Preparação de coração de rato altamente acoplado mitocôndrias
September 23rd, 2010
Descrevemos а protocolo para o isolamento de puro coração de rato, altamente acoplado mitocôndria para estudos funcionais ou estruturais da bioenergética celular, medições biofísicas, proteômica ou DNA mitocondrial e análise de lipídios.
Eu sou a Dra. Ska. Hoje vou mostrar como isolar as mitocôndrias do coração vermelho. As principais etapas ao isolar as mitocôndrias dos tecidos são, em primeiro lugar, a ruptura do tecido e das células por tratamento mecânico ou enzimático.
Em segundo lugar, centrifugação diferencial em baixa velocidade para remover detritos e células e núcleos quebrados. E terceiro, centrifugação de alta velocidade para coletar mitocôndrias. Os instrumentos e soluções foram preparados e armazenados na câmara fria com antecedência.
Várias condições devem ser mantidas durante o isolamento. Mitocôndrias primeiro, ruptura completa do tecido, uma vez que afeta diretamente o rendimento das mitocôndrias. Em segundo lugar, mantenha a temperatura baixa durante todas as etapas, mas tome cuidado com o excesso de congelamento de soluções, especialmente durante a centrifugação.
Terceiro, quanto mais rápido você operar, melhor será a qualidade das mitocôndrias obtidas. Os animais foram terminados de acordo com a Lei de Procedimentos Científicos Animais do Reino Unido e todas as operações a seguir foram realizadas na câmara fria. Prepare três copos contendo 40 mils de tampão de lavagem.
Deixe esfriar no banho de gelo vendido por três a cinco minutos antes de prosseguir para a próxima etapa. Certifique-se de não congelá-los demais e use imediatamente logo após nuvens de cristais de gelo começarem a aparecer, abra rapidamente o tórax do vermelho decapitado e extraia o coração. Faça pequenas incisões e, em seguida, transfira imediatamente o coração para a solução gelada.
No primeiro copo, aperte o coração para remover o sangue e coloque-o no segundo copo. Repita esta operação para cada coração. O resfriamento e a lavagem rápidos dos corações removidos são essenciais para obter uma preparação padrão livre de hemoglobina, eritrócitos e adas.
Seque os corações no papel de filtro. Remova toda a gordura, sangue coagulado rápido e artéria. E puxe o tecido ventricular.
Em seguida, significa puxar o tecido com uma pequena tesoura curva na placa de Petri Por cinco minutos, coloque o tecido do MIT no tecido. Pressione e passe-o. Após a prensa de tecidos, transferir o material para o copo com 50 ml de tampão de lavagem e dirigir.
Em seguida, filtre a suspensão através de um filtro de ilha. Lave o lenço de papel do homem no filtro três vezes com o tampão de lavagem e descarte o filtro. Transfira o lenço de lavagem para 20 mils de tampão de lavagem e coloque-o no banho de gelo no exterior magnético.
Adicione viagens em solução sob direção constante e inicie o cronômetro no quarto minuto de incubação. Homogeneizou brevemente a suspensão porção por porção, um pouco de cada vez, usando um pequeno homogeneizador de Teflon de vidro frouxamente ajustado. Após homogeneização, transferir a suspensão para outro copo num segundo boi.
Repita o procedimento no nono minuto, para que você faça a homogeneização duas vezes no total após a segunda homogeneização. No 15º minuto de incubação, adicione 10 ml de tampão isolante contendo inibidor de tripsina e incube por mais um minuto, Filtre a suspensão novamente através de um filtro de nylon. Mas, nesse caso, salve o filtrado, transfira o resto do tecido para o homogeneizador e homogeneize.
Durante mais um minuto, combinar o homogenato com o filtrado no tubo de centrifugação. Certifique-se de que os tubos estejam igualmente equilibrados e faça uma centrifugação em baixa velocidade por 15 minutos. A 600 G, filtrar cuidadosamente o sobrenadante resultante para um novo tubo de centrifugação.
Tente evitar a contaminação por um pellet e centrifugue novamente por 15 minutos a 8.500 G.Após centrifugação de alta velocidade, descarte o sobrenadante e enxágue o pellet com um tampão tentando descartar a camada externa branca e fofa. Adicione um macho de tampão de isolamento. Incline o tubo de um lado para o outro e remova o resto do tampão.
