Name: Avaliar a resposta estomática ao vivo células bacterianas usando imagens Folha Inteira (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a avaliar respostas estomáticas a bactérias vivas em folhas intactas usando microscopia confocal. Este método minimiza danos teciduais e permite observação em tempo real da interação planta-patógeno.

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Esta pesquisa foi suportada por uma concessão do Instituto Nacional de Saúde e da Universidade do Texas em Arlington criar fundos para MM.

1. As plantas que crescem e Bactérias Preparação <ol><li> Para iniciar este procedimento semear Arabidopsis em um v 01:01:01: v: v mistura de meio de cultura (Redi-earth plug and mix de mudas, Sun Gro), vermiculita fina, e perlite. </li><li> Crescer as plantas em câmara de crescimento (22 ° C umidade, 12 horas de luz de 100 mmol / mm 2 / s por dia e 65 ± 5%) e água, conforme necessário. As plantas estão prontas para uso em 4-6 semanas quando têm folhas jovens completamente expandidas antes do pendoamento. </li><li> Dois dias antes de iniciar o experimento preparar a cultura bactéria. Streak Pseudomonas syringae do estoque de glicerol em meio LB modificado (10 g / L triptona, 5 g / L de extrato de levedura, 5 g / L NaCl pH 7,0, e ágar 1,5%) e incubar durante 24 horas a 28 ° C. Use cultura fresco para preparar o inóculo e sempre começam placas de cultura de stocks glicerol como bactérias torna-se menos virulentas após o sub-cultura. </li><li> Use as bactérias que cresceram na placa para começar uma cultura de 10 mL de líquido de P. syringae em um erlenmeyer 50 mL. Incubar a cultura durante a noite a 28 ° C com agitação vigorosa até atingir densidade óptica ou OD a 600 nm entre 0,8 e 1. </li><li> Medir o OD a 600 e colher as células por centrifugação a 1360 xg por 10 minutos. Ressuspender as células em água destilada de modo que o OD final é 0,2. Este OD corresponde a 10 8 unidades formadoras de colônia (UFC) / mL. Com as bactérias pronto, vá para preparar as folhas e realizar o ensaio. </li></ol> 2. A coloração das folhas e incubação com bactérias <ol><li> , A fim de mancha as folhas primeiro preparar 20 iodeto de propídio mM ou solução PI na água. 10 mL de solução é suficiente para manchar 3 folhas pequenas de cada vez. </li><li> Recuperar as plantas da câmara de crescimento e com uma pinça retire três jovens, completamente expandidas folhas. Mergulhe as folhas inteiras em solução de PI por 5 minutos. Em seguida, retire as folhas e lavá-los rapidamente com água destilada. </li><li> Em seguida coloque uma folha com a superfície inferior virado para baixo sobre uma lâmina de microscópio. Corte a folha com uma lâmina afiada em quatro pedaços excluindo a veia meados de modo que a folha plana estabelece no slide. </li><li> Para incubar a bactéria com as folhas, adicionar 300 mL de suspensão bacteriana sob os pedaços de folhas no slide. Certifique-se que a superfície inferior da folha está em contato com o inóculo. </li><li> Incubar as amostras nas mesmas condições ambientais que foram usados ​​para crescer as plantas. No momento em que deixa de observar ao microscópio, transferir os pedaços de folhas para um novo slide com superfície inferior voltada para cima. Note-se que lamínula não é utilizado durante a montagem dos slides. A amostra foliar mesmo pode ser fotografada várias vezes durante a incubação e um curso de tempo pode ser configurado de acordo com os objetivos da pesquisa. </li></ol> 3. Análise da Medição Microscopia e Dados <ol><li> Aqui, um microscópio confocal de varredura a laser (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc.) é usado