Assaying atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e sono Parâmetros em Drosophila

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar fenótipos circadianos e do sono em drosófila por meio da análise dos ritmos diários de atividade locomotora. Isso é alcançado gerando moscas transgênicas, obtendo mutantes específicos ou realizando os cruzamentos necessários para preparar os animais experimentais. Como segundo passo, é necessário preparar tubos de atividade de vidro contendo uma fonte alimentar, que servirão como habitat das moscas durante o experimento.

Em seguida, moscas com um a cinco dias de idade são colocadas em tubos de atividade, que são inseridos nos monitores de atividade DAM para acompanhar os ritmos de atividade locomotora. Utilizando o sistema DAM, obtêm-se resultados que revelaram defeitos e variações nos parâmetros circadianos e de sono, com base na análise dos ritmos diários de atividade locomotora por meio de softwares como far sex e insomniac. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia circadiana, tais como quais proteínas e mecanismos regulatórios estão envolvidos na geração de ritmos adequados, e por exemplo, como fatores ambientais como luz e temperatura modulam os ritmos comportamentais por meio de vias moleculares específicas.

O sistema de monitoramento da atividade locomotora envolve diversos equipamentos, como dispositivos especializados de monitoramento, incubadoras ambientais com capacidade de controle diurno de luz, dispositivos de coleta de dados, computadores e materiais periféricos, como fiação. Escolha um ambiente escuro com controle de temperatura bem ventilado para acomodar o sistema de monitoramento da atividade locomotora, a fim de evitar sobrecarga excessiva nas incubadoras e possíveis falhas na manutenção da temperatura. Sela-se o ambiente contra fontes externas de luz dentro da sala escura. Não é necessário trabalhar completamente no escuro, pois o sistema circadiano das moscas-das-frutas não é sensível à luz infravermelha.

Portanto, nos casos em que precisamos enxergar em salas escuras, basta usar uma lanterna comum coberta com um filtro vermelho adquirido separadamente, juntamente com uma unidade de reserva de energia ininterrupta que tenha capacidade de potência suficiente para alimentar os componentes do sistema de monitoramento de atividade. Em caso de pico de tensão ou falha de energia no edifício, conecte a unidade de reserva de emergência (UPS) ao circuito de energia de emergência do edifício, se disponível. Se o sistema que controla a iluminação no incubador não for regulado diretamente pelo incubador, então é suficiente ligar o incubador à energia de emergência sem um UPS, pois a perda de energia por alguns segundos não afetará a temperatura da câmara.

Em seguida, configure um computador, PC ou Macintosh, totalmente dedicado à coleta de dados ou ao controle dos incubadores. Organize manualmente a rede de linhas telefônicas de forma ordenada ao redor das prateleiras dos incubadores com controle ambiental, para facilitar a conexão e desconexão dos monitores de atividade. Configure várias linhas telefônicas de modo que converjam em uma linha principal e se estendam para fora do incubador a fim de se conectarem ao computador; conecte os dispositivos de monitoramento dentro dos incubadores ao computador por meio de uma unidade de interface de fonte de alimentação, que tem a função de fornecer energia ao monitor de atividade através da linha telefônica.

Por fim, cubra possíveis fontes de luz provenientes de LEDs de dispositivos eletrônicos ou de uma porta de incubadora mal vedada com fita adesiva ou pano preto. Para garantir que os ritmos livres sejam medidos na ausência de luz indesejada. É fundamental avaliar esses fenótipos utilizando animais controle apropriados, criados nas mesmas condições ambientais e da mesma idade.

Além disso, existe dimorfismo sexual na ritmicidade circadiana. A prática geral é utilizar moscas machos adultas para esses ensaios, criadas a 25 graus Celsius e com idade entre um e cinco dias, pois a atividade de postura de ovos em moscas fêmeas afetará a medição real da atividade locomotora. Ao examinar os parâmetros circadianos e de repouso-sono de moscas mutantes específicas de interesse, é aconselhável cruzar a linhagem mutante com a linhagem selvagem de mesma origem genética.

