Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

O objetivo geral deste procedimento é identificar células positivas para HIV utilizando um vetor lentiviral dependente da proteína Rev do HIV-1 que carrega a proteína verde fluorescente. Isso é realizado primeiramente produzindo partículas lentivirais dependentes da Rev por meio de cotransfeção. O segundo passo do procedimento é infectar células T humanas CD4 com o HIV-1.

Em seguida, as células T CD4 humanas positivas para HIV são superinfectadas com partículas lentivirais portando o gene GFP. O passo final é identificar as células positivas para HIV mediante a medição de células positivas para GFP por citometria de fluxo. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram a porcentagem de células positivas para GFP por meio de citometria de fluxo.

As implicações dessa técnica estendem-se à terapia da infecção por HIV, devido ao fato de que o vetor dependente da rev também pode entregar e expressar seletivamente genes terapêuticos em células infectadas pelo HIV para induzir a eliminação de células positivas para o HIV. Demonstrando o procedimento estará gi, um professor assistente pesquisador do nosso laboratório, para produzir partículas lentivirais dependentes da rev. Células HEK 293T são transfectadas com três plasmídeos: o vetor lentiviral GFP dependente da rev, o construto de empacotamento do HIV-1 e um plasmídeo portador da glicoproteína VSVG. Um dia antes da transfeção dos plasmídeos, semeie duas vezes 10 à sexta potência de células HEK 293T em 10 mililitros de meio.

Em uma placa de Petri de 100 milímetros, cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, substitua o sobrenadante das células por cinco mililitros de meio fresco.

Em seguida, continue o cultivo das células por quatro horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Prepare os reagentes de transfeção antes do final da incubação de quatro horas. As células HEK 293T serão transfectadas com os três plasmídeos em uma proporção de 10 microgramas do vetor lentiviral GFP dependente de rev, 7,5 microgramas do construto de empacotamento do HIV-1 e 2,5 microgramas da glicoproteína VSVG.

Primeiro, pré-misture os três DNAs plasmidiais na proporção desejada. Em seguida, prepare dois tubos de poliestireno de cinco mililitros. Adicione 480 microlitros de tampão HBS duas vezes concentrado ao primeiro tubo e ao segundo tubo.

Adicione 60 microlitros de tampão de cloreto de cálcio dois molar aos DNAs plasmidiais e ao tampão de transfeção, até um volume total de 480 microlitros. Em seguida, adicione a mistura de DNA plasmidial com cloreto de cálcio. Gotas a gotas ao tubo HPS duas vezes, incubado em temperatura ambiente por 30 minutos.

Um precipitado fino irá se formar gradualmente. Agora, adicione todos os 960 microlitros da mistura gota a gota, utilizando pipeta, às células HEK 2 9 3 T. Incube a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono, durante a noite.

No dia seguinte, remova o sobrenadante S e adicione 10 mililitros de meio fresco. Incube as células novamente a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, durante a noite. Após 48 horas da transfeção, colete o vírus removendo o sobrenadante e transferindo-o para um tubo estéril de 50 mililitros.

Adicione 10 mililitros de meio fresco à placa de Petri e continue o cultivo durante a noite. Armazene o sobrenadante do vírus a quatro graus Celsius. Continue a coleta após 72 horas da transfeção, reunindo o sobrenadante SUP e combinando-o com o sobrenadante previamente coletado.

Em seguida, centrifugue o sobrenadante S a 500 vezes G durante 15 minutos para formar um pellet e remover os detritos celulares. Após a centrifugação, colete o sobrenadante S e transfira-o para um novo tubo. Em seguida, filtre o sobrenadante através de um filtro Millipore de 0,22 micrometros.

O vírus será ainda mais concentrado por meio de uma coluna de exclusão por tamanho, que será demonstrada a seguir para concentrar partículas virais. Carregue o sobrenadante viral em uma coluna de exclusão por tamanho e centrifugue a 6.000 vezes G a quatro graus Celsius por 15 minutos. Colete o sobrenadante viral concentrado, reservando cerca de 100 microlitros para determinação do título viral.

