Name: Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a identificar células HIV-1 positivas usando um vetor lentiviral dependente de Rev expressando GFP. Este método utiliza citometria de fluxo para quantificar infecção em células T CD4 humanas.

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O trabalho foi suportado em parte pelo Serviço de Saúde Pública conceder 1R01AI081568 de NIAID para YW e pelas generosas doações dos doadores e os pilotos do 2009 do passeio organizado pela AIDS NYCDC M. Rosen e Inc. Day2

1. Transfecção de plasmídeos para Produção de Partículas do Rev-dependente Lentivirus Set up: The Rev-dependente GFP vector lentiviral, PNL-GFP-RRE-SA, foi descrita anteriormente 4,5,6. Para montar em uma partícula viral, o plasmídeo foi contransfected em HEK293 células T com um HIV-1 construção de embalagens, pCMVΔ8.2 (gentilmente cedido pelo Dr. Dider Trono), e um plasmídeo carregando a glicoproteína VSV-G (pHCMV-G) . A transfecção foi realizada usando o método de fosfato de cálcio. Preparação de tampões: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) foi preparada pela dissolução de 5 g de Hepes, 8 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 1 g de Dextrose, 0,103 g de Na 2 HPO 4 (anidro) em 100 mL de H 2 O. Alíquota the10 X tampão HBS em 1 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C. No momento da transfecção, converter o 10 X 2 X HBS para HBS com H 2 O (1: 5 de diluição), e ajustar o pH entre 7,05-7,12. (Para 10 mL 2 X HBS, que normalmente necessita de aproximadamente 50 mL de NaOH 1M). Filtro de esterilizar o tampão HBS 2X passando por um filtro Millipore 0,22 mM. CaCl tampão 2 foi feita pela dissolução CaCl 2 em 10 mM Hepes a uma concentração de 2M final. Ajustar o pH para 5,8, filtro de esterilizar o buffer e armazenar a 4 ° C. Procedimento: <ol><li> Um dia antes da transfecção, as sementes de 2 x 10 6 células HEK293T em um prato de Petri de 100 mm, e cultivar células durante a noite em 10 mL DMEM + 10% FBS a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> No dia seguinte, retire o sobrenadante das células e substituir com 5 mL fresco DMEM + 10% FBS, as células continuamente cultura por 4 horas. </li><li> Em um tubo de poliestireno 5 mL, adicionar 480 mL 2X tampão HBS. </li><li> Em um segundo tubo de poliestireno 5 mL, adicionar 60 mL 2M CaCl 2 buffer, o DNA do plasmídeo, e transfecção tampão TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8.0) para um volume total de 480 mL. Para cada placa de Petri, plasmídeos deve ser adicionado na proporção de 10 mg de PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 mg de pCMVΔR8.3, e 2,5 mg de pHCMV-G. </li><li> Adicione o plasmídeo DNA-CaCl 2 mistura gotas ao tubo de 2 HBS X, e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. A multa será precipitar formulário. </li><li> Adicione a 960 mL da mistura de gotas, com uma pipeta para as células. Incubar a 37 ° CO C, 5% 2 durante a noite. </li><li> No dia seguinte, remover o sobrenadante e adicionar 10 mL fresco DMEM + 10% FBS, e continuamente incubar as células a 37 ° CO C, 5% 2 durante a noite. </li><li> Menos 48 horas após a transfecção colheita, o vírus através da remoção do sobrenadante e transferindo-o para 50 mL tubos estéreis. Adicionar 10 mL fresco fresco FBS DMEM + 10% em cada Placa de Petri e continuar a cultura durante a noite. Armazenar o sobrenadante vírus a 4 ° C. </li><li> Continuar a colheita em 72 horas após a transfecção, recolhendo o sobrenadante. Combine todos os sobrenadantes e centrifugar o sobrenadante a 500 xg por 15 minutos para pellet e remover restos celulares. </li><li> O sobrenadante foram coletadas e filtradas por um filtro Millipore 0,22 mM. O vírus foi mais concentrado através de tamanho-exclusão colunas. </li></ol> 2. Concentre-se partículas virais e Determine título viral <ol><li> Partículas virais foram concentrados por uma coluna de tamanho-exclusão (100.000 MW cortado, Centricoin). Sobrenadante viral foi carregado na coluna e centrifugado a 6000 xg, a 4 ° C por 15 minutos. </li><li> Sobrenadante viral concentrado foi coletadas, aliquotado e armazenado a -80 ° C. </li><li> O título viral foi determinada por infecção de uma TNF-tratadas, HIV-1 linha celular positiva Jacket, J1.1 7. As células foram cultivadas em uma placa de 96 poços de 2,5 x 10 5 células por mL (100 mL de volume total), e infectados com 100 mL de serialmente diluída VNL-GFP-RRE-SA por uma semana. O título (TCID50) da partícula foi estimado pela contagem dos poços GFP positivas seguindo o método de Reed e Muench 8. </li></ol> 3. Marcação HIV-1 células positivas com o Particle Lentivirus, VNL-GFP-RRE-SA Set up: um ser humano de células T CD4 linha, CEM-SS, foi o primeiro infectado com HIV-1. Menos 48 horas após a infecção, as células foram superinfected com as partículas lentiviral, VNL-GFP-RRE-SA. Seguintes superinfecção por mais dois dias, a GFP células positivas foram analisadas por citometria de fluxo. Como controle, não infectados pelo HIV-1 CEM-SS células foram infectadas com idêntica VNL-GFP-RRE-SA. Somente o HIV-1-infected CEM-SS células deram origem a células GFP positivas, mas não o HIV-1 não infectados CEM SS-células. Procedimento: <ol><li> Duas horas antes da infecção, adicione polybrane para uma concentração final de 4 mg / mL. Contagem de células e tomar 2 x 10 5 células para cada infecção. Infectar as células com 200 ng (p24) do HIV-1 NL4-3 para 2 horas. </li><li> Lavar as células por centrifugação a 300 xg por 10 minutos, ressuspendercélulas em 2 x 10 5 células / mL, e da cultura a 37 ° C por 48 horas. </li><li> Contagem de células e tomar 2 x 10 5 células por infecção com VNL-GFP-RRE-SA. Adicione 100 ml de VNL-GFP-RRE-SA e incubar a 37 ° C durante a noite. Lavar e ressuspender as células em 2 x 10 5 células / mL. </li><li> Realizar análises de citometria de fluxo em 48 horas após a superinfecção. Células infectadas foram peletizadas e ressuspenso em 500 mL paraformaldehede 1%, incubadas em temperatura ambiente por 20 minutos, e então analisados ​​em um analisador FACScan (Becton Dickinson). </li></ol> 4. Resultados representante Se os experimentos são realizados com sucesso, uma população considerável GFP será detectada em HIV-1-infected CEM-SS células pelo citômetro de fluxo, enquanto que, no controle, as células GFP positivas não será detectada em HIV-1 não infectados CEM-SS células. Se os experimentos são realizados com sucesso, o vetor Rev-dependente lentiviral, VNL-GFP-RRE-SA, irá permitir a detecção altamente específico de HIV replicação em que vivem populações de células, através da medição da fluorescência verde expressão da proteína (GFP). Neste exemplo, colhidas CEM-SS células foram marcadas com um anticorpo de rato PE-rotulados monoclonais contra CD24 do mouse, HSA, em seguida, analisados ​​em um citômetro de fluxo para ambos HSA e expressão GFP. <img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Como mostrado aqui, uma população considerável GFP foi detectado em HIV-1 as células infectadas com superinfected VNL-GFP-RRE-SA (Figura 1c). Em contraste, as células GFP positivas não foram detectados em ambos os HIV-1 não infectados CEM SS-células sem superinfecção lentiviral (Figura 1a) ou HIV-1 células não infectadas com superinfecção lentiviral (Figura 1b).

