Name: Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a cultivar embriões de galinha ex-ovo para estudos de embriologia e biologia do desenvolvimento. Este método permite acesso óptico completo, microinjeção vascular e microcirurgia em embriões de Gallus gallus.

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1. Protocolo Cultura Ex-ovo: <ol><li> Incubar ovos de galinha fertilizados <ol class="lroman"><li> Ovos de galinha fertilizados podem ser armazenadas a 13 ° C até 5 dias antes da incubação sem iniciar o desenvolvimento. Um refrigerador de vinho tinto pode manter esta temperatura. </li><li> Incubar ovos lado sem corte em um 60% de umidade constante incubadora com balanço contínuo a 37,5 ° C por 72 horas. </li></ol></li><li> Prepare redes (Figura 1a) <ol class="lroman"><li> Preencha ¾ de 9 oz copos de plástico com água estéril morna. A regularidade 9 oz copo tem um diâmetro superior de 8 cm. Descobrimos que este tamanho era o mais adequado para aplicação de longa data a cultura aqui apresentado. </li><li> Cortar cerca de 20 cm filme plástico. Apor circunferencialmente em cima do copo, colocando uma faixa de borracha ao redor. Plástico deve ser espalhado em cima da água. Corte o excesso de plástico em torno da banda. Encontramos filme plástico a ser mais adequado para esta aplicação, uma vez que previne a adesão da gema, resultando na separação da gema durante o transporte. </li><li> Limpe o plástico com kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) umedecido com álcool 70%. </li></ol></li><li> Retire os ovos da incubadora após 72 horas de incubação. </li><li> Esterilizar os ovos, limpando a superfície com álcool 70% kimwipes molhada. </li><li> Colocar os ovos na horizontal por 1-2 minutos para o posicionamento adequado do embrião (Figura 1b). Uma caixa de ovos pode ser usado para colocar ovos na horizontal. Embriões irá girar ao topo após 1-2 minutos. </li><li> Transferência de embriões em redes assepticamente em uma capela de fluxo laminar. <ol class="lroman"><li> Usando uma borda afiada (como a borda de um balde de metal ou um copo de vidro), toque o ovo delicadamente até que haja um pequeno dente na parte inferior do ovo (Figura 1c). Lembre-se, o embrião é posicionado no upperside. </li><li> Colocar os polegares em lados opostos do dente e puxe as cascas para além horizontalmente (Figura 1d). </li><li> Coloque a gema com o embrião, bem como a albumina para a rede (figura 1e). Albumina irá proporcionar um ambiente de amortecimento em torno da gema para absorver os choques induzidos movendo o sistema, bem como proporciona nutrição para o embrião para as práticas da cultura de comprimento. Água por baixo da rede vai garantir o embrião vai ficar paralelos ao chão durante o transporte e servir como um condutor de calor durante o exame, se um aquecedor de circulação de água é utilizada. </li><li> O embrião já deve ser colocada em cima se a transferência for realizada corretamente. Se não, use um unsharp, objeto estéril (ou seja, de ponta Blunt tesoura curva fechada) e acariciar direcionalmente a gema de tal forma que o embrião gira ao topo. </li><li> Lugar a 10 cm de diâmetro placa de Petri em cima do copo para selar o embrião. </li></ol></li><li> Colocar a cultura copo no set incubadora a 37,5 ° C. Se uma incubadora portátil é utilizado, colocando setembro 1-2 copos oz preenchido com água destilada mantém a umidade em ~ 60% (Figura 1f). </li><li> Se os embriões cultura além do dia embrionárias 7, pedaços de casca de ovo esmagada devem ser espalhadas em torno da periferia do embrião como fonte de cálcio para o desenvolvimento ósseo e maturação. </li></ol> Equipamento acessório para a incubadora fora imagem / manipulação: Um banho de água circulante foi construída em casa para manter a temperatura de incubação, enquanto imagens ou manipulação (Figura 3). Um banho de água que pode caber o cálice é ligado através de tubos de tamanho apropriado para um reservatório de água. Um aquecedor de resistência aquece a água no reservatório, que é regulada manualmente, seguindo a temperatura da água. Uma bomba de água circula a água. Representação pictórica mostra a facilidade de imagens via ultrasongraphy / microscopia fluorescente (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparação de rede e transferência de embriões de galinha para redes. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resultados representativos -. Embriões de galinha cresceu estágio diferente através de técnica de cultura de embriões ex ovo HH 17 em diante podem ser cultivadas através desta técnica. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imagens esquemáticas e representante do sistema de circulação de água utilizada em conjunto com o sistema de cultura ex-ovo para manter os embriões à temperatura ideal de desenvolvimento. 2. Os pedidos seleccionados: Microinjeção I. Esta cultura de embriões é adequado para aplicações microinjeção onde as soluções precisam ser injetado para vasculatura para geração de imagens baseado em contraste (microscopia de fluorescência ou seja, micro-topografia computadorizada, etc) (Figura 4). Abaixo está o protocolo de microinjeção: <ol><li> Prepare comparti injeçãotus <ol class="lroman"><li> Moda puxado 0,75 tubos ID capilar de vidro em ponta chanfrada microagulhas usando um microforge. Tamanho da ponta necessária depende taxa alvo veia diâmetro / fluxo desejado. </li><li> Conectar a seringa ao tubo 0,03 polegadas ID silicone. </li><li> Carregar o tubo com a solução a ser injetado e conecte o microagulhas para a tubulação. </li><li> Coloque o microagulhas e micromanipulador para a seringa para titular seringa ou bomba de seringa. </li></ol></li><li> Adicionar água esterilizada no copo, assim, elevar o embrião. Nós experimentamos que para a penetração adequada da agulha em um vaso sanguíneo (navio vitelínico ou seja), a penetração horizontal é necessária. Isso requer o embrião estar no mesmo plano que as bordas do copo. <ol class="lroman"><li> Retire a banda de borracha que segura o plástico sob o embrião. </li><li> Levantar um dos lados do plástico com cuidado e acrescente um pouco de água estéril para o copo. </li><li> Segura o elástico para o plástico de novo. </li></ol></li><li> Injetar a solução para um navio embrionárias. Em nossa experiência, quando a solução é injetada a um navio vitelínico, microagulhas precisava ser ª cerca de 1 / 10 de tamanho do diâmetro do vaso para manter a perfusão eficiente sem causar sangramento. <ol class="lroman"><li> Bombear a solução para o microneedle garantindo que não haja formação de bolhas de ar. </li><li> Alinhe a ponta do microagulhas para o navio selecionado. Para os navios vitelínico, a seleção de uma área de garfo dará área máxima para penetrar na embarcação. </li><li> Empurre a agulha em direção ao navio. O navio irá primeiro retrair. Uma vez que a agulha penetra, iniciar a perfusão. A cor do sangue que flui deve mudar com a perfusão. Se mudar de cor não é visto, a agulha pode ter penetrado para fora da embarcação. Nesse caso, lentamente retrair o microagulhas, ao mesmo tempo de bombeamento solução até mudar de cor no vaso é visto. Uma vez que a perfusão está completo, recolher o microagulhas para fora da embarcação. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: microinjeção de um corante fluorescente na vasculatura de um embrião de galinha ex-ovo cultivadas. II. Procedimento de microcirurgia - Ligadura Atrial Esquerda Esta configuração cultura ex-ovo é ideal para a realização de aplicações cirúrgicas de embriões de galinha, uma vez que oferece acessibilidade total para o embrião. Abaixo está o protocolo de uma técnica de exemplo, deixou ligadura atrial (LAL) (Figura 5). O procedimento é realizado em aproximadamente 24 horas para o período de cultura (HH24): <ol><li> Prepare overhand nós ~ 0,5 mm de diâmetro com fio de náilon 10-0 cirúrgico. </li><li> Com uma pinça fina, localmente remover as membranas coriônica e alantóide sobre o embrião e levante o embrião de trás para girá-lo na vertical de tal forma que o lado esquerdo do embrião é visível. </li><li> Utilizando uma pinça fina, retire o pericárdio sobre o átrio esquerdo. </li><li> Alinhar o nó sobre o átrio esquerdo e aperte-a. O nó deve ser amarrado de modo a proibir ~ 75% do fluxo sangüíneo original para o lado esquerdo. Cortar as bordas do nó com microtesoura e remova cuidadosamente e descarte de sutura em excesso. </li><li> Gire o embrião de volta à sua orientação original (lado direito em cima). </li><li> Controles Sham envolverá o mesmo procedimento, mas a sutura só vai ser transmitido através de e não vinculados. Tratamento eficaz LAL (75% constrição) será confirmado com 24 horas pós-cirurgia, e os embriões desqualificado serão excluídas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5:. Um controle e um embrião de galinha atrial esquerda ligada seta mostra o átrio esquerdo, que é cerca de 75% menor no embrião ligado.

