Imagem interações proteína-proteína In vivo

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a presença de interações entre proteínas na superfície celular. Isso é realizado clonando dois receptores de interesse, cada um ligado a duas fluoroforas com espectros de emissão sobrepostos, como segundo passo. Os dois vetores são cotransfectados simultaneamente em células endoteliais para expressão dos receptores.

Neste momento, os fluoróforos auxiliam na avaliação do grau geral de expressão, bem como na localização do receptor. Em seguida, os parâmetros de imagem são estabelecidos utilizando uma transfeção simples como controle no microscópio confocal. Células transfectadas individualmente são selecionadas com base nos seus níveis relativos de expressão e localização do receptor.

Regiões dentro dessas células são então imagiadas para avaliar a extensão dos resultados de FRET que mostram interações tie um e tie dois na superfície da célula endotelial com base em FRET e microscopia confocal. Olá, sou Tom Seger do laboratório do Dr. William Barton do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Estadual da Virgínia.

Hoje vamos mostrar um procedimento para avaliar interações entre proteínas em células endoteliais por meio de microscopia confocal baseada em FRET. Em nosso laboratório, utilizamos isso para estudar interações entre receptores durante a angiogênese. Então, vamos começar.

Para imaginar interações entre proteínas utilizando um ensaio de proximidade baseado em FRET, comece clonando seus receptores de interesse nos sítios NHE I e EcoR I do vetor pcd, a 3.1 hydro ou neo contendo CFP ou YFP monomérico. A determinação de FRET é empírica e depende criticamente do comprimento do ligador entre a região transmembrânica e o início do fluoróforo. Portanto, diversos comprimentos de ligador devem ser explorados para cada novo par de receptores em estudo. Transforme e amplifique os vetores de acordo com o protocolo fornecido.

Em seguida, prepare o DNA de qualidade para transfeção, transforme e amplifique os vetores de acordo com o protocolo fornecido. Então, prepare o DNA de qualidade para transfeção e dilua-o até uma concentração de trabalho de um micrograma por microlitro para preparar as células para transfeção sob uma cabine de cultura celular. Divida as células EAHY 926 cultivadas em DMEM completo em placas de 35 milímetros com lamínulas, utilizando dois mililitros de meio. Prepare uma placa para avaliar a expressão de cada receptor individual, bem como uma placa para cada par de receptores.

Deixe as células incubarem em atmosfera com mais de 95% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius no dia seguinte. O cultivo deve apresentar cerca de 70 a 90% de confluência no dia da transfeção. Prepare os complexos nucleolipídicos misturando dois microgramas do DNA do vetor do receptor quimérico com oito microlitros de Fuji N HD em 200 microlitros de Opti-MEM pré-aquecido; para pares de receptores, transfete com um micrograma de cada receptor, totalizando dois microgramas, misturando suavemente por inversão e incubando à temperatura ambiente por 30 minutos.

Durante o período de incubação, prepare as células para transfeção aspirando o meio fresco e lavando cada placa suave e brevemente com PBS morno antes da adição de dois mililitros de DMEM completo pré-aquecido sem antibióticos. É importante evitar a presença de penicilina e estreptomicina, pois são consideravelmente mais tóxicas para as células durante o tratamento com o gene FU HD. Adicione o complexo gota a gota às células e incube por mais 20 a 24 horas. Após 24 horas, aspire cuidadosamente o meio das células e adicione meio DMEM completo fresco com antibióticos após a transfeção.

A viabilidade celular deve permanecer relativamente alta. Poucas ou nenhuma célula flutuante deve ser observada. Para realizar a microscopia de células vivas, utilizamos um microscópio confocal de varredura a laser A-T-C-S-P dois A OBS equipado com diodo azul, argônio e lasers de hélio-neônio verdes, laranja e vermelhos, um objetivo H-C-X-P-I-A-O 63 x 1,3 NA de imersão em glicerol, uma platina motorizada XY e um incubador de platina com controle de temperatura, umidade e dióxido de carbono.

Controles experimentais são cruciais para eliminar a interferência cruzada entre os canais de emissão, bem como para avaliar problemas de expressão e fluorização não específica. Por isso, transfeções com um único fluoróforo são utilizadas para configurar cada sessão de imagem, eliminando a interferência cruzada entre os canais de emissão para CFP e YFP. Coloque o controle de expressão de CFP no incubador de estágio utilizando luz branca.