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Como com o anteriormente desenvolvidos vetores Tat-dependente expressão, o sistema Rev aqui descrito é uma exploração de um processo de HIV evoluiu. A inclusão de Rev-dependência torna o vetor de expressão LTR baseado altamente dependente da presença de HIV se reproduza. A aplicação deste vector como aqui relatado, um vírus HIV repórter-dependente, oferece uma nova abordagem nova para identificar o HIV de células positivas. O vetor permite o exame de células vivas, podem expressar todo o gene para a experimentação básica ou clínica, e como um lentivírus pseudo-digitado tem acesso a maioria dos tipos de células e tecidos.

<table><tbody><tr><td>Cápsula de segurança biológica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora a 37&amp;#x00B0;C e 5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allega&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador a 4&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador a -20&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador a -80&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>Linhagem celular HEK293T</td><td>Institutos Nacionais de Saúde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linhagem celular CEM-SS</td><td>Institutos Nacionais de Saúde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linhagem celular Jurkat J1.1</td><td>Institutos Nacionais de Saúde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>FBS HI</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>preparado por transfeção de células HeLa com DNA proviral clonado</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>deleção completa de todos os ORFs do HIV em pNL4-3</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>Inserir os segmentos A5 e D4 do HIV-1 em pNL-GFP-RRE</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>fornecido pelo Dr. Dider Trono</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBS 10x (solução salina tamponada com Hepes)</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2M</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Água sanitária</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>Tubos redondos de 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Millipore de 0,45&amp;mu;M</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Millipore de 0,20&amp;mu;M</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de exclusão por tamanho (corte em 100.000 MW)</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>Tubo congelador de 2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT- 175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

marcação específica de hiv-1 células positivas utilizando um vector rev-dependente lentivirus expressando a proteína verde fluorescente

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

A maioria dos vetores de HIV-responsive expressão são baseados no promotor do HIV, a repetições terminais longas (LTR). Enquanto resposta a uma proteína HIV cedo, Tat, a LTR também é sensível aos estados de ativação celular e à atividade da cromatina locais onde a integração ocorreu. Isso pode resultar em atividade HIV-independentes de alto, e restringiu a utilidade do LTR baseado repórter às células marca HIV positivo 1,2,3. Aqui, construímos um vetor de expressão lentiviral que possui, além da LTR Tat-responsiva, inúmeras sequências de DNA do HIV que incluem o elemento Rev-resposta e os locais de emenda HIV 4,5,6. O vetor foi incorporado um vírus repórter lentiviral, permitindo a detecção altamente específico de HIV replicação em populações de células vivas. A atividade do vetor foi medida pela expressão da proteína fluorescente verde (GFP). A aplicação deste vector como o aqui relatado oferece uma abordagem nova alternativa aos métodos existentes, tais como PCR in situ ou a coloração do antígeno HIV, para identificar o HIV de células positivas. O vetor também pode expressar genes terapêuticos para a experimentação básica ou clínica para alvejar HIV-positivos células.

Nós desenvolvemos um vetor lentiviral que possui, além da LTR Tat-responsivo, o elemento Rev-resposta (RRE), que pode regular a expressão do gene repórter de uma forma HIV-1 Tat e Rev-dependente. O vetor permite a detecção específica de HIV replicar em células vivas através da expressão da GFP.

Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

A maioria dos vetores de expressão responsivos ao HIV baseia-se no promotor do HIV, a repetição terminal longa (LTR). Embora sejam responsivos a uma proteína precoce do HIV, Tat, ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar células positivas para HIV utilizando um vetor lentiviral dependente da proteína Rev do HIV-1 que carrega a proteína verde fluorescente. Isso é realizado primeiramente produzindo partículas lentivirais dependentes da Rev por meio de cotransfeção. O segundo passo do procedimento é infectar células T humanas CD4 com o HIV-1.Em seguida, as células T CD4 humanas positivas para HIV são superinfectadas com partículas lentivirais portando o gene GFP. O passo final é identificar as células positivas para HIV mediante a medição de células positivas para GFP por citometria de fluxo. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram a porcentagem de células positivas para GFP por meio de citometria de fluxo.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia da infecção por HIV, devido ao fato de que o vetor dependente da rev também pode entregar e expressar seletivamente genes terapêuticos em células infectadas pelo HIV para induzir a eliminação de células positivas para o HIV. Demonstrando o procedimento estará gi, um professor assistente pesquisador do nosso laboratório, para produzir partículas lentivirais dependentes da rev. Células HEK 293T são transfectadas com três plasmídeos: o vetor lentiviral GFP dependente da rev, o construto de empacotamento do HIV-1 e um plasmídeo portador da glicoproteína VSVG. Um dia antes da transfeção dos plasmídeos, semeie duas vezes 10 à sexta potência de células HEK 293T em 10 mililitros de meio.Em uma placa de Petri de 100 milímetros, cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, substitua o sobrenadante das células por cinco mililitros de meio fresco.Em seguida, continue o cultivo das células por quatro horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Prepare os reagentes de transfeção antes do final da incubação de quatro horas. As células HEK 293T serão transfectadas com os três plasmídeos em uma proporção de 10 microgramas do vetor lentiviral GFP dependente de rev, 7,5 microgramas do construto de empacotamento do HIV-1 e 2,5 microgramas da glicoproteína VSVG.Primeiro, pré-misture os três DNAs plasmidiais na proporção desejada. Em seguida, prepare dois tubos de poliestireno de cinco mililitros. Adicione 480 microlitros de tampão HBS duas vezes concentrado ao primeiro tubo e ao segundo tubo.Adicione 60 microlitros de tampão de cloreto de cálcio dois molar aos DNAs plasmidiais e ao tampão de transfeção, até um volume total de 480 microlitros. Em seguida, adicione a mistura de DNA plasmidial com cloreto de cálcio. Gotas a gotas ao tubo HPS duas vezes, incubado em temperatura ambiente por 30 minutos.Um precipitado fino irá se formar gradualmente. Agora, adicione todos os 960 microlitros da mistura gota a gota, utilizando pipeta, às células HEK 2 9 3 T. Incube a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono, durante a noite.No dia seguinte, remova o sobrenadante S e adicione 10 mililitros de meio fresco. Incube as células novamente a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, durante a noite. Após 48 horas da transfeção, colete o vírus removendo o sobrenadante e transferindo-o para um tubo estéril de 50 mililitros.Adicione 10 mililitros de meio fresco à placa de Petri e continue o cultivo durante a noite. Armazene o sobrenadante do vírus a quatro graus Celsius. Continue a coleta após 72 horas da transfeção, reunindo o sobrenadante SUP e combinando-o com o sobrenadante previamente coletado.Em seguida, centrifugue o sobrenadante S a 500 vezes G durante 15 minutos para formar um pellet e remover os detritos celulares. Após a centrifugação, colete o sobrenadante S e transfira-o para um novo tubo. Em seguida, filtre o sobrenadante através de um filtro Millipore de 0,22 micrometros.O vírus será ainda mais concentrado por meio de uma coluna de exclusão por tamanho, que será demonstrada a seguir para concentrar partículas virais. Carregue o sobrenadante viral em uma coluna de exclusão por tamanho e centrifugue a 6.000 vezes G a quatro graus Celsius por 15 minutos. Colete o sobrenadante viral concentrado, reservando cerca de 100 microlitros para determinação do título viral.Aliquote o restante e armazene a