Name: Isolamento de Valvular Células Endoteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais valvulares de válvulas aórticas usando colagenase e swab de algodão. Este protocolo permite obter populações puras para estudos de biologia cardiovascular e funções celulares específicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Esta pesquisa é apoiada pela concessão de CARREIRA NSF, a Fundação Hartwell, e da American Heart Association (# 0830384N).

1. Preparação <ol><li> Autoclave em um instrumento coberto bandeja os seguintes itens: <ol><li> Pinça serrilhada - Para manuseio do tecido folheto </li><li> Tesoura de tecido (8 cm) - Para corte de tecido e folheto cúspides </li><li> Cotonetes de algodão - Para isolar a camada endotelial do folheto ou cúspide </li></ol></li><li> Fazer a solução de colagenase estéril <ol><li> Adicionar 4,0 gramas de pó DMEM para 250 mL de água de 18 mohms. </li><li> Adicionar 1,11 gramas de bicarbonato de sódio. </li><li> Add (600 U / mL) 180.000 unidades de colagenase. </li><li> Adicionar 1% (3 mL) Penicilina / Estreptomicina. </li><li> Ajustar o pH da solução para 7,2. </li><li> Levar a solução até 270 mL. </li><li> Esterilizar a solução, passando por um filtro de 0,2 mm. </li><li> Adicionar 10% (30ml) de soro fetal bovino estéril. </li></ol></li><li> Faça médio de células endoteliais estéril <ol><li> Adicionar 6,7 gramas de pó DMEM para 400 mL de água de 18 mohms. </li><li> Adicionar 1,85 gramas de bicarbonato de sódio. </li><li> Adicionar (50 U / mL) 25.000 unidades de heparina. </li><li> Adicionar 1% (5 mL) Penicilina / Estreptomicina. </li><li> Ajustar o pH da solução para 7,2. </li><li> Levar a solução até 450 mL. </li><li> Esterilizar a solução, passando por um filtro de 0,2 mm. </li><li> Adicionar 10% (50 ml) de soro fetal bovino estéril. </li></ol></li><li> Faça médio de células estéreis intersticial <ol><li> Adicionar 13,37 gramas de pó DMEM para 800 mL de água de 18 mohms. </li><li> Adicionar 3,7 gramas de bicarbonato de sódio. </li><li> Adicionar 1% (10 ml) Penicilina / Estreptomicina. </li><li> Ajustar o pH da solução para 7,2. </li><li> Levar a solução até 900 mL. </li><li> Esterilizar a solução, passando por um filtro de 0,2 mm. </li><li> Adicionar 10% (100 mL) de soro bovino estéril. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento dos folhetos da válvula cardíaca <ol><li> A raiz da aorta especiais de consumo imediato e de forma asséptica do coração após o sacrifício. </li><li> Lave bem a raiz da aorta de sangue com o frio DPBS estéril. É imperativo para remover todos os componentes do sangue o mais rapidamente possível para limitar o VEC morte e contaminação bacteriana. Antibióticos e antimicóticos não são aconselhados, nesta fase, uma vez que são potencialmente prejudiciais para o VEC. </li><li> Isolar folhetos da válvula (3 por válvula) diretamente a partir da raiz e coloque em um tubo cônico 15 mL estéril preenchida com 12 mL DPBS frio. Agite várias vezes para remover os resíduos e reabastecer com DPBS fresco. </li><li> Transporte para o laboratório em gelo. </li><li> À chegada ao laboratório, colocar o recipiente com o tecido sob o capô estéril. </li></ol> 3. Isolamento da camada endotelial <ol><li> Encha um prato estéril 35mm com 3 mL de solução de colagenase frio por válvula (3 folhetos). </li><li> Coloque todos os três folhetos do tubo de 15 mL para o prato cheio com a solução de colagenase. </li><li> Incubar o tecido por 5-10 minutos a 37 ° C. </li><li> Remover suavemente a camada endotelial girando um algodão estéril e seco sobre a superfície do folheto. O sentido de rotação ea quantidade de cisalhamento aplicada é crítica para a pureza de sua amostra. A rotação da haste deve ficar em uma direção oposta ao movimento linear de sua mão criando uma tesoura controlada. Este corte é o que levanta a células endoteliais do tecido. A quantidade de força aplicada deve ser suficiente para sentir a resistência do tecido, mas, não penetram na membrana basal. </li><li> Ocasionalmente, dab o swab dentro da solução de colagenase para desalojar as células das fibras ponta. Depois de esfregar está completa, a textura da camada endotelial deve se sentir um pouco mais suave do que antes. </li><li> Recolher a suspensão de células / colagenase e transferir para um tubo estéril nova 15mL. </li><li> Centrifugar os tubos a 1000 rpm