Estimar as taxas de produção de vírus em Sistemas Aquáticos

O objetivo geral deste procedimento é determinar a taxa de produção de vírus em comunidades microbianas aquáticas. Isso é realizado primeiramente reduzindo a abundância de vírus livres na amostra de interesse, mantendo ao mesmo tempo a comunidade microbiana nativa. O segundo passo do procedimento consiste em incubação de amostras sob condições que induzem a produção viral e na coleta de subamostras a cada duas ou três horas, durante um período de até 10 horas.

O terceiro passo do procedimento é enumerar os vírus nas subamostras coletadas em cada ponto temporal. O passo final do procedimento é determinar a taxa na qual a abundância de partículas virais aumentou dentro da amostra e determinar as taxas de produção viral. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as taxas nas quais os vírus estão sendo produzidos dentro da comunidade microbiana a partir das enumerações, permitindo aos pesquisadores inferir as taxas de mortalidade microbiana devido à atividade viral.

Olá a todos. Meu nome é Audrey Madison, e trabalho no laboratório do Dr. Steven Milham e no Departamento de Microbiologia da Universidade do Tennessee. Hoje, com a ajuda de Charles Budoff e Claire Campbell, vamos mostrar um procedimento para analisar as taxas de produção de vírus em sistemas aquáticos.

Para fazer isso, reduzimos o número de vírus livres nas amostras e enumeramos a taxa na qual eles reaparecem devido à lise de microrganismos infectados viralmente. Atualmente, utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a ecologia de vírus e como eles podem moldar comunidades microbianas. Agora que fizemos a introdução, vamos em frente e começar.

Antes que este procedimento possa começar, colete aproximadamente 20 litros de água do mar de maneira o mais asséptica possível. Uma vez que a amostra seja coletada, pré-filtre a água por meio de um filtro de 0,8 mícron de diâmetro de 142 milímetros. Para sistemas biologicamente produtivos, pode-se antecipar isso com filtração por meio de um filtro de tamanho de poro maior ou de fibra de vidro.

Para obter água ultrafiltrada, monte um sistema de ultrafiltração como o sistema AmCon M 12 com um cartucho de membrana espiral para excluir todos os vírus. Os vírus na amostra são então removidos e concentrados a aproximadamente 25% da velocidade máxima com 15 a 16 quilopascals de pressão reversa. O concentrado, cerca de 500 mililitros, contém a comunidade viral agora concentrada, que pode ser armazenada para outros estudos, enquanto o permeado livre de vírus será utilizado em ensaios de produção viral.

Após cada dia de uso, limpe o sistema Omicron M 12 para prevenir danos à membrana do cartucho de filtro. Ao trabalhar com água do mar, enxágue a membrana com pelo menos seis litros de água Milli Q, seguido por uma lavagem com solução de hidróxido de sódio 0,1 molar por 30 a 45 minutos. Em seguida, enxágue o cartucho com pelo menos mais seis litros de água Milli Q.

Quando finalizado, o cartucho espiral pode ser armazenado em uma solução de ácido fosfórico 0,05 molar a quatro graus Celsius. Para iniciar o método de redução viral, 500 mililitros de amostra de água do mar do mesmo local onde obtivemos nossa água livre de vírus são colocados em uma unidade de filtro estéreo com um filtro de baixa ligação a proteínas e tamanho de poro nominal de 0,2 micrômetros. Neste momento, colete também uma subamostra para determinar a abundância total de vírus e bactérias na água inicial.

Pressurize suavemente a amostra por vácuo a menos de 200 milímetros de mercúrio, mantendo a suspensão contínua da amostra com uma pipeta estéril de transferência para inibir que as células bacterianas se concentrem no filtro; lentamente, adicione três volumes de 500 mililitros do ultrafiltrado à suspensão bacteriana para reduzir a abundância de vírus livres na amostra, mantendo as populações bacterianas em densidade constante. Por fim, dilua a fração bacteriana novamente até 500 mililitros com água ultrafiltrada livre de vírus. Em seguida, divida-a em três réplicas de 150 mililitros e coloque as réplicas em frascos de policarbonato transparentes de 250 mililitros.

Este conjunto representa sua amostra de tempo zero. Colete amostras para estimativas da abundância bacteriana e viral a partir das amostras de tempo zero. Transfira as amostras para frascos criogênicos com uma concentração final de 2,0 a 2,5% de glutaraldeído estéril.

