Name: Análise de Schwann-astrócito Interações Usando In Vitro Ensaios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprenda ensaios in vitro para estudar interações entre células de Schwann e astrócitos. Este método ajuda pesquisadores a compreender barreiras à regeneração axonal em lesões da medula espinhal.

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Gostaríamos de agradecer a Filipa Warren por sua ajuda espécie.

1. Ensaio de fronteira: <ol><li> Preparação básica: slides Câmara são revestidas com poli-D-lisina lâminas de vidro durante a noite e estéreis são preparados antes de iniciar o experimento. Médio está preparado usando Médio Modified Dulbecco Águia (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS), e 1% penicilina-estreptomicina Fungizon (PSF). Também uma garrafa de cálcio / magnésio livre solução salina equilibrada Hanks (HBSS) é preparado. </li><li> Células de Schwann de rato primários cultivados em frasco são tripsinizados por 3 minutos utilizando Tripsina 0,1%. Cultura primária de astrócitos de ratos é tripsinizados por 5 minutos, utilizando tripsina 0,1%. Tripsina é inativada pela adição de DMEM suplementado com 10% SFB e PSF 1%. </li><li> Células de Schwann e astrócitos tripsinizados são transferidos para tubos de 15 mL em separado falcon e centrifugado a 300G por 5 minutos. </li><li> Células de Schwann e astrócitos são re-suspenso na densidade de 2 x 10 6 (ver secção representativa resultados para variações de densidade celular). </li><li> 50 mL queda de Schwann suspensão de células é colocado em uma extremidade do PDL poços deslize revestido de câmara. A faixa de vidro foi usado para manchar a queda em direção ao centro da câmara para gerar uma borda em linha reta. (Usando um cortador de vidro, um lamínulas de vidro retangular são cortadas longitudinalmente de modo que caberia a largura da câmara de slides utilizado para ensaios de limite) </li><li> A segunda queda de 50 mL de suspensão de astrócitos foi colocado no extremo oposto do mesmo poço e manchada em direção ao centro para criar uma borda em linha reta paralela ao esfregaço primeira queda com um pequeno intervalo 0,2 milímetros entre eles. </li><li> A câmara de slides contendo as gotas são colocadas na estufa a 37 ° C por 2 horas. </li><li> Após 2 horas, as culturas foram lavadas com DMEM para remover não-inscritos restos celulares e meio fresco contendo DMEM / 10% FCS / 1% de PSF acrescentou. Nota: DMEM / 10% FCS / 1% de PSF podem ser complementados com forskolin (2μM) e extrato de hipófise bovina (BPE) (10μg / mL) estimulam a proliferação das células de Schwann. BPE vai fornecer os fatores de crescimento necessário para permitir cultura de células de Schwann e de longo prazo forskolin aumenta o monofosfato de adenosina cíclico níveis dentro das células de Schwann para induzir a proliferação </li><li> As células são cultivadas por cerca de 80-10 dias a 37 ° C, 7% incubadora de CO 2. O meio precisa ser trocada a cada 3 dias. As duas frentes de células acabará por alcançar um ao outro e uma fronteira nítida irá formar entre os dois tipos de células. Nesta fase os experimentos podem ser realizados análise dos fatores envolvidos na formação de fronteira. </li><li> Co-cultura pode ser fixado com formol 4% e as células de Schwann podem ser imunocoloração com anticorpo anti-P75 e astrócitos com anti-GFAP anticorpos para identificar as células em co-cultura. P75 anticorpo reconhece receptor de baixa afinidade NGF em células de Schwann que astrócitos falta. Anti-GFAP anticorpo reconhece a proteína glial ácida firbrillary que localiza-se citoplasma de astrócitos. (Por favor, veja Figura 1A de fronteira representante) </li></ol> 2. Ensaio de migração: <ol><li> 4 pratos bem (15mm poços) são PDL revestido durante a noite e preparados para a criação de monocamadas de astrócitos. </li><li> Cultura de astrócitos primário é tripsinizados por 5 minutos, utilizando tripsina 0,1%. Tripsina é inativada pela adição de DMEM suplementado com 10% SFB e PSF 1% e de células centrifugadas a 300G por 5 minutos. (Veja Figura 2) </li><li> Astrócitos são re-suspenso em 1x10 5 células / mL. 1 mL desta solução é adicionada a cada revestido PDL bem em 4 pratos bem. Astrócitos são cultivadas por 24-48 horas até que a monocamada é completamente confluentes. </li><li> Para avaliar a migração das células de Schwann em monocamadas de astrócitos, em paralelo com a criação de monocamadas de astrócitos, circular lamínulas PDL-revestido de vidro são colocados em um tubo de 50 mL e esmagado com uma pipeta de plástico para criar pequenos fragmentos de vidro. </li><li> Fragmentos de vidro são transferidos para um poço em 6 prato prato bem e usando uma pinça adequada fragmentos de tamanho são escolhidos e colocados em outros poços. 