<ol><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li>
<li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li>
<li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18%2C+21+and+24+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li>
<li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li>
<li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Acesso óptico e experimentação em embriões de aves é um desafio devido às limitações da casca do ovo. Windowing limita significativamente o número de microvasos acessível para injeção e abordagens microcirúrgicas 8. Como resultado, apenas embriões podem ser manipulados e observação contínua não é possível. Início ex-ovo culturas usando placas de Petri eram de uso limitado por causa do controle inadequado da tensão superficial sobre o embrião impediu a cultura a longo prazo 9. Recentemente,...

<table><tbody><tr><td>Ovos férteis de galinha Leghorn branca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modelo GB1, Incubadoras Avery, Hugo CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel filme (Saran Wrap)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenços descartáveis Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elásticos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água morna estéril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copo plástico de 9 oz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm de diâmetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ar térmico 1602N</td><td>GQF Manufacturing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrana conjugada com fluoresceína (2 MDa, 1% p/v em solução salina tamponada com fosfato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetador</td><td>Glassworx, Inc, St Louis MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidro (0,75 mm de diâmetro interno)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Modelo M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia fluorescente</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Z20</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta fina nº 55</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fio cirúrgico de náilon 10-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo flexível</td><td>VWR international</td><td></td><td>1 mm de diâmetro externo</td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetador de 200 &amp;mu;L e ponteiras para pipeta</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um ex-ovo sistema de cultura de embriões de frango indicado para aplicações de imagem e microcirurgia

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Compreender as relações entre fatores genéticos e microambientais que a unidade normal e malformados desenvolvimento embrionário é fundamental para descobrir novas estratégias terapêuticas. Avanços na tecnologia de imagem têm permitido investigação quantitativa da organização e amadurecimento do plano do corpo, mas numa fase posterior morfogênese embrionária é menos clara. Embriões de galinha são um atrativo vertebrados sistema modelo animal para esta aplicação devido à sua facilidade de cultura e manipulação cirúrgica. Embriões podem ser cultivadas por um curto período em anéis de papel de filtro, que permite acesso óptico completo para padronização celular e 1,2 estudos destino. Estudar processos avançados de desenvolvimento, como a morfogênese cardíaca são tradicionalmente realizada através de uma janela da casca do ovo 3-5, mas esta técnica limita o acesso óptico devido ao tamanho da janela. Nós já desenvolveu um método simples para a cultura de todo o embrião ex-ovo no hexagonal pesar barcos para até 10 dias, o que permitiu imagens de alta resolução através de ultra-sonografia 6,7. Essas culturas foram difíceis de transportar, limitando os tipos de ferramentas de imagem disponíveis para experimentos ao vivo. Nós aqui apresentar um sistema de cultura melhorou shell-less com um custo-benefício, a câmara portátil ambiental. Os ovos estavam rachados em uma rede criada por uma membrana de poliuretano (filme plástico) aposta circunferencialmente para um copo de plástico parcialmente cheio com água estéril. As dimensões da circunferência ea profundidade da rede eram fundamentais para manter a tensão superficial, enquanto os mecânicos da rede e água abaixo ajudou amortecem as vibrações induzidas por transporte. A pegada pequena circulação banho de água também foi desenvolvido para permitir o controle de temperatura contínua durante a experimentação. Nós demonstramos a capacidade de cultura de embriões, desta forma, pelo menos, 14 dias sem defeito ou atraso morfogênicos e empregar este sistema em vários de microcirurgia e aplicações de imagem.

Neste artigo, apresentamos uma metodologia simples para ativar a longo prazo<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Cultura de embriões de aves. Esta técnica é ideal para a experimentação longitudinal exigindo acessibilidade óptico completo e / ou transporte estéril em embriões de aves.

Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia

Compreender as relações entre os fatores genéticos e microambientais que impulsionam o desenvolvimento embrionário normal e malformado é fundamental para...