menos 80 graus Celsius. A determinação do título viral é um dos aspectos mais críticos deste procedimento. Uma alta multiplicidade de infecção é necessária para superinfecção de células com o vetor VIR GFP.Para obter uma porcentagem de células GFP positivas detectáveis por citometria de fluxo a fim de determinar o título viral, uma linhagem celular de gato TNF tratada e positiva para HIV V1 será infectada com o sobrenadante viral. Essas células positivas para HIV V1 são cultivadas.Em uma placa de 96 poços, a 2,5 vezes 10 elevado a cinco células por mililitro, em um volume total de 100 microlitros. Prepare seis diluições seriadas decimais das partículas lentivirais dependentes de rev para infectar as células positivas para HIV-1; adicione 100 microlitros de cada diluição serial do vírus a cada poço contendo células. Incube em uma estufa com dióxido de carbono a 37 graus Celsius por sete dias.O título da partícula é estimado pela observação de células GFP positivas em um microscópio fluorescente. Os cálculos são realizados seguindo o método de Reid e MU, e o título é determinado como o ponto de diluição que pode resultar em poços GFP positivos. Em 50% dos poços infectados, marca-se IV uma célula positiva com as partículas lentivirais dependentes de rev.Uma linhagem de células T CD4 humana será primeiramente infectada com HIV-1. Utilizamos dois vezes 10 elevado a cinco células para cada infecção. Duas horas antes da infecção.Adicione poli c&eacute;rebro &agrave;s c&eacute;lulas at&eacute; uma concentra&ccedil;&atilde;o final de quatro microgramas por mililitro. Incube a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, infecte as c&eacute;lulas pipetando a solu&ccedil;&atilde;o de HIV em um dos tubos de cinco mililitros.Os outros dois tubos de células não são infectados e servirão como controles. Incube todas as células a 37 graus Celsius por duas horas. Após duas horas, centrifugue as células a 300 × g por 10 minutos, remova o vírus livre de células descartando o sobrenadante e re-suspenda as células em meio fresco na concentração de 2 × 10⁵ células por mililitro em cultura a 37 graus Celsius por 48 horas.Após 48 horas, as células infectadas pelo HIV estão prontas para a infecção. Com partículas lentivirais dependentes da rev, utilize duas vezes 10 elevado a cinco células para infecção com 100 microlitros de partículas lentivirais nas células infectadas pelo HIV V um como controle; células T humanas CD quatro não infectadas pelo HIV V um também são infectadas com 100 microlitros de partículas lentivirais. Incube as células a 37 graus Celsius durante a noite e no dia seguinte.Substitua o meio usado por meio fresco e re-suspenda as células em uma concentração de duas vezes 10 elevado a cinco células por mililitro. 48 horas após a infecção, pelletize as células por centrifugação e, em seguida, re-suspenda em 500 microlitros de paraformaldeído a 1%. Transfira as células re-suspensas para um tubo de citometria de fluxo para análise por citometria de fluxo. Após uma incubação de 20 minutos em temperatura ambiente, as células podem ser analisadas em um analisador FACS para detecção de positividade para GFP.Se os experimentos forem realizados com sucesso, o vetor lentiviral dependente de rev V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A permitirá a detecção altamente específica de HIV em replicação em populações de células vivas por meio da medição da expressão da proteína verde fluorescente GFP. Neste exemplo, células C-E-M-S-S colhidas foram coradas com um anticorpo monoclonal de rato marcado com PE contra CD 24 HSA de camundongo e, em seguida, analisadas em um citômetro de fluxo quanto à expressão de HSA e GFP, conforme mostrado aqui. Uma população considerável de GFP foi detectada em células infectadas com HIV-1 superinfectadas com V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.Em contraste, células positivas para GFP não foram detectadas em células C-E-M-S-S não infectadas com HIV V nem em células não infectadas com HIV um, com superinfecção lentiviral. Não se esqueça de que trabalhar com HIV pode ser extremamente perigoso, e precauções, como níveis de biossegurança através de práticas apropriadas, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este experimento visualizado é um guia para a utilização de um clone fluorescentes molecular do HIV para viver experiências imagem confocal.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

