Name: Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco da retina do epitélio ciliar do olho de rato e cultivá-las para formar esferas retinianas clonais. Este método demonstra propriedades de autorrenovação e multipotencialidade.

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Agradecemos a Laura Clarke pelo seu inestimável apoio. Este trabalho é suportado pelo NCE: Rede de Células-Tronco, CIHR e NIH.

1. Preparar as soluções Dissecting e soluções enzimáticas <ol><li> Faça o fluido cerebral Artificial Spinal (ACSF) eo soro de mídia livre antes do tempo e leve à geladeira. </li><li> Pesar o ácido cinurênico (0,2 mg / mL) e dissolver em 10 mL de hilo ACSF em um banho-maria 37 ° C antes do tempo, uma vez que não se dissolve prontamente. </li><li> Pesar a tripsina (1,33 mg / mL) e hialuronidase (0,67 mg / mL) e coloque em um tubo de 15 mL e mantê-lo a -20 ° C até ser necessário. Adicionar a solução de ácido cinurênico a este tubo e filtrar através de um filtro de seringa de 22 M apenas antes de usar. </li><li> Pesar inibidor de tripsina (Ovamucoid: 1 mg / mL) e dissolver em água morna soro livre de Mídia e filtro com filtro de seringa de 22μm. </li><li> Fazer a media chapeamento: Soro sem mídia contendo FGF2 (10 ng / mL) e heparina (2 mg / mL). </li></ol> 2. Isolar células estaminais da retina do olho do rato <ol><li> Isolamento das células-tronco da retina é realizado em uma sala específica estéril dedicada a experimentos de cultura primária. Antes de iniciar este procedimento, configure o microscópio de dissecação e de luz fria de origem e, em seguida, estabelecer os instrumentos estéreis de dissecação. Cada capa tem um esterilizador quente talão para a esterilização dos instrumentos entre as etapas. </li><li> Vamos isolar células-tronco na retina dos olhos que foram colocados imediatamente em uma placa de Petri estéreis, contendo Fluid Cerebral Artificial Spinal (ACSF) após a sua retirada de camundongos sacrificados de acordo com a ética protocolos animais aprovados. </li><li> Sob o microscópio de dissecação, limpar o olho com uma pinça: livrar-se do cabelo e do tecido conjuntivo que é anexado à córnea / border escleral. Em seguida, transferir o olho a um novo prato com ACSF. </li><li> Enquanto delicadamente segurando o olho parado com uma pinça serrilhada, use ângulo micro-dissecando tesouras para remover os músculos oculares. Remover o nervo óptico, bem como se ele ainda está ligado ao olho. Tente não esmagar o olho durante este processo. Transferência de olhos para um novo prato com ACSF. </li><li> Use próxima curva micro-dissecando tesoura para cortar o olho ao meio: começar no nervo óptico e passou no meio da córnea, reunião de volta ao nervo óptico onde o corte foi iniciado. O ideal é que as duas partes do olho são aproximadamente equivalentes em tamanho, porque isso vai dar o próximo passo mais fácil. </li><li> Segurando as córneas utilizando duas pinças, descascar delicadamente o olho duas metades separadas. Remova e descarte a lente, vísceras, ea retina neural das conchas dos olhos. Transferir as cascas para um novo prato com ACSF. </li><li> Agora estamos prontos para isolar o epitélio ciliar. Para começar, orientar shell o olho para que a córnea está à sua direita eo epitélio pigmentado da retina (EPR) é à esquerda. Suavemente o pino shell olho para baixo com uma pinça reta do lado RPE. </li><li> Em seguida, use um bisturi para cortar a córnea ea íris longe do epitélio ciliar do olho empurrando levemente para baixo sobre o bisturi ao invés de usar movimentos de corte. </li><li> Depois disso, corte o epitélio ciliar longe do RPE. Uso não-serrilhada fórceps para transferir a faixa de epitélio ciliar de um prato de 35 mm contendo novas ACSF. </li><li> Da mesma forma, isolar o epitélio ciliar da shell outro olho. </li><li> Uma vez que ambas as tiras ciliar epiteliais foram recolhidos, transferir as tiras em um prato de 35 mm contendo 2 ml de Dispase. Coloque o prato com as tiras em uma incubadora de 37 ° C por 10 minutos. </li><li> Após 10 minutos, transferir as faixas a partir do Dispase em um prato contendo 2 ml de tripsina filtrado, hialuronidase e ácido cinurênico. Coloque o prato a 37 ° C por 10 minutos. </li><li> Agora retorne ao microscópio de dissecação. Enquanto mantém a esclera para baixo com uma pinça reta, use a parte inferior da curva não-serrilhada pinça para delicadamente raspar o epitélio ciliar longe da esclera. </li><li> Remova a esclera do prato. Tudo o que deve ser deixado no prato agora são as células de interesse e da solução enzimática. </li><li> Usando um fogo-polido algodão ligado de pipeta, transferir essa solução para um tubo de 14 ml. Triturar esta solução 30 vezes para quebrar as células epiteliais delicadamente forçando a solução dentro e fora da pipeta. </li><li> Centrifugar o tubo por 5 minutos a 1500 RPM. Quando a centrifugação estiver pronto, retire o tubo da centrífuga cuidadosamente vez que as células são propensas a saindo do fundo do tubo nesta fase. </li><li> Aspirar cuidadosamente a maioria do sobrenadante com uma pipeta-fogo polido, e em seguida, adicione 1 mL de inibidor de tripsina em soro livre de mídia para as células. Use um pequeno furo de algodão ligado de pipeta para triturar a amostra de cerca de 50 vezes até que é uma suspensão de uma única célula. </li><li> Centrifugar o tubo novamente por 5 minutos a 1500 RPM. </li><li> Remover o sobrenadante e substituí-la por 1 mL de seu meio de placas. Triturar delicadamente usando uma pipeta de vidro polido-fogo para ressuspender as células. </li><li> Depois que a contagemção das células da placa, eles na densidade desejada em uma placa de 24 cavidades. Nós placa geralmente 10 células / microlitro, preenchendo cada cavidade primeiro com o meio e depois da adição da suspensão celular para obter um volume final de 500 mL de mídia. </li><li> Coloque a placa em um 37 ° C incubadora de CO 2, onde não será movido até você contar as esferas que surgem após 7 dias. </li></ol> 3. Resultados de isolamento de células-tronco da retina <ol><li> Quando este procedimento é realizado com sucesso, o dissecados ciliar células epiteliais deve ficar assim depois de ter sido dissociadas e banhado em baixa densidade (Figura 1). </li><li> Após 7 dias em cultura, as esferas de células-tronco da retina que surgem são contados. A esfera deve ser superior a 75 m de diâmetro e livre-flutuante para ser contada como uma célula-tronco derivadas esfera. (Figura 2). No entanto, algumas células terão esferóides limitada proliferação e de formulário que não atender critério de tamanho e não será contado como esferas de células-tronco derivadas; um exemplo de um esferóide como é mostrado aqui (Figura 2). </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do mouse ocular 1-3. A metodologia para isolar as tiras de epitélio ciliar pode variar, no entanto as enzimas e metodologia para alcançar uma suspensão de uma única célula foram otimizados neste protocolo. Também é importante que as tiras do epitélio ciliar que foram isolados não contêm grandes quantidades de RPE ou córnea uma vez que estes parecem ter um impacto negativo sobre o número total de esferas que podem ser isoladas de cada olho. Além disso, os meios de comunicação sem soro que fazemos que foi originalmente formulado para o cérebro neurospheres 13, é ideal para o cultivo de células da retina esferas tronco. Deve-se também certificar-se que as células não sejam perturbados depois de terem sido banhado e colocado na incubadora para que as esferas de crescimento não se agregam em conjunto 14. Uma vez que as células-tronco da retina formaram esferas clonal, que pode ser contado para obter um número potencial de células-tronco por olho. As esferas, em seguida, pode ser dissociada em células individuais e várias passagens para verificar auto-renovação ou capacidades diferenciadas em diferentes tipos de células da retina neural e RPE usando diferentes combinações de fatores de crescimento e / ou proteínas.