No sistema de cultura de embrião de galinha X ovo, o preparo de culturas de embriões de pintinho em casca permite a investigação da embriogênese. O procedimento começa com a obtenção e incubação de ovos de galinha fertilizados a 37,5 graus Celsius por 72 horas. São preparadas redes para sustentar as gemas dos ovos com os embriões em desenvolvimento.Em seguida, as gemas dos ovos podem ser transferidas para redes, e a embriogênese continua fora da casca. Esta técnica pode ser aplicada para microinjeção na vasculatura, ultrassonografia e microcirurgia, e os resultados podem demonstrar como os embriões se desenvolvem em condições normais e alteradas. Olá, meu nome é Akshay Shaker e sou aluno de mestrado no laboratório de bioengenharia do desenvolvimento cardiovascular, coordenado por Jonathan Butcher, no Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade Cornell.E a principal vantagem da nossa técnica em comparação com métodos anteriores, como o cultivo de ovos in ovo, é que ela proporciona acesso óptico completo ao embrião, bem como facilidade de transporte sem danos. Olá, meu nome é Char Hin. Sou pesquisador pós-doutorando no Laboratório de Bioengenharia do Desenvolvimento Cardiovascular, Laboratório Jonathan Chu, do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade Cornell.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia do desenvolvimento, como o modo como defeitos cardíacos se desenvolvem durante a embriogênese. Antes de iniciar este procedimento, esterilize todos os materiais esfregando com etanol 70%. Para começar o procedimento, encha três quartos de um copo plástico de nove onças com água morna estéril.Repita para quantos copos forem necessários. Um copo comum de nove onças tem um diâmetro superior de oito centímetros, que é o tamanho mais adequado para a aplicação de cultura prolongada apresentada aqui. Em seguida, corte um pedaço de filme plástico com 20 centímetros de comprimento.Cubra a parte superior do copo plástico de nove onças cheio com água morna estéril com um pedaço de filme plástico aderente e use uma borracha para manter o filme no lugar. O filme plástico aderente é o mais apropriado para esta aplicação, pois evita a aderência da gema, o que pode resultar na ruptura da mesma. Durante o transporte, o plástico deve ser esticado de modo que toque a superfície da água.Corte o plástico excedente ao redor da faixa e limpe o plástico. Com lenços Kim umedecidos com etanol 70%, os hamacs estão agora prontos para acomodar os embriões. Ovos de galinha fertilizados podem ser armazenados a 13 graus Celsius por até cinco dias antes da incubação.Sem ativar o desenvolvimento, um refrigerador de vinho tinto pode manter essa temperatura para ter os ovos prontos para o cultivo. Ative o desenvolvimento do embrião incubando os ovos em posição única em uma incubadora com umidade constante de 60% com movimento contínuo a 37,5 graus Celsius por 72 horas. Quando os ovos estiverem prontos, remova-os da incubadora.Sterilize os ovos esfregando-os com lenços Kim embebidos em etanol 70%. Coloque os ovos horizontalmente de lado em uma cartela de ovos por um a dois minutos para uma adequada posicionamento do embrião. Trabalhe com no máximo seis ovos por vez, pois tentar quebrar mais de seis ovos simultaneamente.Pode resultar em manter a temperatura ambiente de saída por tempo excessivo, o que pode afetar a viabilidade. Ao final de um a dois minutos, o embrião deslizou para o topo do ovo. Para transferir cada embrião para uma rede, trabalhe assépticamente em uma cabine de fluxo laminar.Primeiro, quebre suavemente a parte inferior do ovo usando uma borda afiada, como a borda de um balde metálico ou um béquer de vidro. Lembre-se de que o embrião está no lado superior. Separe suavemente as duas metades da casca do ovo puxando para os lados com os dois polegares.Em seguida, coloque o embrião, a gema e o albúmen sobre a rede. O albúmen fornece um ambiente úmido ao redor da gema, absorvendo choques provocados pelo movimento do sistema. O albúmen também fornece nutrição ao embrião durante o longo período de cultura.Se a transferência do embrião for realizada corretamente, o embrião já deverá estar posicionado na parte superior. Caso o embrião esteja na parte inferior, utilize uma tesoura pequena de pontas arredondadas ou outro instrumento rombo semelhante para esfregar a gema, fazendo com que ela gire sobre si mesma e o embrião se desloque para o topo. Se for necessário cultivar os embriões além do sétimo dia embrionário, espalhe pedaços triturados de casca de ovo ao redor da periferia do embrião como fonte de cálcio para o desenvolvimento e maturação óssea.Após a transferência do embrião ser concluída, coloque uma placa de Petri com diâmetro de 10 centímetros em cima do copo para selar o embrião. Coloque o rede no incubador regulado para 37,5 graus Celsius. Se um incubador