Por exemplo, W 1118 ou yw. Como não há permuta genética em machos de drosófila, é preferível realizar o cruzamento cruzando fêmeas mutantes com machos selvagens, semeando simultaneamente o controle selvagem e as moscas mutantes. Em alimento padrão para drosófila por cerca de 10 a 14 dias antes do experimento de ritmo de atividade locomotora, após a eclosão da prole, colete moscas machos com idade entre um e cinco dias e reserve-as para serem usadas nos experimentos.

Os tubos de atividade representam o habitat da mosca. Durante o experimento, são tubos de vidro finos de cinco milímetros que contêm substância alimentar em uma extremidade e são tampados com lã ou uma tampa de plástico na outra extremidade. É preferível utilizar tubos de atividade recém-preparados.

Eles geralmente são preparados alguns dias até uma semana antes de iniciar o experimento. Como os tubos de atividade de vidro podem ser reutilizados várias vezes, os procedimentos de preparação a seguir descrevem o uso de tubos de atividade previamente utilizados e não limpos como ponto de partida. Se você estiver usando tubos de atividade novos, basta pular para a autoclavação dos tubos conforme mostrado mais adiante.

Retire as tampas dos tubos de atividade usados e coloque-os em um béquer de vidro grande. Os tubos devem preencher apenas até a metade do béquer. Encha o béquer com água da torneira, certificando-se de submergir completamente os tubos.

Coloque o béquer cheio de tubos de vidro no micro-ondas até que a água entre em ebulição rápida completa. Para derreter a cera e o meio de ágar, tenha cuidado, pois a água estará quente. Retire o béquer do micro-ondas e mexa os tubos com uma espátula ou objeto plástico.

Pipeta de 10 milímetros para permitir que a cera aprisionada suba até o topo. Em seguida, repita a etapa de aquecimento no micro-ondas. Retire o béquer do micro-ondas e aguarde esfriar.

Colocar o béquer na câmara fria acelerará o processo. À medida que a água esfria, a cera se acumulará na superfície da água e solidificará gradualmente. Remova a cera solidificada manualmente.

Isso deve remover a maior parte da cera dos tubos. Transfira os tubos de atividade para um novo béquer com água da torneira fresca e repita o processo de micro-ondas e remoção de cera. Como a maior parte da cera já foi removida na etapa anterior, não é necessário esperar a cera solidificar.

Basta verter a água para fora do béquer e transferir os tubos para um novo béquer. Tenha cuidado, pois a água ainda está quente. Repita o processo de micro-ondas pela última vez.

Despeje a água fora do béquer e aguarde os tubos de atividade esfriarem. Em seguida, coloque os tubos de atividade verticalmente em béqueres de vidro de 250 mililitros ou 500 mililitros. Certifique-se de que não estejam empacotados em excesso.

Sterilize-os utilizando uma autoclave com ciclo de secagem ou simplesmente seque os tubos em uma estufa de secagem para preparar o alimento a ser colocado nos tubos de atividade. Prepare uma solução de 5% de sacarose e 2% de bacto-ágar em água destilada ou da torneira e autoclave a solução. O alimento autoclavado pode ser usado imediatamente ou armazenado a quatro graus Celsius por um período prolongado.

Idealmente, o alimento deve estar a cerca de 65 graus Celsius ao encher os tubos de atividade. Use uma pipeta de 10 mililitros para pipetar a solução líquida de alimento ao longo da parede interna do béquer de vidro, enchendo os tubos até um terço da altura, a partir da base. Gire suavemente o béquer para garantir que todos os tubos sejam preenchidos de maneira uniforme com a solução de alimento.

Aguarde a completa solidificação do alimento em temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius. Assim que a condensação no interior dos tubos de vidro desaparecer, os tubos poderão ser removidos do béquer. Para retirar os tubos de atividade do béquer, empurre os tubos em direção ao fundo do béquer e, ao mesmo tempo, gire-os, de modo que o alimento solidificado no interior dos tubos se separe do fundo do béquer.

Retire os tubos do béquer, de preferência como um único grupo. Em seguida, limpe os tubos um a um com toalhas de papel para remover o excesso de meio presente na superfície externa dos tubos. Coloque os tubos de lado em um recipiente limpo.