<table><tbody><tr><td>Microscópio Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de Luz Fria</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>luz óptica com braço duplo</td></tr><tr><td>Tesoura Mini Vannas Curva</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Vannas Angular</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas #7 Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>não serrilhadas</td></tr><tr><td>Pinzas #5 Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>retas</td></tr><tr><td>Pinzas Finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>curvas serrilhadas</td></tr><tr><td>Porta-lâmina #3</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi #10</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador por Contas Quentes</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Cínurênico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 UI</td></tr><tr><td>Inibidor de Tripsina</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 35 mm</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas com algodão</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>polidas com chama</td></tr><tr><td>Tubos de 14 mL</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>Poliestireno</td></tr><tr><td>Meio sem Soro</td><td></td><td></td><td>Ref# 13 para formulação</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 UI</td></tr></tbody></table>

isolamento de células-tronco da retina do olho do rato

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

O adulto do rato com células-tronco da retina (RSC) é uma célula quiescente rara encontrada no epitélio ciliar (CE) do olho de mamífero 1,2,3. A CE é composta por não-pigmentada interior e camadas de células pigmentadas exterior, e as colônias clonais RSC que surgem a partir de uma única célula pigmentada da CE são feitas de ambas as células pigmentadas e não pigmentadas que podem ser diferenciadas para formar todos os tipos de células da retina neural e RPE. Existe alguma controvérsia sobre se todas as células dentro das esferas contêm pelo menos cerca de 4 pigmento, porém as células ainda são capazes de formar os diferentes tipos de células encontradas na retina neural 1-3. Em algumas espécies, como anfíbios e peixes, seus olhos são capazes de regeneração após a lesão 5, no entanto, o olho dos mamíferos não mostra tais propriedades regenerativas. Procuramos identificar as células-tronco in vivo e para compreender os mecanismos que mantêm a retina de mamíferos as células-tronco quiescentes 08/06, mesmo após a lesão, bem como usá-los como uma fonte potencial de células para ajudar a reparar os modelos físico ou genético de lesão ocular através do transplante 9-12. Aqui nós descrevemos como isolar as células ciliares do epitélio do olho do rato e cultivá-las em cultura, a fim de formar a esferas clonal das células da retina-tronco. Como não existem marcadores conhecidos da célula-tronco in vivo, estas esferas são a única maneira conhecida para prospectivamente identificar a população de células-tronco dentro do epitélio ciliar do olho.

Neste vídeo, vamos demonstrar como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do olho do rato e cultivá-las em cultura para dar forma clonal esferas da retina. As esferas que estão isolados possuem as propriedades cardeal de células-tronco: a auto-renovação e multipotencialidade.