por 5 minutos para sedimentar as células isoladas e aspire o sobrenadante. Se isolar células intersticiais, bem como, realizar esse protocolo, enquanto essas células estão sendo centrifugado. </li><li> Adicionar 3 ml de meio de suínos endoteliais para os 15 tubos mL, centrifugar uma segunda vez, e mídia aspirar. Esta segunda centrifugação ajuda a filtrar alguns dos materiais indesejáveis, tais como fibras de ponta. </li><li> Re-suspender as células endoteliais centrifugadas em 5 mL de meio de suínos endoteliais e placa de as células em um pré-revestido frasco de T-25 com colágeno (use um frasco por tubo de centrifugação). </li><li> Permitir que as células crescer pelo menos 2-3 dias antes de mudar o meio endoteliais. Isto ajuda a recuperar as células e dividir uma vez que o processo de isolamento é bastante dura eo rendimento das células pode ser baixo. É fundamental para as células passagem perto confluência vez que a inibição de contato pode levar à transformação celular. </li></ol> 4. Preparação de 60 Dish Cultura mm para isolamento específico Side <ol><li> A linha de 60 mm de vidro placas de Petri com papel de alumínio (2 pratos de vidro por leaflet). A folha de alumínio ajuda a remover a parafina, de modo que a placa de Petri de vidro pode ser reutilizado para outros isolamentos. </li><li> Lugar contas de parafina dentro dos pratos, cerca de metade cheio, e cobertura para autoclave. </li><li> Uma vez que a autoclave é completo e de parafina é derretida, mova o ensemble prato para uma superfície fria plana. Como a parafina esfria, ele vai endurecer e criar uma camada que irá apoiar punções de agulha. </li><li> Após 30 minutos, o prato esterilizado pode então ser usado como uma câmara de isolamento para imobilizar o tecido folheto. </li></ol> 5. Isolamento de camada específica Side endotelial <ol><li> Remove os folhetos dos tubos 15mL e coloque no prato de cultura preparado 60mm para isolamento específico lado. </li><li> Manipular o folheto de modo que o lado ventricularis é a face para baixo sobre a superfície de parafina deixando o lado fibrosa expostos. Pin das bordas do folheto para expor a camada endotelial. </li><li> Coloque algumas gotas de colagenase frio em cada superfície (para cima-facing) e incubar endoteliais do tecido por 5-10 minutos a 37 ° C. </li><li> Como antes, remover suavemente a camada endotelial girando um algodão estéril e seco sobre a superfície do folheto. O sentido de rotação ea quantidade de cisalhamento aplicada é crítica para a pureza de sua amostra. A rotação da haste deve ficar em uma direção oposta ao movimento linear de sua mão criando uma tesoura controlada. Este corte é o que levanta a células endoteliais do tecido e nada mais. A quantidade de força aplicada deve ser suficiente para sentir a resistência do tecido, mas, não penetram no tecido. </li><li> Ocasionalmente, dab o swab dentro da solução de colagenase para desalojar as células das fibras ponta. Depois de esfregar está completa, a textura da camada endotelial deve se sentir um pouco mais suave do que antes. </li><li> Recolher a suspensão de células / colagenase e transferir para um tubo estéril nova 15mL. Indicam especificidade lado na etiqueta (folhetos da válvula mesmo pode ser agrupados). </li><li> Transferir os folhetos para um prato nova cultura para que o lado ventricularis está agora exposta e repita os passos (5,3-5,6). </li><li> Uma vez que todos suspensão celular / colagenase é coletado, centrifugar os tubos a 1000 rpm por 5 minutos para sedimentar as células isoladas e aspire o sobrenadante. Se isolar células intersticiais, bem como, realizar esse protocolo, enquanto essas células estão sendo centrifugado. </li><li> Adicionar 3 ml de meio de suínos endoteliais para os tubos, centrífuga uma segunda vez, e aspire mídia. Esta segunda centrifugação ajuda a filtrar alguns dos materiais indesejáveis, tais como fibras de ponta. </li><li> Re-suspender as células endoteliais centrifugadas em 5 mL de meio de suínos endoteliais e placa de as células em um pré-revestido frasco de T-25 com colagem (use um frasco por tubo de centrifugação). </li><li> Permitir que as células crescer pelo menos 2-3 dias antes de mudar o meio endoteliais. Isto ajuda a recuperar as células e dividir uma vez que o processo de isolamento é bastante dura. Se você observar o rendimento ser muito baixa, considerar