5 fragmentos de vidro são colocados em cada poço em 6 pratos bem. </li><li> Pilhas de Schwann cultivadas em frasco são tripsinizados por 3 minutos utilizando tripsina 0,1%. Células de Schwann tripsinizados são transferidos para separar 15 mL tubo falcon e centrifugado a 300 G durante 5 minutos. Células de Schwann são re-suspenso em 2x 10 6 células / mL em DMEM/10% PSF FCS / 1%. </li><li> 20 gotas mL da suspensão de células de Schwann é adicionado em cada cinco fragmentos de lamela colocada em 6 placas bem e as células são incubadas a 37 ° CO C, 7% 2 por 2 horas. </li><li> Após 2 horas, as células de Schwann são presos aos fragmentos lamela e DMEM/10% FCS / 1% de PSF (complementado com 2μM de forskolin e 10μg / mL da BPE é adicionado a cada poço, para que os fragmentos são completamente cobertos com o meio) . </li><li> Os 6 pratos bem contendo os fragmentos são então colocados na incubadora por 24-48 horas até que os fragmentos de vidro são totalmente confluente com células de Schwann. </li><li> Uma vez que os fragmentos são confluentes com células de Schwann, cada fragmento é pego com cuidado usando uma pinça afiada e mergulhadas em HBSS para remover as células solto e então veremos face invertida para baixo sobre a monocamada de astrócitos. </li><li> Cada poço é então coberto com 1 mL de DMEM/10% de células FCS / 1% de PSF e Schwann têm permissão para migrar para o período 24-48. Durante este período experimental reagentes, tais como fatores de crescimento podem ser adicionados para avaliar seu efeito sobre o número ea distância de migração de células de Schwann. </li><li> Após o período de migração, os fragmentos de vidro são fixos ao fundo de cada poço, adicionando paraformaldeído a 4% (PFA) por 30 minutos. Fixação seguintes, as células de Schwann immunostain para p75 (reconhecendo baixa afinidade do receptor NGF), em seguida, mancha-los usando ABC strepavidin kit-diaminobenzidina (DAB), para permitir a visualização das células de Schwann em microscópio de luz. </li></ol> 3. Resultados representativos: Após 8-10 dias Schwann-astrócito co-culturas mostram uma fronteira nítida entre os dois tipos de células. Este limite é mais pronunciada se forskolin e BPE é utilizado na cultura como a proliferação das células de Schwann é reforçada. Se nenhum limite é observado durante o período de 10 dias, o tempo da cultura pode ser aumentada até que os limites são estabelecidos. Mudando a relação entre a densidade celular é uma forma alternativa para aumentar a formação de fronteira. A proporção de 3:1 Schwann: densidade de células astrócitos podem ser usados ​​na preparação de suspensões de células 8,18. Seguintes imunocoloração para identificar as células de Schwann e astrócitos, células para avaliar mistura uma linha pode ser desenhada onde o limite é estabelecido eo número de células de Schwann migrando para o território astrócitos podem ser contados em microscópio de fluorescência. Abaixo estão dois exemplos de imagens obtidas fronteiras, com uma bem formada a segregação de células de Schwann e astrócitos (Figura 1A) e aquele em que as células não têm segregado bem em diferentes territórios, devido à má técnica (Figura 1B). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura ensaio Limite 1:. Schwann-astrócito interação. A) A 10 dias do ensaio de co-cultura na presença de forskolin e BPE para estimular a proliferação das células de Schwann demonstra uma fronteira nítida entre os dois tipos de células (vermelho = P75, verde = GFAP). B) Um dia 10 ensaio de co-cultura em que a fronteira não está formado e as duas frentes de células mistas. Isso ocorreu devido à mistura das duas gotas ao colocar gotas de células de Schwann e astrócitos ao lado do outro durante a preparação do limite (vermelho = P75, verde = GFAP). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Imagem representativa de monocamada confluente astrócitos Ensaios de migração avaliar o movimento de um tipo de célula sobre a superfície de outro tipo de célula e, portanto, avaliar um fenômeno diferente da formação de fronteira. Prática é necessária para garantir invertendo as lamelas em monocamadas não levar a danos à célula de Schwann cobertas de fragmentos de vidro e monocamadas de astrócitos pelo fórceps afiada. Para avaliar a migração de células de Schwann, a distância máxima da migração e do número de células migram a partir da borda da lamínula pode ser medido em microscópio de luz. Veja abaixo a imagem de células de Schwann corados com anticorpo P75 usando coloração DAB na superfície da monocamada de astrócitos (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura ensaio de migração 3. Lamela usando ensaio invertido. A) As células de Schwann (marrom, imunocoloração com anticorpo p75), que migram para longe da borda da lamínula. Seta aponta para a direção da migração de células de distância da lamínula.

