Isolamento de Valvular Células Endoteliais

A isolação de células endoteliais intersticiais residentes e específicas de cada lado de uma válvula cardíaca aórtica é demonstrada neste protocolo em vídeo. A cúspide valvar é coletada do coração e colocada em solução salina fria. A camada endotelial pode ser removida de ambos os lados da cúspide mediante leve cisalhamento do tecido submerso em solução de colagenase com um cotonete; para o isolamento específico por lado, a cúspide valvar é fixada sobre uma base de parafina de modo que a superfície endotelial fique exposta.

Algumas gotas de colagenase fria são então adicionadas à cúspide valvar, e as cúspides são incubadas por cinco a 10 minutos. Após a incubação com colagenase, a camada endotelial específica do lado é removida por cisalhamento suave do tecido. Com um swab, as células endoteliais liberadas são então coletadas, lavadas e semeadas.

Os folíolos remanescentes são então digeridos durante a noite para isolar as células intersticiais, que são coletadas e lavadas. Todas as células isoladas são cultivadas e podem ser utilizadas para compreender seu papel na reparação e remodelação das válvulas cardíacas em resposta a sinais mecânicos e biológicos locais. Olá, meu nome é Russell Gould.

Estou aqui na Universidade Cornell, no departamento de engenharia biomédica, trabalhando no laboratório de Butcher. Hoje vou mostrar como isolar células endoteliais valvares. As implicações desta técnica estendem-se à compreensão de como as células V residentes constantemente se reparam e remodelam em resposta a sinais mecânicos e biológicos.

Então vamos começar. Para iniciar, obtenha um suíno de um matadouro local e trabalhe de forma asséptica para excisar a raiz aórtica. Enxágue completamente a raiz aórtica para remover o sangue.

Com DPBS estéril e frio, é imperativo remover todos os componentes sanguíneos o mais rápido possível para limitar a morte das células endoteliais valvulares ou VEC e a contaminação bacteriana. Antibióticos e antimicóticos não são recomendados nesta fase, pois podem ser prejudiciais às ecs. Em seguida, isole diretamente da raiz três.

Folhetos valvulares de cada válvula. Seja conservador ao isolar o folheto, pois qualquer tecido anular contaminará a população celular. Coloque os folhetos isolados em um tubo cônico estéril de 15 mililitros contendo 12 mililitros de DPBS frio.

Agite várias vezes para remover detritos e reabasteça com DPBS fresco. Por fim, transporte as cúspides valvares de volta ao laboratório sobre gelo. Ao chegar ao laboratório, coloque o recipiente com o tecido sob a capela estéril e prossiga para isolar a camada endotelial; autoclave o seguinte em uma bandeja de instrumentos com tampa: pinça de tecido serrilhada, tesoura de tecido e cotonetes.

Prepare também solução estéril de colagenase, meio endotelial e meio intersticial. Conforme detalhado no protocolo escrito anexo. Encha uma placa estéril de 35 milímetros com três mililitros de solução de colagenase fria por válvula e coloque todas as três cúspides do tubo de 15 mililitros na placa.

Incube o tecido por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, remova suavemente a camada endotelial de ambos os lados da cúspide, girando um swab estéril seco sobre a superfície. A direção da rotação e a quantidade de cisalhamento aplicada são fundamentais para a pureza da amostra.

O giro do cotonete ocorre em direção oposta ao movimento linear da mão que segura o cotonete. Isso cria um cisalhamento controlado que desprende as células endoteliais do tecido. A quantidade de força aplicada deve ser suficiente para sentir a resistência do tecido, mas sem penetrar a membrana basal; mergulhe ocasionalmente o cotonete na solução de colagenase para desprender as células das fibras da ponta.

Após a realização da esfregaço, a textura da camada endotelial deve parecer ligeiramente mais suave do que antes. Colete as células suspensas na solução de colagenase e transfira para um novo tubo estéril de 15 litros. Após remover as células endoteliais das folhetas, coloque imediatamente as folhetas em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de solução de colagenase para o isolamento de células intersticiais.

Centrifugue os tubos a 1000 RPM durante cinco minutos à temperatura ambiente para sedimentar as células isoladas, aspire o sobrenadante. Adicione três mililitros de meio endotelial aos tubos de 15 mililitros. Centrifugue uma segunda vez como antes e aspire o meio.

Essa segunda centrifugação ajuda a filtrar alguns materiais indesejados, como fibras das pontas. Re-suspenda as células endoteliais em cinco mililitros de meio endotelial e plaque as células em um frasco T25 pré-revestido com colágeno. Utilizando um frasco por tubo de centrífuga, deixe as células crescerem por pelo menos dois a três dias antes de trocar o meio endotelial.

Isso ajuda as células a se recuperarem e se dividirem. Como o processo de isolamento é bastante rigoroso e o rendimento celular pode ser baixo, é fundamental repicar as células próximas à confluência. Como a inibição por contato pode levar à transformação celular, as células endoteliais também podem ser isoladas de um lado específico.

Para fazer isso, prepare primeiro uma placa de Petri contendo uma linha de cama de parafina. Placas de Petri de vidro de 60 milímetros com folha de alumínio. Calcule duas placas de vidro por folheto.