portátil for utilizado, coloque um ou dois copos de nove onças cheios de água dentro do incubador também.Para manter a umidade em aproximadamente 60%, os embriões continuam a se desenvolver e podem ser utilizados para microinjeção em aplicações de microcirurgia. Este cultivo de embriões é adequado para aplicações de microinjeção nas quais soluções precisam ser injetadas na vasculatura. Primeiro, prepare o aparelho de injeção começando pelas agulhas, utilizando uma técnica de microforja, puxando capilares de vidro para formar microsseringas com ponta biselada.O tamanho da ponta depende da taxa de fluxo desejada. Conecte a seringa com microagulha a um tubo de silicone com diâmetro interno de 0,03 polegadas. Carregue o tubo da seringa com uma solução a ser injetada e conecte a microagulha da seringa ao tubo.Coloque a microneedle no micromanipulador e na seringa ou suporte para seringa, ou bomba de infusão. Uma vez que o conjunto de injeção esteja pronto, recupere os embriões. A penetração horizontal da agulha é necessária para a entrada adequada da agulha em um vaso sanguíneo, como um vaso vital.O embrião, portanto, precisa estar no mesmo nível das bordas do copo que o contém. Para elevar o embrião, remova a borracha que prende a película plástica que o suporta. Levante suavemente um lado da película plástica e adicione um pouco de água ao copo sem mover muito o embrião.Em seguida, coloque novamente o elástico sobre o plástico. Agora que o embrião está elevado, a solução pode ser injetada em um vaso embrionário. Observe que, ao injetar em um vaso vital, o tamanho da micropipeta precisa ser aproximadamente um décimo do diâmetro do vaso.Para manter uma perfusão eficiente sem causar sangramento, primeiramente, bombeie a solução para dentro da microagulha de modo que não fique ar aprisionado no interior. Em seguida, alinhe a ponta da microagulha com um vaso selecionado para vasos vitais. A seleção de uma área fornece a área máxima para direcionamento ao vaso.Uma vez definida a área de injeção, empurre a agulha em direção ao vaso. O vaso primeiro retrai. Assim que a agulha penetrar e a perfusão for iniciada, a cor do sangue em fluxo muda com a perfusão.Se a mudança de cor não for observada, a agulha pode ter atravessado o vaso. Nesse caso, retire lentamente a micropipeta enquanto simultaneamente bombeia a solução até que uma mudança de cor seja visível no vaso. Quando a perfusão estiver completa, retire suavemente a micropipeta do vaso. Este cultivo de embrião também é adequado para aplicações de microcirurgia, como a ligadura do átrio esquerdo, que é realizada no quarto dia de incubação.Primeiro, prepare os nós a serem utilizados com diâmetro de 0,5 milímetro a partir do fio cirúrgico de náilon 10-0. Usando pinças finas, remova as membranas coriônica e amniótica do embrião. Levante o embrião pela parte traseira e gire-o verticalmente de modo que o lado esquerdo do embrião fique agora na parte superior e acessível.Em seguida, remova o pericárdio sobre o átrio esquerdo. Alinhe o nó sobre o átrio esquerdo e aperte-o segurando e puxando pelas laterais com pinça. O nó deve ser feito de forma a obstruir aproximadamente 75% do fluxo sanguíneo original para o lado esquerdo. Corte as extremidades do nó com tesoura microcirúrgica e remova cuidadosamente o excesso de fio de sutura, descartando-o.Finalmente, gire o embrião de volta para sua orientação original, com o lado direito voltado para cima. Aqui são mostrados embriões em diferentes estágios cultivados ex ovo, conforme demonstrado; um aquecedor de circulação de água pode manter as condições ambientais por períodos prolongados, o que pode ser necessário durante aplicações de imageamento e microcirurgia.Os embriões de pintinho cultivados X ovo são adequados para microinjeção. Neste experimento, um corante fluorescente foi injetado na vasculatura de um embrião de pintinho cultivado X ovo. Os embriões de pintinho cultivados X ovo são adequados para microcirurgia.Neste experimento, foi realizada a ligadura do átrio esquerdo em um embrião de galinha cultivado ex ovo. Após dominar a técnica, o cultivo de embriões de galinha ex ovo pode ser realizado em cerca de cinco minutos por embrião. Após assistir a este vídeo, o espectador deverá compreender bem como criar culturas de embriões de galinha XO adequadas para aplicações de microcirurgia e imageamento, especialmente quando o transporte das culturas for necessário.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra nova cultura, um método pelo qual embriões de galinha são cultivadas fora do ovo por até 24 horas. Este método permite o estudo do desenvolvimento inicial (linha primitiva para 14 som.), Um período correspondente ao E7-9 no mouse. Aplicações desta técnica incluem eletroporação, hibridização in situ e imunohistoquímica.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