<ol><li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li>
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<li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li>
<li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li>
<li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell%2Fastrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS%2FCNS+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li>
<li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2Fheparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes%3A+a+role+in+astrocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os ensaios descritos acima têm sido utilizados em vários estudos demonstrando o papel dos múltiplos fatores envolvidos na formação da fronteira entre o Schwann-astrócitos e migração de células de Schwann limitada em ambiente astrocíticos. Compreensão dos mecanismos subjacentes a estes eventos é essencial, uma vez que permitiria o desenvolvimento de estratégias para otimizar e melhorar a integração de enxertos de células de Schwann após o transplante e com isso facilitar a saída dos axônios e...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>PSF</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura (retangular)</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas com câmara</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 4 poços, placas de 6 poços</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>Placas de 4 poçosPlacas de 6 poços</td></tr><tr><td>anticorpo anti-p75 de rato</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>anticorpos secundários (conjugados com Alexa)</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>Caprino anti-murino 568Caprino anti-coelho 488</td></tr><tr><td>secundário biotinilado</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>Caprino anti-murino</td></tr><tr><td>comprimidos de DAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>kit ABC elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de schwann-astrócito interações usando in vitro ensaios

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Células de Schwann são um dos células normalmente usadas em estratégias de reparo após lesões na medula espinhal. Células de Schwann são capazes de apoiar a regeneração axonal e surgimento de secreção 1,2 fatores de crescimento e fornecer factores de crescimento e moléculas de adesão 3 moléculas de matriz extracelular 4. Além disso, eles mielinizar os axônios desmielinizados no local da lesão 5. No entanto após o transplante, as células de Schwann não migram do local de implante e não se misturam com os astrócitos anfitrião 6,7. Isto resulta na formação de uma fronteira nítida entre as células de Schwann e astrócitos, criando um obstáculo para os axônios em crescimento tentando sair da volta do enxerto no tecido do hospedeiro proximal e distalmente. Astrócitos em contato com células de Schwann também sofrem hipertrofia e up-regular as moléculas inibidoras 8-13. Ensaios in vitro têm sido usados ​​para modelar Schwann células-astrócitos interações e têm sido importantes para a compreensão do mecanismo subjacente ao comportamento celular. Estes ensaios in vitro incluem teste de fronteira, onde a co-cultura é feita através de duas células diferentes, com cada tipo de célula que ocupam diferentes territórios, com apenas uma pequena diferença que separa as duas frentes de células. Como as células se dividem e migrar, as duas frentes de celulares se aproximar uns dos outros e, finalmente colidem. Isso permite que o comportamento das duas populações celulares a serem analisados ​​na fronteira. Outra variação da mesma técnica é misturar as duas populações celulares em cultura e ao longo do tempo os dois tipos de células com as células de Schwann segregar aglutinados como ilhas entre astrócitos juntos criando múltiplas Schwann-astrócito limites. Segundo ensaio utilizado no estudo da interação de dois tipos de células é o ensaio de migração celular, onde o movimento pode ser acompanhado na superfície do tipo de célula outras monocamada 14,15. Este ensaio é comumente conhecido como teste de lamela invertido. Células de Schwann são cultivadas em pequenos fragmentos de vidro e eles são invertidos face para baixo sobre a superfície de monocamadas de astrócitos e migração é avaliada a partir da borda da lamínula. Ambos os ensaios têm sido fundamentais para estudar os mecanismos subjacentes envolvidos na exclusão celular e formação de fronteira. Algumas das moléculas identificadas usando estas técnicas incluem N-caderinas, 15 de proteoglicanos sulfato de condroitina (CSPGs) 16,17, FGF / Heparina 18, Ef / Efrinas 19. Este artigo pretende descrever ensaio limite e ensaio de migração de forma gradual e elucidar os possíveis problemas técnicos que possam ocorrer.

Este artigo pretende descrever de forma gradual o comumente usado<em&gt; In vitro</em&gt; Testes usados ​​no estudo de células de Schwann-asrtocyte interações.

