Avaliar a resposta estomática ao vivo células bacterianas usando imagens Folha Inteira

Neste procedimento, a imagem foliar é utilizada para avaliar o movimento das células-guarda em resposta a células bacterianas vivas. Primeiro, as bactérias são aclimatadas a partir de um estoque glicerinado e um inóculo é preparado. Em seguida, folhas jovens e saudáveis são coletadas e coradas com iodeto de propídio.

As folhas coradas são cortadas e os pedaços de folha são incubados sobre uma suspensão bacteriana. Por fim, a superfície da folha é observada ao microscópio e as aberturas estomáticas podem ser medidas. Os resultados obtidos utilizando microscopia de fluorescência mostram alterações na abertura estomática em resposta às bactérias.

A principal vantagem deste método em relação aos métodos existentes, como o uso de lâminas de epiderme, é que a folha em contato com as bactérias permanece intacta, simulando as condições naturais para a penetração bacteriana nas folhas. Para iniciar este procedimento, semeie sementes de Arabidopsis em uma mistura, na proporção de um para um, de v:v:v de substrato de cultivo. Adicione vermiculita e cultive as plantas em câmara de crescimento, regando conforme necessário.

As plantas estarão prontas para uso em quatro a seis semanas, quando apresentarem folhas jovens, totalmente expandidas, antes do alongamento do caule. Dois dias antes de iniciar o experimento, prepare o cultivo bacteriano por estriação. Inocule Pseudomonas ringe a partir de estoque glicerolado em meio LB modificado e incube por 24 horas a 28 graus Celsius.

Utilize uma cultura fresca para preparar o inóculo e sempre inicie placas de cultura a partir de estoques glicerinados. Como as bactérias tornam-se menos virulentas após subcultivo, use bactérias que cresceram na placa para iniciar uma cultura líquida de 10 mililitros de pseudomona singe. Em um frasco erlenmeyer de 50 mililitros, incube a cultura durante a noite a 28 graus Celsius com agitação vigorosa até que atinja uma densidade óptica ou od em 600 nanômetros entre 0,8 e 1.

Meça a DO em 600 e recolha as células por centrifugação a 1.360 × g durante 10 minutos. Re-suspenda as células em água destilada de modo que a DO final seja 0,2. Essa DO corresponde a 10 elevado a oito unidades formadoras de colônias por mililitro.

Com as bactérias prontas, prossiga para preparar as folhas e realizar o ensaio com o objetivo de corar as folhas. Primeiro, prepare uma solução de 20 micromolares de iodeto de propídio, ou PI, em água. 10 mililitros de solução são suficientes para corar três folhas pequenas de cada vez.

Retire as plantas da câmara de crescimento e, com pinça, desprenda três folhas jovens totalmente expandidas. Mergulhe as folhas inteiras na solução de iodeto de propídio (PI) por cinco minutos. Em seguida, remova as folhas e enxágue-as brevemente com água destilada.

Em seguida, posicione uma folha com a superfície inferior voltada para baixo sobre uma lâmina de microscópio. Corte a folha com uma lâmina de barbear afiada em quatro pedaços, excluindo a nervura central para que a folha fique plana sobre a lâmina, permitindo a incubação das bactérias com as folhas. Adicione 300 microlitros de suspensão bacteriana sob os pedaços de folha na lâmina, certificando-se de que a superfície inferior da folha entre em contato com o inóculo.

Incube as amostras nas mesmas condições ambientais utilizadas para o crescimento das plantas. Quando for hora de observar as folhas ao microscópio, transfira os pedaços de folha para uma nova lâmina com a superfície inferior voltada para cima. Observe que uma lamínula não é utilizada ao montar as lâminas.

A mesma amostra de folha pode ser imageada múltiplas vezes durante a incubação, e um curso temporal pode ser estabelecido de acordo com os objetivos da pesquisa. Aqui, um microscópio confocal de varredura a laser é usado para examinar as folhas, observar a superfície inferior das folhas para detectar a fluorescência de PI usando as mesmas amostras de folha, e capturar imagens dos estômatos ao longo do tempo. Salve as imagens para medir a largura da abertura estomática.

Meça a largura da abertura estomática de pelo menos 60 estômatos para cada tratamento em cada ponto temporal. Utilizando o navegador de imagens LSM, calcule a média e o erro padrão da largura da abertura estomática. A significância estatística dos resultados pode ser calculada utilizando o teste t de Student bicaudal pareado.

O teste T aqui é uma imagem microscópica típica da superfície de uma folha de Arabidopsis sob microscópio confocal a laser. Na visão de campo claro, o iodeto de propídio cora a parede celular de células viáveis, aumentando a visibilidade das células-guarda, além de permitir a identificação de células não danificadas. Uma variedade de aberturas estomáticas pode ser observada nestes micrografias, desde estômatos completamente fechados até estômatos totalmente abertos.

Estômatos completamente fechados são identificados pela forma das células-guarda. A largura da abertura é considerada zero micrômetro para estômatos abertos. A largura da abertura mostrada é medida utilizando uma linha reta traçada sobre a área mais larga do poro estomático.

Estes são resultados experimentais típicos do ensaio de inoculação em folhas vivas. Folhas de Arabidopsis foram incubadas no escuro com três cepas diferentes de pseudomonas Cy Ringe, sendo que apenas a bactéria P-S-T-D-C 3000 foi capaz de abrir estômatos fechados no escuro, conforme medido pela largura da abertura de 60 estômatos selecionados aleatoriamente por cepa bacteriana. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de interações planta-bactéria explorarem os mecanismos de resposta inicial a patógenos em espécies vegetais.