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

A célula-tronco retinal (CTR) adulta do camundongo é uma célula quiescente rara encontrada no epitélio ciliar (EC) do olho de mamíferos1,2,3. O EC é composto por...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco retinianas do epitélio ciliar do olho. Isso é realizado primeiramente limpando e cortando o olho ao meio, começando pelo nervo óptico, cortando através da córnea e retornando ao nervo óptico, e então removendo a retina neural e o cristalino. O segundo passo do procedimento consiste em recortar o epitélio ciliar removendo a córnea, a íris e o epitélio pigmentado da retina.O terceiro passo do procedimento é tratar enzimaticamente o epitélio ciliar, remover a esclera e dissociar mecanicamente o epitélio em células isoladas. O passo final do procedimento é ressuspender as células em meio livre de soro e semear-nas em placas de cultura celular contendo meio livre de soro com fatores de crescimento. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram prospectivamente o número de células-tronco encontradas no epitélio ciliar do olho por meio da formação clonal de esferoides in vitro.Olá, meu nome é Brenda Coles. Nosso laboratório desenvolveu este método pela primeira vez quando estávamos pesquisando artigos sobre as capacidades regenerativas de anfíbios e peixes em seus olhos, e formulamos a hipótese de que talvez existisse uma célula no olho de mamíferos com as mesmas capacidades. O isolamento das células-tronco retinianas é realizado em uma sala estéril específica dedicada a experimentos de cultura primária.Antes de iniciar este procedimento, configure o microscópio de dissecação e a fonte de luz fria e, em seguida, organize os instrumentos estéreis de dissecação. Cada cabine possui um esterilizador de calor quente para esterilizar os instrumentos entre os passos. Isolaremos células-tronco retinianas de olhos que foram imediatamente colocados em uma placa de Petri estéril contendo fluido cerebroespinhal artificial após a remoção de camundongos sacrificados de acordo com protocolos aprovados de ética em uso animal. O aspecto mais difícil deste procedimento é a dissecação de um objeto redondo sob o microscópio.Deve-se ter grande cuidado para não destruir o tecido de interesse. Sob o microscópio estereoscópico, limpe o olho com pinça. Remova os pelos e os tecidos conectados que estão aderidos à borda escleral da córnea. Em seguida, transfira o olho para um novo recipiente com A CSF, mantendo o olho imóvel com pinça serrilhada.Use uma tesoura microcirúrgica angular para remover os músculos oculares. Remova também o nervo óptico, caso ainda esteja preso ao olho, tomando cuidado para não esmagar o olho durante esse processo. Transfira os olhos para um novo recipiente com LCR.Em seguida, utilize uma tesoura curva de dissecação microcirúrgica para cortar o olho ao meio. Comece pelo nervo óptico e corte pelo centro da córnea, retornando ao nervo óptico no ponto onde o corte foi iniciado. É ideal que as duas partes do olho tenham tamanhos aproximadamente equivalentes, pois isso facilitará o próximo passo.Segurando as córneas com duas pinças, separe suavemente as duas metades do olho. Remova e descarte as vísceras da lente e a retina neural das conchas oculares. Transfira as conchas para um novo recipiente com A CSF.Agora estamos prontos para isolar o epitélio ciliar. Para começar, oriente a cápsula do olho de modo que a córnea fique à sua direita e o epitélio pigmentado da retina fique à sua esquerda. Prenda suavemente a cápsula do olho com pinças retas no lado do EPR.Em seguida, use o bisturi para cortar a córnea e a íris longe do epitélio ciliar do olho, pressionando suavemente para baixo com o bisturi em vez de usar movimentos de serra. Depois disso, corte o epitélio ciliar longe do epitélio pigmentado da retina (RPE). Use pinças sem serrilhas para transferir a tira de epitélio ciliar para um novo recipiente de 35 milímetros contendo A CSF.Da mesma forma, isole o epitélio ciliar da concha do outro olho. Uma vez que as tiras de epitélio ciliar tenham sido coletadas, transfira-as para uma placa de 35 milímetros contendo dois mililitros de dis space. Coloque a placa com as tiras em um incubador a 37 graus Celsius por 10 minutos.Após 10 minutos, transfira as tiras do espaço de dissecação para um recipiente contendo dois mililitros de gotas filtradas em ácido hialurônico e ácido retinóico. Coloque o recipiente a 37 graus Celsius por 10 minutos. Volte agora ao microscópio de dissecação, mantendo a esclera fixada com pinças retas.Use a parte inferior da pinça curva sem graduação para remover suavemente o epitélio ciliar da esclera. Remova a esclera do recipiente. Tudo o que deve permanecer no recipiente.Agora estão as células de interesse e a solução enzimática. Usando uma pipeta com algodão polido a fogo, transfira a solução para um tubo de 14 litros. Triture esta solução 30 vezes para separar as células epiteliais, forçando suavemente a solução para dentro e para fora da pipeta. Centrifugue o tubo por cinco minutos a 1500 RPM.Quando a centrifugação terminar, retire cuidadosamente o tubo da centrífuga. Como as células tendem a se soltar do fundo do tubo, nesta etapa, aspire suavemente a maior parte do SuperNet utilizando uma pipeta com ponta flamejada e, em seguida, adicione um mililitro de inibidor de tripsina em meio livre de soro às células.Utilize uma pipeta com orifício estreito e tampão de algodão para pipetar a amostra aproximadamente 50 vezes até que se torne uma suspensão de células isoladas. Centrifugue o tubo novamente por cinco minutos. A 1500 RPM, remova o sobrenadante e substitua por um mililitro do seu meio de plaqueamento.Refrigere suavemente o meio usando uma pipeta de vidro polida a fogo para ressuspender as células. Após a contagem, plaque as células na densidade desejada. Em uma placa de 24 poços, geralmente colocamos 10 células por microlitro, preenchendo primeiro cada poço com meio e depois adicionando a suspensão celular para obter um volume final de 500 microlitros de meio.Coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, onde ela não será movida até que você conte as esferas que surgirem após sete dias, quando este procedimento for realizado com sucesso. As células epiteliais ciliares dissecadas devem apresentar esta aparência após serem dissociadas e semeadas em baixa densidade. Após sete dias em cultura, contam-se as esferas de células-tronco retinianas que se formam.Uma esfera deve ter mais de 75 mícrons de diâmetro e estar livre em suspensão para ser contabilizada como uma esfera derivada de célula-tronco. No entanto, algumas células terão proliferação limitada e formarão EHP que não atendem ao critério de tamanho e não serão contadas como esferas derivadas de células-tronco. Um exemplo de tal asteroide é mostrado aqui após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área das ciências da visão explorarem a possibilidade de usar células-tronco retinianas no tratamento de doenças retinianas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar células ganglionares primárias da retina (RGCs) murinas usando citometria de fluxo. Este método permite o estudo futuro dos RGCs, com o objetivo de entender melhor o grande declínio na acuidade visual que resulta da perda de RGCs funcionais em doenças neurodegenerativas.

