A célula-célula Assay Transporte Macromoleculares Na Planta Utilizando Bombardeio biobalística

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar o grau de movimentação de célula a célula de uma proteína marcada com fluoróforo na epiderme de plantas. Isso é conseguido obtendo partículas de ouro revestidas com DNA para expressar temporariamente a proteína de fusão de interesse na epiderme vegetal. Como segundo passo, o DNA é introduzido na epiderme da planta, o que permite a expressão e o deslocamento da proteína de fusão testada.

Em seguida, a proteína de fusão expressa é observada em um microscópio confocal para monitorar a expressão e a localização das proteínas testadas marcadas com fluorescência. São obtidos resultados que mostram o grau de transporte de célula a célula da proteína marcada com fluorescência, com base na análise da distribuição do sinal fluorescente por microscopia confocal. Olá, sou Ben Myers do laboratório de KY, do Departamento de Bioquímica e Biologia Celular da Universidade Estadual de Nova York em Stony Brook.

Hoje vamos mostrar um procedimento para analisar o grau de movimentação de célula a célula ou de proteínas marcadas com fluorescência na epiderme de plantas. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o transporte de célula a célula de proteínas de movimentação de vírus vegetais em diversos genótipos de plantas e para comparar a mobilidade de diferentes tipos de proteínas. Vamos começar.

Para iniciar este protocolo, cultive uma planta de Arabidopsis em Promix bx. Em um vaso de tamanho apropriado, utilize uma câmara com controle ambiental com fotoperíodo curto e umidade relativa de 40 a 65% para plantas de Nicotiana, Hamana e tabaco Nicotiana; cultive cada planta em Promix BX em um vaso maior. Mais uma vez, forneça uma câmara com ambiente controlado com fotoperíodo longo e umidade relativa de 40 a 65%.

Fertilize a planta ocasionalmente com produtos comercialmente disponíveis, conforme descrito anteriormente. Após cultivar a planta de Opsis por seis a oito semanas, selecione folhas para o experimento com mais de 15 milímetro por 35 milímetro de tamanho, em que a medida do comprimento inclui o pecíolo para plantas de benanna e NAC; cultive as plantas por sete a dez semanas. Em seguida, selecione folhas maiores que 50 milímetro por 70 milímetro para end benanna e 100 milímetro por 125 milímetro para nac.

Nesses casos, as medidas de comprimento não incluem os peoles. Antes de iniciar a entrega de micropartículas revestidas com DNA pelo BIC, prepare a cápsula da arma de genes com micropartículas de ouro revestidas com DNA conforme descrito anteriormente em detalhes. Em seguida, remova as folhas do mesmo estágio de desenvolvimento com uma lâmina de barbear afiada e coloque-as imediatamente com os lados AAL voltados para cima sobre uma superfície plana de isopor.

O lado ABA da folha representa um substrato melhor para bombardeamento devido à sua menor densidade de tricomas e cutícula mais fina. Folhas pequenas, como as de *Arabidopsis*, podem ser imobilizadas cobrindo-as com um pedaço de tela de janela e fixando a tela com alfinetes de corte no suporte de isopor. Mantenha as folhas planas para aumentar a eficiência da entrega de partículas e minimizar os danos ao tecido durante o bombardeamento microscópico.

Em seguida, insira o cartucho com micropartículas revestidas de DNA na pistola. Para um opsis de coelho. Realize o disparo com pressões entre 140 e 160 PSI para micropartículas de 0,6 mícron.

Bombardeie a amostra utilizando um cartucho por folha para espalhar as micropartículas sobre uma área superficial de 10 a 12 milímetros de diâmetro. Para end benanna e end baum. Realize o disparo com pressões de 160 a 180 PSI para micropartículas de 0,6 mícron, com folhas maiores de end benanna e end tobacco.

É possível realizar múltiplos bombardeamentos no mesmo folíolo; no entanto, eles devem ser feitos em posições simétricas em cada lado da nervura central para direcionar áreas foliares no mesmo estágio de desenvolvimento. O sinal fluorescente das proteínas marcadas expressas de forma transitória é visualizado por microscopia confocal. Deve-se ter cuidado para encontrar as configurações ideais de microscopia para a detecção de cada proteína testada.

Utilize uma lente objetiva de 40x para observar proteínas que apresentam acúmulo intracelular limitado com intensidades de sinal fracas, como a localização na membrana plasmática da proteína de movimentação do vírus do mosaico do tabaco ou T-M-V-M-P. Isso proporciona maior resolução e sensibilidade aprimorada. No entanto, uma lente objetiva de 10x com função de zoom confocal pode ser usada para imageamento mais rápido de proteínas que apresentam distribuição citoplasmática com intensidades de sinal fortes, como a proteína fluorescente amarela livre ou YFP. O transporte simplista é inferido pelo aparecimento de aglomerados multi-celulares que contêm o sinal fluorescente.

O número de tais agrupamentos e o número de células em cada agrupamento indicam o grau de transporte de célula a célula. Para obter dados confiáveis, registre pelo menos 100 expressões. Por sistema experimental, cuide para realizar os experimentos simultaneamente.

Quando forem feitas comparações. Aqui, foi detectado o transporte simplista de proteínas marcadas com fluorescência. São apresentadas imagens confocais típicas obtidas após microbombardeamento de uma folha de endro com uma construção que expressa A TMV mp YFP.

Observa-se um movimento simplista do MP do TMV-YFP com base no aparecimento de aglomerados multi-celulares do sinal YFP. No entanto, nem todo MP do TMV-YFP expresso de forma transitória é capaz de se mover, como evidenciado pelo sinal em célula única. Em alguns micro-bombardamentos.

Estatisticamente, em menos de 40% dos agrupamentos de sinal contados, a proteína MP do TMV-YFP é incapaz de se mover entre células. Em contrapartida, em mais de 60% dos agrupamentos, a proteína se desloca entre duas e cinco células. A propagação por duas células sendo a mais frequente, proteínas com tamanho molecular relativamente pequeno e sem atividade inata de movimentação podem difundir-se através da SMA plasmática para se mover de célula a célula.

Por exemplo, a YFP livre ou uma XYFP se espalha entre várias células e mais de 30% dos agregados contados. Inversamente, essa difusão não específica não ocorre para um dímero translacional de YFP ou duas XYFP, que é comparável em tamanho à proteína de fusão TMV MP YFP e é completamente autônoma celularmente. Acabamos de mostrar como analisar o movimento de célula a célula de proteínas marcadas com fluorescência utilizando expressão transitória por um sistema de canhão de genes na epiderme de plantas.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar plantas saudáveis e vigorosas, partículas de ouro revestidas com DNA de alta qualidade para a entrega do DNA e analisar um número suficiente de agrupamentos de expressão para obter resultados estatisticamente confiáveis. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.