a mudança para um pequeno frasco ou placa bem desde a adesão célula-célula promove o crescimento celular. Lembre-se de passagem perto confluência vez que a inibição de contato pode levar à transformação celular. </li></ol> 6. Isolamento de células intersticiais <ol><li> Encha um tubo de centrifugação estéril 15 mL com 10 mL de solução de colagenase por válvula (3 folhetos). </li><li> Depois de esfregar os folhetos de células endoteliais, imediatamente colocá-los no tubo apropriado 15mL com a solução de colagenase. </li><li> Incubar por aproximadamente 12 a 18 horas (agitar suavemente se desejar). </li><li> Misture delicadamente o tecido degradadas com uma pipeta sorológica, até suspensão de células / colagenase fica homogeneizado. Esta homogeneização ajuda a quebrar o tecido e liberar as células intersticiais. </li><li> Centrifugar o tecido digerido por 5 minutos a 1000 rpm e aspire o sobrenadante. </li><li> Adicionar 5 mL de médio suína intersticial para os tubos de 15mL, centrífuga uma segunda vez, e aspire sobrenadante. </li><li> Re-suspender as células endoteliais centrifugadas em 5 mL de meio de suínos intersticial e placa de as células em um T-75 frasco (use um frasco por tubo de centrifugação). </li><li> Permitir que as células crescer pelo menos 1-2 dias antes de mudar o meio de célula intersticial. Haverá restos de tecido muito mais do que com as células endoteliais, mas, que é esperado. As células também deve crescer a confluência mais rápido que as células endoteliais por causa do rendimento das células e sua natureza. </li></ol> 7. Imagens representante <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A morfologia das células isoladas em 2-3 dias após o isolamento. (A) VEC apresentam uma morfologia típica endoteliais e formar grupos para promover o crescimento. (B) VIC morfologia é semelhante a miofibroblastos que geralmente são fusiformes e espalhe uniformemente em todo o frasco. <pclass src="/files/ftp_upload/2158/2158fig2.jpg" alt="Figura 2"></pclass> Figura 2. A morfologia das células isoladas na confluência. (A) VEC apresentam uma morfologia típica endoteliais que geralmente são de paralelepípedos e contactar o crescimento inibido. (B) VIC morfologia é semelhante a miofibroblastos que geralmente são fusiformes e não contato com crescimento inibido. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. As características da função de células isoladas 6. (A) VEC estão associados com altos níveis de captação de LDL acetilada (vermelho). (B) VIC estão associados com baixos níveis de captação de LDL acetilada. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Marcadores celulares de células isoladas 6. (A) fenótipo VEC é contribuído para coloração positiva para o Fator de Von Willebrand (verde), azul (núcleos). (B) é o fenótipo VIC contribuiu para coloração negativa de Von Willebrand. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Marcadores celulares de células isoladas. (A) fenótipo VEC é contribuído para coloração negativa para alfa-SMA (verde), azul (núcleos). (B) é o fenótipo VIC contribuiu para coloração positiva para a SMA alpha. <table border="1"><tbody><tr><td> Dissociação Agent </td><td> Dissociação Técnica </td><td> Coleta de célula </td><td> Quantidade de células </td><td> Célula Pureza </td><td> Contaminação </td></tr><tr><td> EDTA (3mm) sem CaCl 2 </td><td> 5, 20, 60 min. antes disso CaCl 2 </td><td> 20, 60, 120 min. antes da coleta </td><td> - </td><td> + / - </td><td> + + + </td></tr><tr><td> EDTA (6mm) sem CaCl 2 </td><td> 5, 20, 60 min. antes disso CaCl 2 </td><td> 20, 60, 120 min. antes da coleta </td><td> + / - </td><td> + </td><td> + + + </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,5 g / L) </td><td> 5, 10, 15 min. antes de desactivação </td><td> Médias coletadas imediatamente </td><td> + </td><td> + </td><td> + + </td></tr><tr><td> Colagenase II (300 U / mL) </td><td> 5, 10, 15 min. antes de desactivação </td><td> Médias coletadas imediatamente </td><td> -, +, + + </td><td> -, + +, + </td><td> + </td></tr><tr><td> Colagenase II (600 U / mL) </td><td> 5, 10, 15 min. antes de desactivação </td><td> Médias coletadas imediatamente </td><td> +, + +, + + + </td><td> + +, + +, - </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Resultados preliminares de valvular protocolos de isolamento das células endoteliais.

