da análise MS preguiçosa de uma única célula epidérmica embutida de um bulbo de Allium SEPA, mostrando uma imagem representativa de microscopia óptica. Após a amostragem de uma célula, a parede celular é perfurada e a extensão da perfuração é limitada pelos limites com as células vizinhas. As células adjacentes parecem estar intactas.

Aqui é mostrado um espectro de massa lazy representativo produzido a partir da célula. Uma grande variedade de íons é detectada a partir do alium sea por célula, e com base em suas massas exatas, padrões de distribuição de isótopos e espectros de massa em tandem, os íons são cuidadosamente atribuídos a metabólitos endógenos. Os íons detectados a partir de uma única célula foram semelhantes aos observados na análise do mesmo tecido por espectrometria de massa lazy convencional de múltiplas células.

Acabamos de mostrar como analisar células vivas individuais por espectrometria de massas à pressão atmosférica. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar proteção ocular para evitar exposição acidental a lasers de infravermelho da classe quatro. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.