Utilize um aquecedor de bloco de laboratório geral sem o suporte para tubos e cubra cuidadosamente o orifício de aquecimento. Com várias camadas de folha de alumínio resistente, adicione pelotas de parafina ao orifício de aquecimento forrado com alumínio para derreter. Segure os tubos na extremidade não alimentícia e mergulhe a extremidade alimentícia na cera derretida. Mergulhe a porção com cera em um béquer de vidro contendo água fria para acelerar a solidificação da cera. Repita.

Uma vez que mergulhar os tubos de cera na água impedirá que eles grudem uns nos outros. Os tubos podem ser usados imediatamente ou armazenados em um recipiente hermético a quatro graus Celsius para uso posterior. Após uma semana, o armazenamento prolongado provocará secagem excessiva do alimento.

Se os tubos forem armazenados a quatro graus Celsius, aqueça-os até a temperatura ambiente deixando-os sobre a bancada antes do uso. Antes de carregar as moscas nos tubos de atividade, ligue os incubadores que serão utilizados para acomodar os monitores de atividade. Ajuste a temperatura usando os controles do incubador e configure o regime claro-escuro usando o controlador de luz do sistema DAM ou o sistema de controle de luz do próprio incubador, de acordo com o delineamento experimental desejado.

Em seguida, anestesie as moscas com dióxido de carbono. Depois, utilizando um pincel fino, transfira cuidadosamente uma única mosca para um tubo de atividade. Com pinças finas, segure o centro de um pedaço de barbante com cerca de meio centímetro de comprimento e insira o barbante na extremidade do tubo de atividade oposta à comida, tampando a abertura para impedir que a mosca escape durante o experimento.

Ao mesmo tempo em que permite a entrada de ar no tubo, mantenha o tubo deitado de lado até que a mosca acorde. Para evitar que a mosca fique presa ao alimento, insira os tubos nos monitores de atividade. Com o modelo mais novo e compacto dos monitores Tri Kinetics, é necessário segurar os tubos no lugar com elásticos para garantir que o feixe de infravermelho atravesse o tubo na posição central. Por fim, coloque os monitores de atividade nos incubadores e conecte-os ao sistema de coleta de dados por meio dos cabos telefônicos para verificação.

Utilizando o software de coleta do sistema DAM, verifique se todos os monitores estão corretamente conectados e se os dados estão sendo coletados de cada um deles. Agora que as moscas foram inseridas nos tubos de atividade e o sistema de monitoramento da atividade locomotora está pronto, os dados podem ser registrados. As moscas são sincronizadas e adaptadas mediante exposição ao regime desejado de luz, escuro ou LD e temperatura por dois a cinco dias completos.

A condição de sincronização mais comumente utilizada é um ciclo claro-escuro de 12 horas de luz e 12 horas de escuro a 25 graus Celsius. Para o estudo de ritmos circadianos em relação a este protocolo, o momento em que as luzes acendem no incubador é definido como o tempo Zeite GABA zero, e todos os demais momentos são relativos a esse valor. Sob condições padrão de 12:12 LD, drosófilas melanogaster tipicamente exibem dois períodos de atividade: um centrado em torno de ZT zero, denominado pico matinal, e outro em torno de ZT 12, denominado pico vespertino. Os ritmos de atividade locomotora em livre corrida são medidos sob condições constantes de escuro e temperatura, após o período de sincronização.

O ajuste do ciclo de luz pode ser alterado a qualquer momento na fase escura no último dia de ld, de modo que o dia subsequente do experimento represente o primeiro dia de dd. A coleta de dados durante sete dias de DD é suficiente para calcular o período circadiano e a amplitude ou intensidade do ritmo das moscas. De modo geral, um tamanho de amostra de pelo menos 16 moscas é necessário para obter períodos livres confiáveis para um determinado genótipo.

No final do experimento, os dados binários brutos coletados usando o software do sistema DAM são baixados em um dispositivo portátil de armazenamento de dados. Por exemplo, uma chave USB. Os dados binários brutos são processados usando o DAM file scan 1 0 2 x e somados em intervalos de 15 e 30 minutos ao analisar parâmetros circadianos ou em intervalos de um a cinco minutos ao analisar o sono.