<ol><li>Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+truncus+arteriosus+of+the+chick+embryo+heart%3A+the+formation+and+migration+of+mesenchymal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue.</a> Am J Anat. 154, 545-556 (1979).</li>
<li>Johnson, C. M., Fass, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+A+relative+deficiency+of+fibronectin+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro.</a> Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).</li>
<li>Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calf+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+production+of+glycosaminoglycans%2C+prostacyclin+and+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).</li>
<li>Cheunyg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JHVD%22%5BJournal%5D)">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).</li>
<li>Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Bio%22%5BJournal%5D)">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).</li>
<li>Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+heterogeneity+of+endothelial+phenotypes+correlates+with+side-specific+vulnerability+to+calcification+in+normal+porcine+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves.</a> Circ Res. 96, 792-799 (2005).</li>
<li>Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Profiles+of+Valvular+and+Vascular+Endothelial+Cells+Reveal+Phenotypic+Differences%3A+Influence+of+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).</li>
<li>Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pulmonary+Valve+Progenitor+Cells+Exhibit+Endothelial%2FMesenchymal+Plasticity+in+Response+to+Vascular+Endothelial+Growth+Factor-A+and+Transforming+Growth+Factor-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2.</a> Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li>
<li>Shi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li>
<li>Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+endothelial+progenitor+cells+are+derived+from+monocyte%2Fmacrophages+and+secrete+angiogenic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors.</a> Circulation. 107, 1164-1169 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma compreensão da biologia valvular tem sido prejudicada por dificuldades técnicas de isolamento e as populações de cultura pura de células endoteliais valvular. Técnicas de isolamento típico envolvem digestão enzimática da matriz subjacente basal ou dissociação química de ligações adesivas endotelial 2,3. Experimentos de isolamento preliminares foram avaliados qualitativamente por diferentes agentes dissociação e períodos de incubação. Os resultados destes experimentos mostraram que EDTA de incubação (ou Tr...