Ajuste a placa Z para focar nas células. Defina as configurações da janela SP para detecção de emissão de CFP entre 465 e 505 e de YFP entre 525 e 600 nanômetros, enquanto monitora ambos os canais de emissão, excitando o CFP a 458 nanômetros. Usando o A OTF, ajuste a potência do laser para eliminar a sobreposição apreciável de CFP no canal de emissão de YFP.

Salve esta configuração. Realize o mesmo controle para a interferência de YFP no canal CFP ajustando a potência de excitação em 514 nanômetros. As células que expressam apenas YFP, salve esta configuração.

Em seguida, coloque as células coexpressando CFP e YFP no incubador do estágio. Utilizando a configuração de sequência do software confocal LICO, localize células que expressem níveis semelhantes de CFP e YFP com correta localização na membrana, usando o software LICO, exceto um programa aceitador de fotoesbranquecimento.

Defina as configurações do doador e do aceptor conforme as configurações salvas de CFP e YFP, respectivamente. Aproxime a imagem da célula, destaque uma região de interesse ou ROI na qual a foto-destruição de YFP ocorrerá na membrana celular e inicie o programa para a foto-destruição do aceptor. Ajuste a A OTF para 100% de 514 nanômetros e permita que o clareamento a laser prossiga até que 70% da emissão de YFP tenha sido esgotada.

Para acelerar o clareamento, as ROI geralmente são escolhidas no eixo raster do laser durante o fotoclarimento. Monitore o movimento celular e rejeite medições obtidas com movimento acentuado no plano XY. Como essas medições podem indicar eficiências de FRET falsas, são registradas imagens pré e pós-clareamento para o doador e o aceptor, e a eficiência de FRET é calculada como eficiência de FRET igual a (DLO pós-aberto menos DLO entre parênteses) dividido por Dpós, para todos os Dpós maiores que D pré, onde D pré e D pós são as intensidades do doador antes e depois do fotoclarimento, respectivamente.

O JMP é usado para determinar o grau de variabilidade experimental. Receptores individuais devem ser fundidos tanto ao CFP quanto ao YFP com comprimentos variáveis de sequência juxtamembrana. Para identificar o melhor par possível de parceiros de ressonância de transferência de energia por fluorescência (FRET) do receptor, as eficiências de transfeção geralmente estão entre 30 e 40%, apesar de descobertas anteriores por outros pesquisadores.

Não observamos que a transfeção e expressão de um vetor favoreçam a do outro. De fato, frequentemente observamos expressão exclusiva de uma flora, quatro espelhos KY ou do outro. Essas imagens representativas mostram uma análise de fotobranqueamento do aceptor de fret ocorrendo entre CFP e YFP em uma célula EAHY 9 26.

Os canais de emissão de CFP e YFP foram monitorados separadamente antes e após o branqueamento fotônico, e os cálculos foram restritos à região. Dentro da caixa vermelha, a eficiência de FRET é exibida como uma faixa absoluta, variando de alto (colorido em vermelho) em 1,0 a baixo (colorido em roxo) em zero, sobreposta ampliada da imagem mesclada de A-C-F-P-Y-F-P, apenas para fins de orientação no sistema do receptor T. Os valores típicos de eficiência de FRET são de 20 a 28% para células epiteliais e de 19 a 23% para células endoteliais, conforme mostrado aqui.

Assim, uma vez dominada, essa técnica normalmente leva de três a quatro dias, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o comprimento do ligador entre a proteína-alvo e a proteína fluorescente de fusão, bem como seus níveis de expressão e movimentação celular, afetam diretamente a medição de FRET após seu procedimento. Além disso, ensaios bioquímicos relativos à ativação do sinal podem ser realizados para obter informações sobre as vias de transdução de sinal após seu desenvolvimento.

Essa técnica fornece um ensaio no qual interações proteína-proteína, sejam fracas ou transitórias, podem ser estudadas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar seus próprios ensaios de proximidade baseados em FRET em células vivas. E não se esqueça de que, ao trabalhar com células em cultura de tecidos, as precauções de segurança apropriadas devem sempre ser seguidas.

Portanto, obrigado por assistir e boa sorte com seus futuros experimentos com fret.