Análise de Schwann-astrócito Interações Usando In Vitro Ensaios

As células de Schwann são um dos tipos celulares comumente utilizados em estratégias de reparação após lesões na medula espinhal. As células de Schwann são capazes de suportar o crescimento axonal...

As células de Schwann são células gliais do sistema nervoso periférico que têm sido utilizadas na reparação de lesões medulares. Basicamente, produzem fatores de crescimento que apoiam a regeneração axonal e fornecem moléculas adesivas e da matriz extracelular que promovem o crescimento. Além disso, elas mielinizam os axônios no local da lesão.Infelizmente, as células de oligodendrócitos transplantadas não migram do local dos implantes e não se misturam com os astrócitos do hospedeiro. Isso resulta na formação de uma fronteira nítida e impede que os axônios em crescimento se integrem ao tecido hospedeiro. Neste vídeo, dois métodos são utilizados para estudar as interações entre células de oligodendrócitos e astrócitos in vitro.Primeiro, é demonstrado um ensaio de fronteira no qual territórios de células Schwann e de astrócitos são estabelecidos em uma lâmina e cultivados. Diferentes reagentes são então adicionados à lâmina e, após cultivo adicional, as lâminas são imagiadas e analisadas para determinar o efeito dos reagentes sobre a migração de células Schwann para o território astrocitário, ou vice-versa.Em seguida, demonstra-se um ensaio de migração no qual fragmentos de lamínulas recobertos com ninhos de células de Schwann são invertidos sobre monocamadas de astrócitos. Novamente, diferentes reagentes são adicionados ao meio de cultura e, após a cultura, realiza-se a imagem para avaliar a extensão e a distância da migração das células de Schwann sobre monocamadas de astrócitos. Em última análise, esse tipo de ensaio deve facilitar o desenvolvimento de estratégias para otimizar e potencializar a integração de enxertos de células de Schwann após o transplante.A vantagem desses ensaios in vitro em relação aos métodos existentes, nos quais a migração em substratos puros é avaliada, é que eles são mais relevantes para ensaios in vivo, nos quais células transplantadas entram em contato com astrócitos. Além disso, esses ensaios in vitro podem ser utilizados em outras áreas, como a biologia celular, para responder perguntas fundamentais, como a invasão e migração de células tumorais. Antes de iniciar o ensaio, tenha em mãos os seguintes itens: lâminas com câmara revestidas com poli-D-lisina, lâminas de vidro estéreis, meio de cultura celular e um frasco de cálcio.A solução salina balanceada de Hanks livre de magnésio começa com a tripsinização de células de Schwann primárias por três minutos e de astrócitos primários de rato por cinco minutos. Assim que as células se destacarem, desative a tripsina adicionando meio de cultura celular. Em seguida, transfira as células de Schwann e os astrócitos para tubos cónicos de 15 mililitros separados e centrifugue-os a 300 ×g por cinco minutos.Enquanto isso, utilizando um cortador de vidro, corte longitudinalmente lamínulas de vidro retangulares de modo que se ajustem à largura das lâminas com câmara utilizadas nos ensaios de fronteira e possam facilitar a espalhamento da gota de suspensão celular. Após a centrifugação, ressuspenda as células de Schwann e astrócitos numa densidade de dois vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Em uma extremidade de uma lâmina com câmara revestida com polilisina, coloque um gota de 50 microlitros de suspensão de células de Schwann.Use uma lâmina de vidro para espalhar a gota em direção ao centro da câmara, criando uma borda reta. Em seguida, coloque uma segunda gota de 50 microlitros de suspensão de astrócitos na extremidade oposta do mesmo poço e espalhe-a em direção ao centro. Para criar uma borda reta paralela à primeira, deve haver uma distância de 0,2 milímetro entre elas.Coloque a lâmina de câmara contendo as gotas no incubador a 37 graus Celsius por duas horas. Após duas horas, lave as culturas com DMEM para remover qualquer detrito celular não aderido.Para estimular a proliferação das células de schwan, adicione meio aos lamínulas. Este meio é suplementado com quatro galin e extrato de hipófise bovino. Os quatro galin elevam os níveis de AMP cíclico dentro das células de schwan para induzir a proliferação, e o BPE fornecerá fatores de crescimento necessários para o cultivo de longo prazo.Incube a lâmina por oito a 10 dias. As duas frentes celulares eventualmente se encontrarão e uma fronteira nítida se formará entre os dois tipos celulares. Nesta fase, os experimentos podem ser realizados.Analisando os fatores envolvidos na formação de limites para examinar o limite, fixe a co-cultura com formaldeído 4%. Para distinguir