O filhote corioalantóicas membrana (CAM) é único, um ambiente de cultura naturalmente imunodeficientes apoio para estudar a angiogênese e tumorigênese. Este artigo vídeo demonstra as diferentes etapas no...

Pintinho Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM Ensaio: como ele realmente funciona

Este vídeo demonstra a cultura ex vivo e a imagem de fatias oculomotoras de embriões de camundongos transgênicos. Os embriões são isolados e incluídos em agarose. Usando um vibratome, são obtidas fatias contendo os núcleos oculomotores e os olhos. As fatias são mantidas em cultura e fotografadas usando um microscópio de fluorescência.

Cultura ex vivo e imagem de fatias oculomotoras de embriões de camundongos transgênicos

Cultura de lâminas de facilitar a manipulação do gene de desenvolvimento do embrião e perturbações farmacológicas. No entanto, as condições de cultura devem assegurar que o desenvolvimento normal pode prosseguir dentro do ambiente reduzido da fatia. Ilustramos um protocolo que facilita o desenvolvimento normal, medula espinhal prosseguir durante pelo menos 24 horas.

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Visualizar e acessar o embrião de galinha durante o desenvolvimento pode ser um desafio. Desenvolvemos um método ex ovo que é simples, econômico e pode ser facilmente usado em sala de aula ou ambiente de pesquisa. Este método fornece acesso ao embrião em estágios finais do desenvolvimento embrionário (HH 40).

Otimizado Ex-ovo A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Aqui, apresentamos uma nova técnica para cultivar embriões de galinha ex ovo para imagens de lapso de tempo usando luz transmitida e microscopia de fluorescência. O sanduíche de papel de filtro submerso é uma variante da técnica de suporte de papel de filtrobem estabelecida 1 que permite a cultura de embriões de pintinhos totalmente submersos em um meio de cultura líquido.

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo Ex Ovo Imagem Time-lapse de galinha precoce embriões

Este protocolo descreve três métodos sobre como obter e usar embriões de frango de 5 a 8 dias de idade e sua membrana corioalantóica (CAM) como um modelo in vivo para estudar imagens de ultrassom com contraste e entrega de drogas mediadas por microbolhas.

A preparação de embriões de frango ex ovo e vasos de membrana corioalantóica como modelo in vivo para imagens de ultrassom com contraste e estudos de liberação de drogas mediados por microbolhas

O objetivo geral deste artigo é descrever como se apresentar na injeção intracelular ovo de materiais exógenos em embriões de frango. Essa abordagem é muito útil para estudar a biologia do desenvolvimento de embriões de frango.

Em Ovo Injeção intravascular em embriões de frango

Este protocolo foi desenvolvido para monitorar longitudinalmente as propriedades mecânicas do tecido da placa neural durante a neurulação embrionária de pintinhos. Baseia-se na integração de um microscópio Brillouin e um sistema de incubação no estágio, permitindo imagens mecânicas ao vivo do tecido da placa neural em embriões de pintinhos cultivados ex ovo .

Monitoramento da Evolução Mecânica do Tecido Durante o Fechamento do Tubo Neural de Embrião de Pintinhos

Aprenda a cultivar embriões de galinha ex-ovo para estudos de embriologia e biologia do desenvolvimento. Este método permite acesso óptico completo, microinjeção vascular e microcirurgia em embriões de Gallus gallus.

Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia

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