Como fixador, congele imediatamente essas amostras com nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius até o processamento. Alternativamente, pode-se usar um sistema de fluxo tangencial para concentrar os microrganismos marinhos. Para utilizar o método TFF, obtenha aproximadamente 500 mililitros da amostra natural.

Concentre esta amostra utilizando um sistema de filtração tangencial com tamanho nominal de poro de 0,2 mícron quando a fração bacteriana for reduzida a aproximadamente 10 a 15 mililitros em água ultrafiltrada e livre de vírus, conforme descrito para o método de redução viral, e incube os frascos resultantes em condições de incitação. Utilizando câmaras ambientais no mar, empregamos incubadoras com água do mar em fluxo conectadas a um suprimento de água superficial que mantém temperaturas ambientes. Os níveis de luz podem ser ajustados às condições superficiais utilizando acrílico com tonalidade azul ou uma tela de densidade neutra para reduzir a intensidade luminosa.

Quando se trabalha a partir de uma estação de campo ou laboratório, ou quando a água do mar não está disponível, pode-se utilizar um incubador de crescimento iluminado. Continue a coletar subamostras a cada 2,5 horas durante pelo menos 10 horas, utilizando o método realizado para a amostra no tempo zero. Além das amostras para microscopia, alguns pesquisadores poderão desejar coletar água para análise de PCR quantitativa de vírus específicos.

Para amostras de QPCR, adicione cinco mililitros da amostra a um tubo criogênico sem agente fixador e congele imediatamente em nitrogênio líquido para preparação da microscopia de produção viral. Deixe as amostras congeladas descongelarem no gelo e prepare soluções frescas conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, posicione um filtro de disco com diâmetro de 25 milímetros e tamanho de poro de 0,02 mícron sobre um filtro de suporte celulósico de 0,45 mícron. Depois, adicione 850 microlitros da amostra fixada na parte superior do filtro Anadi e aplique vácuo a menos de 20 quilopascal até completa secagem.

Uma vez que o filtro com disco ano esteja seco, pipete 100 microlitros da solução trabalho de cyber green em uma placa de Petri estéril. E com o vácuo ainda ligado, remova cuidadosamente o disco ano da torre de filtro e coloque-o sobre o cyber green. Incube as amostras no escuro, à temperatura ambiente, por 20 minutos.

Remova cuidadosamente o filtro da solução de verde cyber e seque a parte traseira do filtro com um lenço Kim para remover todo o corante residual. Em seguida, adicione uma pequena gota de solução Antifa a uma lâmina de microscópio e coloque uma lamínula em cima. Remova a lamínula e adicione o filtro seco à lâmina de microscópio.

Novamente, adicione uma pequena quantidade da solução Antifa sobre a lamínula e posicione-a lentamente sobre o filtro, certificando-se de remover quaisquer bolhas que possam se formar. Enumere os vírus utilizando microscopia de fluorescência com filtro azul largo, contando pelo menos 20 campos de visão para cada filtro, assegurando-se de quantificar o número total de vírus em cada campo da grade para garantir uma distribuição uniforme dos vírus na membrana do filtro. Calcule as taxas médias de recorrência viral a partir das três réplicas independentes e determine o desvio padrão das taxas de produção. Por fim, corrija essas taxas considerando a diluição dos microrganismos da abundância inicial para a abundância diluída na amostra com vírus reduzido.

O conjunto primário de dados resultante deste estudo é a taxa de recorrência da abundância de vírus nas subamostras provenientes das incubações. Esses resultados formam regressões independentes da abundância de vírus em função do tempo para cada uma das amostras. A produção de partículas semelhantes a vírus foi monitorada ao longo de uma incubação de 10 horas em condições de luz natural utilizando microscopia de fluorescência por epifluorescência.

Essas amostras foram coletadas durante uma floração de fitoplâncton ao largo da costa da Nova Zelândia em setembro de 2008. Acabamos de mostrar como estimar as taxas de produção de vírus. Isso inclui o uso de diferentes sistemas de ultrafiltração e a realização de experimentos para medir as taxas de produção de vírus.

Além disso, mostramos a você como enumerar esses vírus por microscopia de epifluorescência. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de usar equipamentos limpos, manipular os vírus corados com cuidado, reduzir a exposição à luz, processar suas amostras rapidamente e limpar adequadamente seus cartuchos de ultrafiltração após cada uso. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.