células de Schwann e astrócitos, realize uma imunomarcação com um anticorpo anti-P75 e um anticorpo anti-GFAP, respectivamente. O anticorpo anti-P75 reconhece o receptor de baixa afinidade para o NGF nas células de Schwann, que os astrócitos não possuem; o anticorpo anti-GFAP reconhece a proteína ácida fibrilar glial, que está localizada nos astrócitos, para realizar um ensaio de migração.Inicie o plaqueamento. Plaque uma vez 10 elevado a cinco astrócitos em um mililitro de meio em cada poço de uma placa de quatro poços com poços de 15 milímetros. Coloque a placa no incubador a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas até que a monocamada esteja completamente confluente.Enquanto isso, para preparar as células swan para avaliar a migração sobre monocamadas de astrócitos, coloque lâminas de vidro circulares revestidas com polilisina em um tubo de 50 mililitros e use um pipetador de plástico para esmagá-las, criando pequenos fragmentos de vidro. Transfira os fragmentos de vidro para um poço de uma placa de seis poços com o auxílio de pinça. Escolha fragmentos com aproximadamente cinco milímetros de diâmetro e transfira cinco para cada um dos outros poços.Incube as células de Schwann com tripsina por três minutos. Em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mililitros e centrifugue-as a 300 ×g por cinco minutos. Re-suspenda as células de Schwann a duas vezes 10⁶ células por mililitro em meio de cultura.Em seguida, adicione 20 microlitros da suspensão de células de Schwann sobre cada fragmento e incube a 37 graus Celsius e 7% de dióxido de carbono por duas horas. Após duas horas, remova as células de Schwann do incubador. Adicione quantidade suficiente de meio de cultura suplementado com dois micromolares, quatro escalas in e 10 microgramas por mililitro de BPE a cada poço.Portanto, os fragmentos com células aderidas devem ser completamente cobertos com meio e incubados por 24 a 48 horas, até que os fragmentos de vidro estejam totalmente cobertos por células swan. Uma vez que os fragmentos estejam cobertos por células swan, retire tanto as células swan quanto os astrócitos do incubador. Use pinças para levantar cuidadosamente cada fragmento com as células swan aderidas.Mergulhe o fragmento em HBSS para remover as células não aderidas e, em seguida, inverta-o com a face voltada para baixo sobre a monocamada de astrócitos. Após a transferência de todos os fragmentos, adicione um mililitro de meio de cultura celular a cada poço.Se os efeitos de reagentes experimentais, como fatores de crescimento, forem avaliados, eles devem ser incluídos no meio. Retorne a placa ao incubador e permita que as células de Schwann migrem por 24 a 48 horas após o período de migração. Os fragmentos de vidro são fixados no fundo de cada poço pela adição de paraformaldeído a 4% por 30 minutos após a fixação.Imunomarcar as células de Schwann para P 75, em seguida corar utilizando o kit A BC Strept ADIN fornecido com DIAM benzidina para permitir a visualização das células de Schwann ao microscópio óptico após 10 dias. O co-cultivo de células de Schwann e astrócitos mostra um limite nítido entre os dois tipos celulares. Aqui, as células de Schwann são identificadas pelo P 75.A coloração do receptor de baixa afinidade para o fator de crescimento nervoso (NGF) é mostrada em vermelho, e os astrócitos são identificados pela coloração de GFAP, mostrada em verde. O limite entre essas células é mais acentuado quando forskolina e extrato de hipófise bovina (BPE) são utilizados no cultivo, pois a proliferação de células de Schwann é potencializada. Em contraste, neste ensaio de co-cultivo de 10 dias, as células não se separaram bem em territórios distintos.Isso ocorreu devido à técnica inadequada e à mistura dos dois tipos celulares. Ao preparar o ensaio de fronteira, os ensaios de migração avaliam o movimento de um tipo celular sobre a superfície de outro tipo celular, e portanto avaliam um fenômeno diferente da formação de fronteira. Esta imagem mostra células swan migrando para longe da borda da lamínula, a seta indica a direção da migração celular.Ao realizar esses ensaios in vitro, é importante lembrar que o efeito dos reagentes pode atuar sobre astrócitos ou células de Schwann, e, portanto, experimentos subsequentes são necessários para demonstrar exatamente qual tipo celular é responsável pela migração aumentada ou diminuída observada. Além disso, outras técnicas, como imunoquímica, podem ser realizadas, especialmente no ensaio de fronteira, com o objetivo de mostrar quais moléculas são reguladas para cima ou para baixo na fronteira entre células de Schwann e astrócitos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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