Isolando células ganglionares da retina murina usando classificação de células ativadas por fluorescência

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

O epithelium retinal do pigment (RPE) é um epitélio multi-funcional do olho. Aqui nós apresentamos um protocolo para estabelecer culturas de célula primária derivadas o RPE murino.

Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

O protocolo descreve explanações organotípicas daretina neurodo camundongo, cultivadas juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE), em meio definido r16, livre de soro e antibióticos. Este método é relativamente simples de executar, menos caro e demorado quando comparado com experimentos in vivo, e pode ser adaptado a inúmeras aplicações experimentais.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

Este protocolo descreve um método para o isolamento de células endoteliais da retina pós-natais murinas otimizado para o rendimento, pureza e viabilidade celular. Essas células são adequadas para abordagens de sequenciamento de próxima geração.

Isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração

Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

As culturas primárias de Müller glia obtidas a partir de retinas de camundongos representam uma ferramenta muito robusta e confiável para estudar a conversão gliaial em células progenitoras de retina após o tratamento de microRNA. Moléculas ou combinações únicas podem ser testadas antes de sua subsequente aplicação de abordagens in vivo .

Culturas celulares primárias para estudar o potencial de regeneração de Murine Müller Glia após tratamento de MicroRNA

Descrevemos um método simples e eficiente para isolar células do epitélio pigmentado da retina (EPR) de olhos de cobaias pigmentadas jovens. Este procedimento permite o acompanhamento de estudos de biologia molecular do EPR isolado, incluindo análises de expressão gênica.

Isolamento de Células Epiteliais Pigmentares da Retina de Olhos de Cobaia

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Aprenda a isolar células-tronco da retina do epitélio ciliar do olho de rato e cultivá-las para formar esferas retinianas clonais. Este método demonstra propriedades de autorrenovação e multipotencialidade.

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

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