Aliquote o restante e armazene a menos 80 graus Celsius. A determinação do título viral é um dos aspectos mais críticos deste procedimento. Uma alta multiplicidade de infecção é necessária para superinfecção de células com o vetor VIR GFP.

Para obter uma porcentagem de células GFP positivas detectáveis por citometria de fluxo a fim de determinar o título viral, uma linhagem celular de gato TNF tratada e positiva para HIV V1 será infectada com o sobrenadante viral. Essas células positivas para HIV V1 são cultivadas.

Em uma placa de 96 poços, a 2,5 vezes 10 elevado a cinco células por mililitro, em um volume total de 100 microlitros. Prepare seis diluições seriadas decimais das partículas lentivirais dependentes de rev para infectar as células positivas para HIV-1; adicione 100 microlitros de cada diluição serial do vírus a cada poço contendo células. Incube em uma estufa com dióxido de carbono a 37 graus Celsius por sete dias.

O título da partícula é estimado pela observação de células GFP positivas em um microscópio fluorescente. Os cálculos são realizados seguindo o método de Reid e MU, e o título é determinado como o ponto de diluição que pode resultar em poços GFP positivos. Em 50% dos poços infectados, marca-se IV uma célula positiva com as partículas lentivirais dependentes de rev.

Uma linhagem de células T CD4 humana será primeiramente infectada com HIV-1. Utilizamos dois vezes 10 elevado a cinco células para cada infecção. Duas horas antes da infecção.

Adicione poli cérebro às células até uma concentração final de quatro microgramas por mililitro. Incube a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, infecte as células pipetando a solução de HIV em um dos tubos de cinco mililitros.

Os outros dois tubos de células não são infectados e servirão como controles. Incube todas as células a 37 graus Celsius por duas horas. Após duas horas, centrifugue as células a 300 × g por 10 minutos, remova o vírus livre de células descartando o sobrenadante e re-suspenda as células em meio fresco na concentração de 2 × 10⁵ células por mililitro em cultura a 37 graus Celsius por 48 horas.

Após 48 horas, as células infectadas pelo HIV estão prontas para a infecção. Com partículas lentivirais dependentes da rev, utilize duas vezes 10 elevado a cinco células para infecção com 100 microlitros de partículas lentivirais nas células infectadas pelo HIV V um como controle; células T humanas CD quatro não infectadas pelo HIV V um também são infectadas com 100 microlitros de partículas lentivirais. Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite e no dia seguinte.

Substitua o meio usado por meio fresco e re-suspenda as células em uma concentração de duas vezes 10 elevado a cinco células por mililitro. 48 horas após a infecção, pelletize as células por centrifugação e, em seguida, re-suspenda em 500 microlitros de paraformaldeído a 1%. Transfira as células re-suspensas para um tubo de citometria de fluxo para análise por citometria de fluxo. Após uma incubação de 20 minutos em temperatura ambiente, as células podem ser analisadas em um analisador FACS para detecção de positividade para GFP.

Se os experimentos forem realizados com sucesso, o vetor lentiviral dependente de rev V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A permitirá a detecção altamente específica de HIV em replicação em populações de células vivas por meio da medição da expressão da proteína verde fluorescente GFP. Neste exemplo, células C-E-M-S-S colhidas foram coradas com um anticorpo monoclonal de rato marcado com PE contra CD 24 HSA de camundongo e, em seguida, analisadas em um citômetro de fluxo quanto à expressão de HSA e GFP, conforme mostrado aqui. Uma população considerável de GFP foi detectada em células infectadas com HIV-1 superinfectadas com V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.

Em contraste, células positivas para GFP não foram detectadas em células C-E-M-S-S não infectadas com HIV V nem em células não infectadas com HIV um, com superinfecção lentiviral. Não se esqueça de que trabalhar com HIV pode ser extremamente perigoso, e precauções, como níveis de biossegurança através de práticas apropriadas, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.