para examinar as folhas. Observar a superfície inferior das folhas para detectar a fluorescência de PI (excitação 453 nm, a emissão de 543 e 620 nm). </li><li> Utilizando as amostras de folhas mesmo capturar imagens de estômatos ao longo do tempo. Guardar as imagens para medir a largura da abertura estomática. </li><li> Medir a largura de abertura estomática de pelo menos 60 estômatos para cada tratamento em cada momento usando o navegador de imagem LSM. </li><li> Calcular a média e erro padrão para a largura da abertura estomática. Significância estatística dos resultados pode ser calculada usando 2-tailed, Student pareado sábio t-teste. </li></ol> 4. Imagens representativas da Resposta estomática para incubação com bactérias <ol><li> Aqui está uma imagem típica microscópica (utilizando objetiva de 20x) de uma superfície foliar de Arabidopsis sob microscópio confocal de varredura a laser em vista de campo claro (Figura 1). </li><li> Manchas de iodeto de propídio da parede celular de células viáveis ​​aumentar a visibilidade de células-guarda, além de permitir a identificação de células intactas de coleta de dados (Figura 2). Uma série de aberturas de poro estomático pode ser visto nestas micrografias, a partir de estômatos completamente fechados para estômatos abertos. </li><li> Estômatos completamente fechados são identificados pela forma das células guarda (Figura 3). A largura de abertura é considerado como sendo 0 mM. </li><li> Para estômatos abertos (Figura 4) a largura de abertura mostrada é medido por meio de uma linha reta traçada através da maior área do poro estomático. </li><li> Estes são típicos os resultados experimentais deste ensaio estomática. Deixa Arabidopis foram incubadas no escuro com três diferentes cepas de Pseudomonas syringae. Apenas a bactéria Pst DC3000 foi capaz de abrir-escuro fechado estômatos, medido pela largura de abertura de estômatos selecionados aleatoriamente 60 por estirpe bacteriana (Figura 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Micrografia da superfície de uma folha de Arabidopsis. Um campo de visão da superfície foliar sob microscópio confocal de varredura a laser (LSCM) usando o objetivo de 20x. Note-se que a abertura estomática não é tão evidente quando comparado com o ponto de vista fluorescentes auxiliado por coloração iodeto de propídio (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Micrografia da superfície de uma folha de Arabidopsis propidium iodeto de manchado. Um campo de visão da superfície foliar sob microscópio confocal de varredura a laser (LSCM) usando o objetivo de 20x. Nota uma gama de abertura do poro estomático. Setas amarelas são apontados para fechar completamente estômatos e setas verdes são apontados estômatos abertos. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Estômatos completamente perto identificados pela forma e da abertura entre as células guarda. A largura de abertura é considerado como sendo 0 mM. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Estômatos abertos mostrando a largura de abertura em mM. As medidas foram feitas usando o navegador LSCM baseado em uma linha reta traçada através da maior área do poro estomático. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Abertura estomática das folhas de Arabidopsis incubadas com três linhagens de Pseudomonas syringae pv tomate:.. DC3118, DB29, e DC3000 As plantas foram mantidas no escuro durante o tempo de experimentação. Os resultados são apresentados como a média (n = 50-70) ± erro padrão. Significância estatística foi detectada com bicaudal de Student t-test. O experimento foi repetido três vezes com resultados semelhantes.