O papel alumínio ajuda a remover a parafina para reutilizar a placa de Petri. Em seguida, coloque grânulos de parafina nas placas até cerca da metade e cubra para autoclavagem. Após a conclusão da autoclavagem e a fusão da parafina, transfira o conjunto de placas para uma superfície plana e fria.

À medida que a parafina esfria, ela endurece e forma uma camada que suportará perfurações com agulha. Após 60 minutos, a placa esterilizada pode ser usada para imobilizar o tecido valvar. Remova os folíolos isolados da válvula dos tubos de 15 mililitros e coloque-os sobre a cama de parafina.

Manipule os folhetos de modo que o lado ventricular fique voltado para baixo sobre a superfície de parafina, deixando o lado com fibrose exposto. Fixe as bordas do folheto para expor a camada endotelial. Em seguida, coloque algumas gotas de colagenase fria sobre cada superfície endotelial voltada para cima e incube o tecido por cinco a dez minutos a 37 graus Celsius.

Quando a incubação estiver concluída, remova suavemente a camada endotelial como antes, girando um swab estéril e seco sobre a superfície da cúspide. Ocasionalmente, toque levemente o swab dentro da solução de colagenase para desprender as células das fibras da ponta. Após a conclusão da etapa de swabbing, a textura da camada endotelial deve parecer ligeiramente mais lisa do que anteriormente.

Colete a suspensão celular e transfira para um novo tubo estéril de 15 mililitros. Indica a especificidade lateral: folhetos de rótulo do mesmo válvula podem ser agrupados juntos. Enxágue o válvula imobilizado usando algumas gotas de DPBS frio para remover quaisquer células ou resíduos remanescentes.

Transfira as cúspides para uma nova placa de cultura de modo que o lado ventricular agora fique exposto e colete as células endoteliais conforme acabou de ser demonstrado. Assim que a coleta das células endoteliais da cúspide G for concluída, coloque imediatamente as cúspides em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de solução de colagenase. Lave as células resus, suspenda-as e cultive conforme mostrado para o isolamento não específico por lado das células endoteliais.

Se o rendimento celular for muito baixo, considere mudar para um frasco menor ou usar uma placa de poços. Como a adesão célula-célula promove o crescimento celular, lembre-se de repicar as células próximas à confluência. Como a inibição por contato pode levar à transformação celular, inicie o isolamento das células intersticiais enquanto centrifuga as células endoteliais e incuba os tubos que contêm as folhetas por aproximadamente 12 a 18 horas.

Na solução de colagenase, agite suavemente, se desejado. Ao final do período de incubação, use uma pipeta serológica para misturar suavemente o tecido digerido até que a suspensão celular fique homogeneizada. Essa homogeneização ajuda a fragmentar o tecido e liberar as células intersticiais. Centrifugue e lave as células conforme mostrado para as células endoteliais.

Exceto usar cinco mililitros de meio intersticial ressus, suspender as células intersticiais do centrifugado em 15 mililitros de meio intersticial e semear as células em um frasco T 75, utilizando um frasco por tubo de centrífuga. Deixar as células crescerem pelo menos um a dois dias antes de trocar o meio intersticial, esperando mais debris tecidual do que com as células endoteliais. Além disso, as células intersticiais crescem até a confluência mais rapidamente do que as células endoteliais por natureza e proporcionam maiores rendimentos celulares nestas imagens representativas.

A morfologia de células endoteliais valvares V Cs cultivadas e de células intersticiais valvares versus é mostrada após dois a três dias. As BECs exibem uma morfologia endotelial típica, na qual as células apresentam um padrão semelhante a calçamento e começam a formar aglomerados.

O VS. Exibe morfologia semelhante à de miofibroblastos, na qual as células são geralmente em forma de fuso e esparsamente distribuídas quando cultivadas até a confluência. O ECS exibe uma morfologia endotelial típica, na qual as células apresentam um padrão semelhante a seixos e o crescimento é inibido por contato. O VI CS exibe morfologia semelhante à de miofibroblastos, na qual as células são geralmente em forma de fuso e não apresentam inibição por contato. As características funcionais tanto de VEC quanto de VIC podem ser inferidas a partir da coloração. Para LDL marcado.

As células VEC estão associadas a altos níveis de captação de LDL acetilada. Enquanto as células VIC estão associadas a baixos níveis de captação de LDL acetilada, os marcadores celulares de VEC e VIC são mostrados aqui. As células ECS apresentam coloração positiva para o fator de von Willebrand, enquanto vs.

Não apresentam coloração para fator de von Willebrand. Além disso, as CTVs coram negativo para alfa-actina de músculo liso, enquanto as CTVs coram positivo para alfa-actina de músculo liso. Bem, espero que tenham aprendido muito com nossos isolamentos de hoje.

É importante lembrar, no entanto, que a membrana basal das células endoteliais é muito frágil e qualquer perturbação na matriz subjacente frequentemente libera células contaminantes do restante do tecido. Para confirmar um isolamento bem-sucedido, a caracterização é fundamental para avaliar a pureza dos seus isolados. Portanto, boa sorte.