Parâmetros de repouso. Atualmente, cinco minutos contíguos de inatividade são a definição padrão de repouso associado ao sono em drosófila. Após a conclusão deste protocolo, pode-se utilizar o mesmo conjunto de dados para comparar os parâmetros circadianos e de sono dos animais experimentais e controle quanto aos parâmetros circadianos.

Gráficos de atividade ilustrando as atividades locomotoras diárias ou as atividades médias de moscas ao longo de vários dias em condições LD ou DD podem ser gerados usando fast x oph. Drosophila melanogaster geralmente exibe dois períodos de atividade, um centrado em torno do ZT zero, denominado pico matinal, e outro em torno do ZT 12, denominado pico vespertino. Esses dois períodos de atividade são controlados pelo relógio endógeno e podem ser observados mesmo em condições de livre corrida (DD). Alterações no momento desses picos de atividade podem ser facilmente observadas em gráficos de atividade e podem indicar uma mudança nas propriedades do relógio endógeno.

Outra propriedade que indica o funcionamento adequado do relógio biológico é o aumento antecipatório da atividade locomotora observado em ciclos LD, que ocorre antes das transições reais de escuro para luz ou de luz para escuro. Esse comportamento é claramente observado em moscas do tipo selvagem, mas está ausente e arrítmico em mutantes per zero. Nesse mutante.

Os picos matutinos e vespertinos observados no LD são meramente respostas de susto devido a mudanças bruscas nas condições de luz e escuridão. As moscas sem relógio não antecipam mudanças ambientais, mas simplesmente reagem a elas. A perda da ritmicidade comportamental é muito mais acentuada em DD e geralmente se manifesta pela perda total dos picos matutinos ou vespertinos de atividade locomotora, como observado nas moscas per zero.

Além dos gráficos de indução, os dados de atividade locomotora podem ser representados como um gramado duplo para cada mosca individual ou genótipo de mosca, em que dois dias de dados são plotados sequencialmente em cada linha, mas o perfil do último dia inicia a próxima linha com dois dias de atividade. Por exemplo, LD um e dois são plotados na primeira linha do gramado ACTO. A próxima linha começa com uma repetição de LD dois, seguida por LD três, e assim por diante.

Seguindo este formato, os dados de atividade locomotora que abrangem todo o experimento são ilustrados no actograma. Uma vantagem dos actogramas em relação aos gráficos de redução é que uma alteração no comprimento do período da atividade diária é facilmente observável, além da geração de gráficos de indução e actogramas.

Dados de atividade locomotora da condição DD podem ser submetidos ao far X para calcular o comprimento do período usando diversos programas, incluindo o cycle P para análise de parâmetros de sono e repouso, definido como cinco minutos contíguos de inatividade. Pode-se analisar dados registrados a partir de ensaios de atividade locomotora e examinar múltiplos parâmetros de sono usando o insomniac, um programa baseado em MATLAB; o percentual de tempo que as moscas passam dormindo pode ser calculado em diferentes intervalos de tempo. Por exemplo, o percentual de sono a cada hora ou a cada 12 horas.

Outros parâmetros de sono mais comuns que podem ser examinados incluem o comprimento médio dos períodos de repouso, que é uma medida do quão consolidado é o sono e pode ilustrar a qualidade do sono. Outro parâmetro é a contagem de atividade durante a vigília, que é uma medida da taxa de atividade quando as moscas estão acordadas. Esse parâmetro ajuda a diferenciar entre moscas que são verdadeiramente afetadas no sono e nos comportamentos de repouso, em comparação com aquelas que estão doentes ou hiperativas.

Por exemplo, moscas que estão simplesmente doentes podem parecer dormir mais porque não são tão móveis. Para essas moscas, a atividade de vigília será menor em relação aos animais controle. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como caracterizar fenótipos circadianos e de sono em *Drosophila* por meio de ensaio. Ritmos diários de atividade locomotora.