Quebrar o pellet com a ula tentando evitar a mancha vermelha dos eritrócitos no fundo, resp, suspender o pellet com um pequeno homogeneizador ou, alternativamente, por meio de um tom suave, diluir a suspensão com mais tampão isolante e centrifugar novamente por 15 minutos a 8.500 G. Rejeitar o sobrenadante S Resus. Suspenda o pellet no tampão de suspensão Resus e centrifugue novamente a 8.500 G. O pellet marrom resultante contém mitocôndrias intactas lavadas. Resus suspende o pellet em um volume muito pequeno de resus suspendendo o tampão.
Quanto menor o volume que você usa, mais estável será a preparação das mitocôndrias. Normalmente, 200 microlitros do tampão por coração são suficientes. O rendimento esperado das mitocôndrias preparadas é de aproximadamente 10 a 15 miligramas de proteína mitocondrial por coração.
E a taxa de controle respiratório em substratos complexos de tal preparação deve estar entre oito e 12. Boa sorte com sua preparação.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para isolar mitocôndrias cardíacas de rato puras e altamente acopladas, essencial para estudar a bioenergética celular e campos relacionados. A metodologia enfatiza a importância de manter baixas temperaturas e processamento rápido para garantir preparações mitocondriais de alta qualidade.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Bioenergética celular
- Proteômica
- Análise mitocondrial
Fundo
- As mitocôndrias desempenham um papel crucial na produção de energia dentro das células.
- Isolar mitocôndrias de alta qualidade é vital para várias análises bioquímicas.
- Manter condições ótimas durante o isolamento é crítico para o rendimento e funcionalidade.
- Este protocolo adere aos padrões éticos para pesquisa animal.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para isolar mitocôndrias cardíacas de rato.
- Facilitar estudos funcionais e estruturais das mitocôndrias.
- Aprimorar a compreensão dos papéis mitocondriais no metabolismo celular.
Métodos Utilizados
- Disrupção mecânica e enzimática do tecido cardíaco.
- Centrifugação diferencial sequencial para separar mitocôndrias de detritos.
- Uso de buffers específicos para manter a integridade mitocondrial.
- Controle cuidadoso da temperatura durante todo o processo de isolamento.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de mitocôndrias intactas com mínima contaminação.
- Rendimento de aproximadamente 10 a 15 mg de proteína mitocondrial por coração.
- Proporção de controle respiratório indicando a qualidade funcional das mitocôndrias.
- O protocolo permite análises adicionais do DNA e lipídios mitocondriais.
Conclusões
- O protocolo descrito é eficaz para isolar mitocôndrias cardíacas de rato de alta qualidade.
- Manter baixas temperaturas e processamento rápido é essencial para o sucesso.
- Este método pode ser aplicado a vários estudos em pesquisa mitocondrial.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
High-quality isolation of rat heart mitochondria underpins robust discovery-stage research in cellular bioenergetics, metabolic regulation, and mitochondrial signaling. This preparation enables predictive confidence in functional assays and supports translational continuity across metabolic and cardiovascular research portfolios. Reliable mitochondrial isolation is foundational for mechanistic de-risking and target validation in early-stage biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial function in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by providing intact organelles for pathway analysis.
- Facilitates target validation through quantitative assessment of mitochondrial coupling and bioenergetics.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible mitochondrial preparations for downstream functional assays.
- Ensures assay readiness by delivering high-yield, high-coupling mitochondria suitable for quantitative outputs.
- Enables reliable evaluation of compound effects on mitochondrial respiration and integrity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by supporting analysis of mitochondrial DNA, proteins, and lipids.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation in metabolic and cardiovascular models.
- Reduces biological risk by ensuring functional relevance of isolated mitochondria in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Enables robust hypothesis testing and pathway clarification in mitochondrial research.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mitochondrial preparations for assay development.
- Analytics: Provides functional readouts such as respiratory control ratio for comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity across disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mitochondrial isolation across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial studies.
- Operational Value: Standardizes isolation procedures for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling reliable functional assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic and cardiovascular assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and subcellular fractionation.
- Demands access to cold-room facilities and high-speed centrifugation infrastructure.
- Necessitates strict cross-team standardization for reproducible outputs.
- Adaptable to other tissues or species with protocol optimization.
- Preparation quality is sensitive to timing, temperature, and operator proficiency.