<table><tbody><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco&amp;rsquo;s</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>50-103-PB</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio de Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de Cauda de Rato</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Swabs Críticos</td><td>VWR international</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>Frascos T25</td><td>BD Biosciences</td><td>353018</td><td></td></tr><tr><td>Frascos T75</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 Poços</td><td>Falcon BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 60x15 mm</td><td>VWR international</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Vidro de 60x15 mm</td><td>VWR international</td><td>89000-310</td><td></td></tr><tr><td>Parafina para Inclusão</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19304-01</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas Precision Glide</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Filtros Nalgene de 500 mL</td><td>VWR international</td><td>73520-985</td><td></td></tr><tr><td>Filtros Nalgene de 1 L</td><td>VWR international</td><td>73520-986</td><td></td></tr><tr><td>Pinças para Tecidos</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-15</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas FSC nº 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de valvular células endoteliais

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Válvulas do coração é o único responsável por manter o fluxo sanguíneo unidirecional através do sistema cardiovascular. Esses finos, tecidos fibrosos são submetidos a tensões mecânicas significativas como abrir e fechar vários bilhões de vezes ao longo de uma vida. A resistência incrível destes tecidos é devido ao valvular residente endotelial (VEC) e células intersticiais (VIC) que constantemente reparação e remodelação em resposta a sinais locais mecânico e biológico. Apenas recentemente nós começamos a compreender os comportamentos ímpares dessas células, para o qual a experimentação in vitro tem desempenhado um papel fundamental. Particularmente desafiante é o isolamento e cultura de VEC. Cuidado especial deve ser usado a partir do momento em que o tecido é removido do host através de revestimento final. Aqui apresentamos os protocolos para o isolamento direto, o isolamento lado específico, cultura e verificação das populações puras de VEC. Usamos digestão enzimática seguido por uma técnica suave swab raspagem para retirar células da superfície somente. Estas células são então coletadas em um tubo e centrifugado em um pellet. O pellet é ressuspenso em seguida, e banhado em frascos de cultura pré-revestida com colágeno da matriz I. Fenótipo VEC é confirmado pelo contato inibiu o crescimento ea expressão de marcadores endoteliais específicos, tais como PECAM1 (CD31), fator de von Willebrand (vWF), e expressão negativa de alfa-actina de músculo liso (α-SMA). As características funcionais do VEC estão associados com altos níveis de LDL acetilada. Ao contrário de células endoteliais vasculares, VEC tem a capacidade única de transformar em mesênquima, que normalmente ocorre durante a formação embrionária válvula 1. Isso também pode ocorrer durante significativamente confluentes pós prolongada na cultura in vitro, assim que o cuidado deve ser feito para passagem em ou perto de confluência. Após o isolamento VEC, populações puras de VIC podem ser facilmente adquiridos.

Nós fornecemos um método para isolar e populações de cultura pura de células endoteliais válvula cardíaca (VEC). VEC pode ser isolado de ambos os lados da cúspide ou folheto e imediatamente a seguir, a célula intersticial subjacente isolamento (VIC) é simples.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

As válvulas cardíacas são as únicas responsáveis por manter o fluxo sanguíneo unidirecional através do sistema cardiovascular. Esses tecidos fibrosos e finos são...