Vectores de expressão lentivirais são os veículos mais eficazes para expressando estavelmente diferentes moléculas efectoras ou construções repórter em divisão e não se dividem as células de mamíferos e organismos inteiros. Aqui nós fornecemos um protocolo sobre como empacotar construções de expressão lentivector em partículas pseudoviral e transdução de células alvo, utilizando as partículas pseudoviral.

Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

Nós descrevemos um clone molecular da Maedi-visna vírus que expressa a GFP e é totalmente infecciosas. Replicação deste vírus pode ser detectado por meio de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.

Propagação e detecção de um Clone Infecciosas Molecular da Maedi-visna vírus que expressa a proteína fluorescente verde

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de...

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Desde a descoberta do gene da proteína fluorescente verde, as proteínas fluorescentes têm impactado a biologia celular molecular. Este protocolo descreve como a expressão de proteínas fluorescentes distintas por meio da engenharia genética é usada para codificar células individuais. O procedimento permite rastrear populações distintas em uma mistura de células, o que é ideal para aplicações multiplexadas.

Barcoding Genetic com proteínas fluorescentes para Aplicações Multiplexados

Descrito é uma metodologia para quantificar a expressão dos 96 genes e 18 proteínas de superfície por células únicas ex vivo, permitindo a identificação de diferencialmente expressaram genes e proteínas em células infectadas por vírus em relação as células não infectadas. Aplicamos a abordagem de estudo CD4 infectadas SIV+ T células isoladas de macacos rhesus.

Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Descrevemos um ensaio baseados em células para relatório sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente detectável por microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Ele pode ser usado para testar a inibidores de entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula a célula.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.

Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Aprenda a identificar células HIV-1 positivas usando um vetor lentiviral dependente de Rev expressando GFP. Este método utiliza citometria de fluxo para quantificar infecção em células T CD4 humanas.

Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente (Vídeo) | JoVE Journal

Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

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