Imagem interações proteína-proteína In vivo

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a presença de interações proteína-proteína na superfície celular. Isso é conseguido clonando dois receptores de interesse, um mio terminal para dois fluoróforos que têm emissão e espectros sobrepostos como uma segunda etapa. Os dois vetores são transfectados simultaneamente em células endoteliais para expressão do receptor.

Neste ponto, os fluoróforos ajudam a avaliar a extensão geral da expressão, bem como a localização do receptor. Em seguida, os parâmetros de imagem são estabelecidos usando um único transfecto como controle no microscópio confocal. Individualmente, as células transfectadas são selecionadas com base em seus níveis relativos de expressão e localização do receptor.

As regiões dentro dessas células são então visualizadas para avaliar a extensão dos resultados de trastes obtidos. Isso mostra interações de empate um e dois na superfície da célula endotelial com base em microscopia de fre e confocal. Olá, sou Tom Seger, do laboratório do Dr. William Barton no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Virginia Commonwealth University.

Hoje mostraremos um procedimento para avaliar as interações proteína-proteína em células endoteliais por uma microscopia confocal baseada em traste. Em nosso laboratório, usamos isso para estudar as interações dos receptores durante a angiogênese. Então vamos começar.

Para obter imagens de interações proteína-proteína usando um ensaio de proximidade baseado em traste, comece clonando seus receptores de interesse nos locais NHE one eco R one do pcd, um vetor 3.1 hydro ou neo contendo CFP ou YFP monomérico. A determinação do traste é empírica e é criticamente dependente do comprimento do ligante entre a região transmembrana e o início do Fluor. Portanto, várias ligações diferentes de ligante devem ser exploradas para cada novo par de receptores. Sob investigação, transforme e amplifique os vetores de acordo com o protocolo que acompanha.

Em seguida, prepare o DNA de grau de transfecção, transforme e amplifique os vetores de acordo com o protocolo que o acompanha. Em seguida, prepare o DNA de grau de transfecção e dilua-o a uma concentração de trabalho de um micrograma por microlitro para preparar as células para a transfecção sob uma capa de cultura de tecidos, divida as células EAHY 92 6 cultivadas em DMEM completo em placas de 35 milímetros com dois mililitros de meio. Prepare uma placa para avaliar a expressão de cada receptor individual, bem como uma placa para cada par de receptores.

Permita que as células incubem mais de 95% da atmosfera de dióxido de carbono a 37 graus Celsius no dia seguinte. A cultura deve estar em torno de 70 a 90% de confluência no dia da transfecção. Prepare complexos nucleolipídicos misturando dois microgramas do DNA do vetor do receptor quimérico com oito microlitros de Fuji N HD em 200 microlitros de pré-aquecimento ideal para pares de receptores transfectados com um micrograma de cada receptor para um total de dois microgramas misturados suavemente por inversão e incube-o em temperatura ambiente por 30 minutos.

Durante o período de incubação, prepare as células para a transfecção, aspire de meio fresco e lave cada placa suavemente e brevemente com PBS quente antes da adição de dois mililitros de DMEM completo pré-guerra sem antibióticos. É importante evitar a presença de penicilina e estreptomicina, pois são consideravelmente mais tóxicas para as células durante o tratamento com o gene FU HD no complexo gota a gota para as células e incubar por mais 20 a 24 horas. Após 24 horas, aspire cuidadosamente o meio das células e pipete DMEM completo fresco com antibióticos após a transfecção.

A viabilidade celular deve permanecer relativamente alta. Poucas ou nenhuma célula flutuante deve ser observada. Para realizar imagens de células vivas, usamos um microscópio confocal de varredura a laser A-T-C-S-P dois A OBS equipado com argônio de diodo azul e lasers de néon de hélio verde, laranja e vermelho, uma imersão de glicerina HCX 63 x 1,3 NA, um estágio XY motorizado e uma incubadora de estágio controlada por temperatura, umidade e dióxido de carbono.

Os controles experimentais são cruciais para eliminar a diafonia do flúor entre os canais de emissão, bem como para avaliar problemas de expressão e quatro fluorização não específica. Como tal, um único transfecto de quatro flúor é utilizado para configurar cada sessão de imagem para eliminar a diafonia entre os canais de emissão para CFP e YFP. Coloque o controle de expressão CFP na incubadora de estágio usando luz branca.