A isolação de células endoteliais intersticiais residentes e específicas de cada lado de uma válvula cardíaca aórtica é demonstrada neste protocolo em vídeo. A cúspide valvar é coletada do coração e colocada em solução salina fria. A camada endotelial pode ser removida de ambos os lados da cúspide mediante leve cisalhamento do tecido submerso em solução de colagenase com um cotonete; para o isolamento específico por lado, a cúspide valvar é fixada sobre uma base de parafina de modo que a superfície endotelial fique exposta.Algumas gotas de colagenase fria são então adicionadas à cúspide valvar, e as cúspides são incubadas por cinco a 10 minutos. Após a incubação com colagenase, a camada endotelial específica do lado é removida por cisalhamento suave do tecido. Com um swab, as células endoteliais liberadas são então coletadas, lavadas e semeadas.Os folíolos remanescentes são então digeridos durante a noite para isolar as células intersticiais, que são coletadas e lavadas. Todas as células isoladas são cultivadas e podem ser utilizadas para compreender seu papel na reparação e remodelação das válvulas cardíacas em resposta a sinais mecânicos e biológicos locais. Olá, meu nome é Russe

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo de vídeo ilustra o isolamento e cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) de cordão umbilical humano. Uma vez isolados essas células podem ser usadas em ensaios de angiogênese in vitro como o Gel de fibrina Optimized Bead Assay também demonstrada pelo laboratório Hughes.

Isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células intersticiais da válvula aórtica do coração de um camundongo adulto usando um procedimento de colagenase em duas etapas e sua subsequente cultura em meio de crescimento de baixo volume.

Isolamento de células intersticiais da válvula de camundongo: um método enzimático para isolar e cultivar VICs da válvula aórtica de camundongo

Cultura celular primária é uma técnica útil para a análise de populações específicas de células, principalmente a partir de embriões de camundongos transgênicos em estágios de desenvolvimento específicos. Nisto, os ventrículos embrionárias são dissecados e dissociados, e os grânulos de anticorpos conjugados reconhecer e separar as células endoteliais para análise posterior.

Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

A capacidade de isolar células endoteliais da válvula cardíaca (VECs) é fundamental para a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento, manutenção e doença da válvula.  Aqui descrevemos o isolamento de VECs de camundongos Tie2-GFP embrionários e adultos usando FACS que permitirá estudos determinando a contribuição de VECs em processos de desenvolvimento e doença.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Este protocolo está preparado para compartilhar nosso método de isolamento de células endoteliais coronárias de camundongos para fins de imagem ou para conduzir experimentos biológicos moleculares.

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Apresentamos um protocolo para o isolamento de células endocárdicas e coronárias de corações de ratos através da digestão sequencial de tecidos em um tampão de digestão, coleta celular de ciclos de centrífuga recorrentes e purificação celular usando microesferas CD31 anti-ratos.

Isolamento das Células Endocárdicas e Coronárias da Parede Livre Ventricular do Coração de Rato

Este artigo descreve o isolamento das células da válvula aórtica do rato por um procedimento de colagem de duas etapas. Células de válvulas isoladas do rato são importantes para a realização de diferentes ensaios, como este ensaio de calcificação in vitro, e para investigar as vias moleculares que levam à mineralização da válvula aórtica.

Isolamento de células válvulas intersticiais do rato para estudar a calcificação da válvula aórtica in vitro

Este protocolo descreve a coleta de valvas aórticas humanas extraídas durante procedimentos cirúrgicos de substituição valvar aórtica ou de tecido cadavérico e o subsequente isolamento, expansão e caracterização de células endoteliais e intersticiais valvares primárias específicas do paciente. Estão incluídos detalhes importantes sobre os processos necessários para garantir a viabilidade celular e a especificidade do fenótipo.

Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro

Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.

Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

Apesar de desafiador, o isolamento das células endoteliais pulmonares é essencial para estudos sobre inflamação pulmonar. O presente protocolo descreve um procedimento para o isolamento de alto rendimento e pureza de células endoteliais macrovasculares e microvasculares.

Isolamento e Purificação de Células Endoteliais Microvasculares e Macrovasculares a partir de Amostras Derivadas de Pulmão

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Aprenda a isolar células endoteliais valvulares de válvulas aórticas usando colagenase e swab de algodão. Este protocolo permite obter populações puras para estudos de biologia cardiovascular e funções celulares específicas.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Explorar mais vídeos