<ol><li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKatagiri%2C+F+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).</li>
<li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li>
<li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos um procedimento para a frente para medir a abertura estomática em tecido foliar intacta permitindo uma fácil avaliação da resposta estomática a diferentes tratamentos. Embora tenhamos apresentado resultados utilizando o sistema modelo Arabidopsis / Pseudomonas syringae, o ensaio da folha intacta estomática pode ser potencialmente realizada com qualquer combinação de plantas bactéria. O protocolo pode ser facilmente modificado para atender às necessidades de crescimento de outras plantas e patógenos bacterianos. O princípio geral e procedimento permanece o mesmo. Além disso, este método pode ser benéfica para pesquisadores que desejam estudar saída funcional de células-guarda não só para viver os micróbios, mas também a outros estímulos e agentes químicos em condições que mantenham o ambiente natural da folha. Folha inteira pode ser difícil de imagem devido a sua espessura e topografia irregular. Este problema pode ser aliviado com a remoção da veia meados da folha de modo que estabelece plano no slide e microscopia confocal. No entanto, outros tipos de microscópio de fluorescência pode ser usado para obter imagens de alta resolução da superfície da folha.

<table><tbody><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-1</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Difco Laboratories</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>VWR international</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Bio Express</td><td>J637-2500G</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de crescimento vegetal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora agitadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal a laser</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

avaliar a resposta estomática ao vivo células bacterianas usando imagens folha inteira

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Estômatos são aberturas naturais na epiderme planta responsável pela troca de gases entre o interior da planta e ambiente. Eles são formados por um par de células-guarda, que são capazes de fechar o poro estomático em resposta a uma série de fatores externos, incluindo a intensidade da luz, a concentração de dióxido de carbono e umidade relativa (UR). O poro estomático é também a principal via para a entrada do patógeno em folhas, um passo crucial para o desenvolvimento da doença. Estudos recentes têm revelado que o fechamento do poro é eficiente na minimização de desenvolvimento de doenças bacterianas em plantas de Arabidopsis, uma parte integrante da imunidade inata de plantas. Anteriormente, nós usamos as cascas da epiderme para avaliar a resposta estomática ao vivo bactérias (Melotto et al 2006).; No entanto manter condições ambientais favoráveis ​​para ambas as cascas de plantas da epiderme e células bacterianas tem sido um desafio. Epiderme da folha pode ser mantido vivo e saudável, com MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6,15) para experimentos eletrofisiológicos das células guarda. No entanto, essa reserva não é apropriado para a obtenção de suspensão bacteriana. Por outro lado, as células bacterianas podem ser mantidos vivos em água que não é adequada para manter as cascas da epiderme por longo período de tempo. Quando uma casca flutua sobre a água da epiderme, as células na casca que estão expostos ao ar seco dentro de 4 horas limitando o tempo para realizar o experimento. Um método ideal para avaliar o efeito de um estímulo especial sobre células-guarda deve apresentar o mínimo de interferência para a fisiologia dos estômatos e ao meio ambiente natural da planta, tanto quanto possível. Nós, portanto, desenvolveu um novo método para avaliar a resposta estomática ao vivo em que as bactérias ferindo folha e manipulação é bastante minimizado com o objetivo de fornecer um ensaio facilmente reproduzível e confiável estomática. O protocolo se baseia na coloração da folha intacta com iodeto de propídio (PI), a incubação de coloração das folhas com suspensão bacteriana, e observação das folhas sob microscópio confocal de varredura a laser. Finalmente, esse método permite a observação da amostra da folha mesmo viver durante longos períodos de tempo usando condições que simulam as condições naturais em que as plantas são atacadas por patógenos.

Nós desenvolvemos um protocolo simples e reprodutível para acessar a resposta estomática ao bactérias vivas. Este método minimiza ferimento e manipulação da folha, em comparação com o uso de peelings epidérmicos relatado anteriormente.

Avaliar a resposta estomática ao vivo células bacterianas usando imagens Folha Inteira

Os estômatos são aberturas naturais na epiderme da planta responsáveis pelas trocas gasosas entre o interior da planta e o ambiente. Eles são formados por um par de...