Ajuste a placa Z para focar nas células. Defina as configurações da janela SP para detecção de emissão de CFP para 465 a 505 e YFP para 525 a 600 nanômetros enquanto o monitoramento de ambos os canais de emissão excita o CFP em 458 nanômetros. Usando o A OTF, defina a potência do laser para eliminar o sangramento apreciável de CFP no canal de emissão YFP.

Salve essa configuração. Execute o mesmo controle para diafonia YFP no canal CFP ajustando a potência de excitação em 514 nanômetros. As células que expressam apenas YFP salvam essa configuração.

Em seguida, no próximo lugar, as células coex expressando CFP e YFP na incubadora de estágio. Usando a configuração de sequência para o software confocal LICO. Localize células que expressam níveis semelhantes de CFP e YFP com localização adequada da membrana usando o software LICO, exceto um programa de branqueamento de fotos aceitador de software.

Defina as configurações do doador e do aceitante para as configurações salvas de CFP e YFP, respectivamente. Ampliando a célula, destaque uma região de interesse ou ROI na qual a fotodestruição do YFP deve ocorrer na membrana celular e inicie o programa para fotodestruição do aceitador. Ajuste o A OTF para 100% de 514 nanômetros e permita que o branqueamento a laser continue até que 70% da emissão de YFP tenha sido esgotada.

Para acelerar o branqueamento, as ROIs são normalmente escolhidas no eixo raster do laser durante o fotobranqueamento. Monitore o movimento celular e rejeite as medições obtidas com movimento apreciável no plano XY. Como essas medições podem relatar eficiências de falsos trastes, as imagens pré e pós-branqueamento são registradas para doador e aceitador e a eficiência do traste é calculada como eficiência de traste igual ao poste pai aberto menos os parênteses DLO dividido por depost para todos os depost maiores que D pré, onde D, pré e D post são as intensidades do doador antes e depois do fotobranqueamento, respectivamente.

O JMP é usado para determinar a extensão da variabilidade experimental. Receptores individuais Devem ser fundidos a CFP e YFP com comprimentos variados de sequência de membrana justa. Para identificar o melhor par possível de parceiros de trastes receptores, as eficiências de transfecção são tipicamente entre 30 a 40%, apesar das descobertas anteriores de outros.

Não vimos que a transfecção e a expressão de um vetor favoreçam a do outro. De fato, freqüentemente observamos a expressão exclusiva de uma flora, quatro espelhos KY ou outro. Essas imagens representativas mostram uma análise de fotobranqueamento aceitador do traste ocorrendo entre CFP e YFP em uma célula EAHY 9 26.

Os canais de emissão de CFP e YFP foram monitorados separadamente antes e após o fotobranqueamento, o fotobranqueamento e os cálculos foram restritos à região. Dentro da caixa vermelha, a eficiência do traste é exibida como uma faixa absoluta de vermelho de alta cor em 1,0 a roxo de baixa cor em zero em uma sobreposição ampliada de imagem mesclada de A-C-F-P-Y-F-P para fins de orientação apenas para o sistema receptor T. Os valores típicos de eficiência do traste são de 20 a 28% para células epiteliais e 19 a 23% para células endoteliais, conforme mostrado aqui.

Portanto, uma vez dominada, essa técnica normalmente leva de três a quatro dias se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o comprimento do ligante entre a proteína-alvo e a proteína fluorescente de fusão, bem como seus níveis de expressão e movimento celular, afetam diretamente a medição do traste após o procedimento. Além disso, ensaios bioquímicos sobre a ativação do sinal podem ser realizados para obter informações sobre as vias de transdução de sinal após seu desenvolvimento.

Esta técnica fornece um ensaio no qual as interações proteína-proteína fracas ou transitórias podem ser estudadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar seus próprios ensaios de proximidade baseados em trastes e células vivas. E não se esqueça de que, ao trabalhar com células em cultura de tecidos, as precauções de segurança apropriadas devem sempre ser seguidas.

Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus futuros experimentos de trastes.