Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

Neste vídeo, vamos demonstrar como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do olho do rato e cultivá-las em cultura para dar forma clonal esferas da retina. As esferas que estão isolados possuem as propriedades cardeal de células-tronco: a auto-renovação e multipotencialidade.

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células-tronco da retina do epitélio ciliar do olho. Isso é feito primeiro limpando e cortando o olho ao meio, começando pelo nervo óptico, cortando a córnea e voltando ao nervo óptico e, em seguida, removendo a retina neural e o cristalino. A segunda etapa do procedimento é cortar o epitélio ciliar cortando a íris da córnea e o epitélio pigmentado da retina.

A terceira etapa do procedimento é tratar enzimaticamente o epitélio ciliar, remover a esclera e dissociar mecanicamente o epitélio em células únicas. A etapa final do procedimento é ressuspender as células em meio livre de soro e colocá-las em placas de cultura de tecidos contendo meio livre de soro com fatores de crescimento. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram prospectivamente o número de células-tronco encontradas no epitélio ciliar do olho por meio da esfera clonal, formação in vitro.

Olá, meu nome é Brenda Coles. Nosso laboratório surgiu pela primeira vez com esse método quando estávamos pesquisando artigos sobre as capacidades regenerativas de anfíbios e peixes em seus olhos, e levantamos a hipótese de que talvez houvesse uma célula no olho dos mamíferos com as mesmas capacidades. O isolamento das células-tronco da retina é realizado em uma sala estéril específica dedicada a experimentos de cultura primária.

Antes de iniciar este procedimento, configure o microscópio de dissecação e a fonte de luz fria e, em seguida, coloque os instrumentos de dissecação estéreis. Cada capuz possui um esterilizador de batida quente para esterilizar os instrumentos entre as etapas. Isolaremos as células-tronco da retina dos olhos que foram colocados imediatamente em uma placa de Petri estéril contendo líquido cefalorraquidiano artificial Após a remoção de camundongos sacrificados de acordo com os protocolos de ética animal aprovados, o aspecto mais difícil deste procedimento é dissecar um objeto redondo ao microscópio.

Deve-se tomar muito cuidado para não destruir o tecido de interesse Sob o microscópio de dissecação, limpe o olho com uma pinça. Livre-se do cabelo e do tecido conectado que está preso à borda escleral da córnea. Em seguida, transfira o olho para um novo prato com A CSF enquanto mantém o olho parado com uma pinça serrilhada.

Use uma tesoura de microdissecação angular para remover os músculos oculares. Remova o nervo óptico também, se ainda estiver preso ao olho, tente não esmagar o olho durante esse processo. Transfira os olhos para um novo prato com um LCR.

Em seguida, usei uma tesoura de microdissecação curva para cortar o olho ao meio. Comece no nervo óptico e corte o meio da córnea, encontrando-se de volta ao nervo óptico onde o corte foi iniciado. É ideal que as duas partes do olho sejam aproximadamente equivalentes em tamanho, pois isso facilitará o próximo passo.

Segurando as córneas usando duas pinças, separe suavemente as duas metades dos olhos. Remova e descarte as vísceras do cristalino e a retina neural das conchas dos olhos. Transfira as cascas para um novo prato com A CSF.

Agora estamos prontos para isolar o epitélio ciliar. Para começar, oriente a concha do olho de modo que a córnea fique à sua direita e o epitélio pigmentado da retina à sua esquerda. Prenda suavemente a concha do olho com uma pinça reta no lado do EPR.

Em seguida, use o bisturi para cortar a córnea e a íris do epitélio ciliar do olho, empurrando suavemente o bisturi para baixo, em vez de usar movimentos de serra. Depois disso, corte o epitélio ciliar do EPR. Use uma pinça não serrilhada para transferir a tira de epitélio ciliar para uma nova placa de 35 milímetros contendo A CSF.

Da mesma forma, isole o epitélio ciliar da outra concha do olho. Uma vez coletadas as tiras do epitélio ciliar, transfira-as para um prato de 35 milímetros contendo dois mililitros de dis espaço. Coloque o prato com as tiras em uma incubadora de 37 graus Celsius por 10 minutos.

Após 10 minutos, transfira as tiras do espaço dis para um prato contendo dois mililitros de gotas filtradas em Halle ur haase e ácido reico gentil. Coloque o prato a 37 graus Celsius por 10 minutos. Agora retorne ao microscópio de dissecação enquanto segura a esclera com uma pinça reta.

Use a parte inferior da pinça curva não classificada para raspar suavemente o epitélio ciliar para longe da esclera. Remova a esclera do prato. Tudo isso deve ser deixado no prato.

Agora estão as células de interesse e a solução enzimática. Usando uma pipeta de algodão polido com tampa, transfira a solução para um tubo de 14 litros. Tritrate esta solução 30 vezes para separar as células epiteliais, forçando suavemente a solução para dentro e para fora da pipeta, centrifugue o tubo por cinco minutos a 1500 RPM.

Quando a centrifugação estiver concluída, remova o tubo da centrífuga com cuidado. Uma vez que as células são propensas a sair do fundo do tubo. Nesta fase, aspire suavemente a maior parte da SuperNet usando uma pipeta polida a fogo e, em seguida, adicione um mililitro de inibidor de tripsina em meio livre de soro às células.

Use uma pipeta de algodão de poço pequeno para tri a amostra aproximadamente 50 vezes até que seja uma suspensão de célula única. Centrifugue novamente o tubo durante cinco minutos. A 1500 RPM, remova o sobrenadante e substitua por um mililitro do seu revestimento.

Leve à geladeira suavemente usando uma pipeta de vidro polido a fogo para ressuspender as células. Depois de contar as células, coloque-as na densidade desejada. Em uma placa de 24 poços, geralmente colocamos 10 células por microlitro, enchendo cada poço primeiro com meio e, em seguida, adicionando a suspensão celular para obter um volume final de 500 microlitros de meio.

Coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, onde ela não será movida até que você conte as esferas que surgem após sete dias, quando este procedimento for realizado com sucesso. As células epiteliais ciliares dissecadas devem ficar assim após serem dissociadas e plaqueadas em baixa densidade. Após sete dias em cultura, as esferas de células-tronco da retina que surgem são contadas.

Uma esfera deve ter mais de 75 mícrons de diâmetro e flutuar livremente para ser contada como uma esfera derivada de células-tronco. No entanto, algumas células terão proliferação limitada e formarão PHE que não atendem ao critério de tamanho e não serão contadas como esferas derivadas de células-tronco. Um exemplo de tal asteróide é mostrado aqui Após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das ciências da visão explorarem a possibilidade de usar células-tronco da retina no tratamento de doenças da retina.