Neste procedimento, a imagem foliar é utilizada para avaliar o movimento das células-guarda em resposta a células bacterianas vivas. Primeiro, as bactérias são aclimatadas a partir de um estoque glicerolado e um inóculo é preparado. Em seguida, folhas jovens e saudáveis são coletadas e coradas com iodeto de propídio.As folhas coradas são cortadas e os pedaços de folha são incubados sobre uma suspensão bacteriana. Por fim, a superfície da folha é observada ao microscópio e as aberturas estomáticas podem ser medidas. Os resultados obtidos utilizando microscopia de fluorescência mostram alterações na abertura estomática em resposta às bactérias.A principal vantagem deste método em relação a métodos existentes, como o uso de películas epidérmicas, é que a folha em contato com as bactérias permanece intacta, simulando as condições naturais de penetração bacteriana nas folhas. Para iniciar este procedimento, semeie sementes de Arabidopsis em uma mistura, na proporção de um para um, de v:v:v de substrato de cultivo. Adicione vermiculita e iluminação leve, e cultive as plantas em câmara de crescimento, regando conforme necessário.As plantas estarão prontas para uso em quatro a seis semanas, quando apresentarem folhas jovens, totalmente expandidas, antes do alongamento do escapo floral. Dois dias antes de iniciar o experimento, prepare o estriamento da cultura bacteriana. Inocule Pseudomonas ringe a partir de estoque glicerolado em meio LB modificado e incube por 24 horas a 28 graus Celsius.Utilize um cultivo fresco para preparar o inóculo e sempre inicie placas de cultura a partir de estoques glicerinados. Como as bactérias tornam-se menos virulentas após subcultivo, use bactérias que cresceram na placa para iniciar um cultivo líquido de 10 mililitros de pseudomona singe. Em um frasco erlenmeyer de 50 mililitros, incube o cultivo durante a noite a 28 graus Celsius com agitação vigorosa até atingir uma densidade óptica ou od em 600 nanômetros entre 0,8 e 1.Meça a DO em 600 e recolha as células por centrifugação a 1.360 × g durante 10 minutos. Re-suspenda as células em água destilada de modo que a DO final seja 0,2. Essa DO corresponde a 10 elevado a oito unidades formadoras de colônias por mililitro.Com as bactérias prontas, prossiga para preparar as folhas e realizar o ensaio com o objetivo de corar as folhas. Primeiro, prepare uma solução de iodeto de propídio, ou PI, a 20 micromolares em água. Uma quantidade de 10 mililitros de solução é suficiente para corar três folhas pequenas de cada vez.Retire as plantas da câmara de crescimento e, com pinça, desprenda três folhas jovens totalmente expandidas. Mergulhe as folhas inteiras na solução de iodeto de propídio (PI) por cinco minutos. Em seguida, remova as folhas e enxágue-as brevemente com água destilada.Em seguida, posicione uma folha com a superfície inferior voltada para baixo sobre uma lâmina de microscópio. Corte a folha com uma lâmina de barbear afiada em quatro pedaços, excluindo a nervura central, para que a folha fique plana sobre a lâmina, permitindo a incubação das bactérias com as folhas. Adicione 300 microlitros de suspensão bacteriana sob os pedaços de folha na lâmina, certificando-se de que a superfície inferior da folha entre em contato com o inóculo.Incube as amostras nas mesmas condições ambientais utilizadas para o cultivo das plantas. Quando for hora de observar as folhas ao microscópio, transfira os pedaços de folha para uma nova lâmina com a superfície inferior voltada para cima. Observe que uma lamínula não é utilizada ao montar as lâminas.A mesma amostra de folha pode ser imageada múltiplas vezes durante a incubação, e um curso temporal pode ser estabelecido de acordo com os objetivos da pesquisa. Aqui, um microscópio confocal de varredura a laser é usado para examinar as folhas, observar a superfície inferior das folhas para detectar a fluorescência de PI usando as mesmas amostras de folha, e capturar imagens do estômato ao longo do tempo. Salve as imagens para medir a largura da abertura estomática.Meça a largura da abertura estomática de pelo menos 60 estômatos para cada tratamento em cada ponto temporal. Utilizando o navegador de imagens LSM, calcule a média e o erro padrão da largura da abertura estomática. A significância estatística dos resultados pode ser calculada utilizando o teste t de Student bicaudal pareado.O teste T aqui é uma imagem microscópica típica da superfície de uma folha de Arabidopsis sob um microscópio confocal a laser. Na visão de campo claro, o iodeto de propídio cora a parede celular de células viáveis, aumentando a visibilidade das células-guarda, além de permitir a identificação de células não danificadas. Uma variedade de aberturas estomáticas pode ser observada nestas micrografias, desde estômatos completamente fechados até estômatos totalmente abertos.Estômatos completamente fechados são identificados pela forma das células-guarda. A largura da abertura é considerada zero micrômetro para estômatos abertos. A largura da abertura mostrada é medida utilizando uma linha reta traçada sobre a área mais larga do poro estomático.Estes são resultados experimentais típicos do ensaio de inoculação em folhas vivas. Folhas de Arabidopsis foram incubadas no escuro com três cepas diferentes de Pseudomonas Cy Ringe; apenas a bactéria P-S-T-D-C 3000 foi capaz de abrir estômatos fechados no escuro, conforme medido pela largura da abertura de 60 estômatos selecionados aleatoriamente por cepa bacteriana. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de interações planta-bactéria explorarem os mecanismos de resposta inicial a patógenos em espécies vegetais.

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