Manutenção de Wolbachia em Cell-livre Médio

Meu nome é Courtney Ston. Trabalho na Escola de Saúde Pública Johns Hopkins Bloomberg, no laboratório do Dr. Jason Rascon. Hoje realizaremos a purificação bacteriana de células de insetos cultivadas.

Na verdade, é um procedimento muito simples. Começamos colhendo nossas células e, em seguida, rompemos fisicamente as membranas das células hospedeiras eucarióticas usando a lise com esferas de vidro. Depois, utilizamos centrifugação diferencial para separar as bactérias dos detritos celulares do hospedeiro.

Em seguida, utilizamos uma série de etapas de filtração para remover ainda mais partículas de células hospedeiras, de modo que, ao final, restará apenas o pellet bacteriano purificado. Esta é, na verdade, uma das principais exigências. É uma cabine de cultura celular e é usada para manter tudo estéril, porque a cultura celular é muito suscetível à contaminação.

Também precisamos de meio de cultura celular, das próprias células, e as cultivamos em frascos de plástico. Também precisamos de esferas de vidro de três milímetros, tubos cónicos de 50 ml, e de uma centrífuga capaz de realizar centrifugação em alta velocidade, aproximadamente 18.000 ×g, para formar o pellet das nossas bactérias, mas também capaz de realizar cerca de 3.000 ×g ou 2.500 ×g para formar o pellet das nossas células hospedeiras. Então, a primeira coisa que faremos é começar com nossas células cultivadas.

Eles estão crescidos, certo? Estes são frascos T 75. Têm 15 mls de meio de cultura, assim como nós mesmos.

Então, a primeira coisa que faremos é começar desagregando a camada celular e coletando-as em um tubo cônico de centrífuga de 50 ml. Basta passar para frente e para trás sobre a camada celular, o que desloca todas as células para o meio. Em seguida, uma vez que nossas células estejam no meio, pipetamos-nas para o tubo cônico de ML.

Agora, às duas suspensões celulares, vamos adicionar esferas de vidro de três milímetros. Essas esferas foram autoclavadas e podem, na verdade, ser reutilizadas. Podem ser lavadas e imersas em água sanitária e depois autoclavadas novamente antes de serem usadas outra vez.

Você simplesmente despeja, tomando cuidado para não tocar a boca do frasco de vidro B na boca do tubo de centrífuga. E colocamos aproximadamente até a marca de volume de cinco mililitros de esferas de vidro em cada tubo de centrífuga. Assim, a próxima etapa é romper fisicamente as células do biofilme para liberar nossas bactérias na suspensão.

Então, usamos um vórtex, colocamos no nível mais alto de agitação e vórtex por cinco minutos. Agora, vórtex as células com as esferas de vidro de três milímetros por cinco minutos e pipetaremos o sobrenadante com uma pipeta limpa para um tubo cônico estéril e limpo de 50 mL. Coletaremos a nossa suspensão recém-criada, e essa suspensão consiste nas bactérias liberadas e na solução, bem como nos detritos celulares completos.

Então, o próximo passo que vamos realizar é uma centrifugação de baixa velocidade, de modo que possamos sedimentar o material bruto e manter as bactérias em suspensão. Vamos utilizar a centrífuga, operando a 2.500 ×g durante 10 minutos. Também vamos centrifugar a quatro graus Celsius para auxiliar na coleta do pellet no fundo do tubo.

E então nós apenas colocamos aqui, certificando-nos de que está equilibrado, fechamos e centrifugamos por 10 minutos. Agora centrifuguei nosso sobrenadante contendo detritos de células hospedeiras, bem como as bactérias purificadas. Fiz isso a 2.500 ×g por 10 minutos.

E como você pode ver, tenho um pellet no fundo do meu tubo que consiste em fragmentos celulares. Minhas bactérias recém-liberadas ainda estão no sobrenadante, pois a centrifugação não foi suficientemente forte para sedimentá-las também. Portanto, o próximo passo será remover o sobrenadante e filtrá-lo através de um filtro de cinco mícrons.

Então, este é um filtro de cinco mícrons e se adapta a qualquer tipo de seringa. Vou usar uma seringa de 30 ml, mas você simplesmente puxa o êmbolo para cima e, sem tocar no filtro propriamente dito, especialmente na parte inferior aqui, que precisa permanecer estéril, conecta a seringa ao filtro rosqueando-a, e então pressiona suavemente o êmbolo para fazer a sobrenadante passar através do filtro e entrar no nosso tubo.

Você não deve pressionar com muita força, pois isso pode danificar o filtro e ele deixará de funcionar. Se chegar ao ponto em que for necessário aplicar muita pressão, você precisará remover o filtro e substituí-lo, pois isso indica que ele está entupido com grande quantidade de detritos celulares. Neste momento, o que normalmente fazemos, dependendo do nosso volume e como um método adicional para obter um cultivo bacteriano muito puro, é adicionar 250 milimolares de solução de sacarose, previamente esterilizada por filtração, ao tubo de centrífuga de alta velocidade.

Encha o frasco até cerca de pelo menos 80% da capacidade. Normalmente, enchemos até o gargalo. Esses tubos precisam estar tão cheios para não implodir dentro da nossa centrífuga de alta velocidade.

Ok, agora vamos centrifugar nosso sobrenadante e concentrar nossas bactérias purificadas a 18.000 ×g nesta centrífuga de alta velocidade. Certificamo-nos de posicionar os tubos de forma balanceada, é claro, e então fechamos. Vamos configurá-la para 10 minutos.

E gostamos de fazer isso a 10 graus Celsius ou abaixo, temperatura que está definida aqui. E então, nossa velocidade angular para este rotor específico na centrífuga é de 12,5 rotações por minuto. Temos uma tabela de conversão, então ela girará aproximadamente a 18.670 vezes G. Agora realizamos a rotação em alta velocidade na centrífuga para formar o pellet de nossas bactérias purificadas.

Agora, como você pode ver, temos um bom pellet bacteriano no fundo do nosso tubo de alta velocidade. Então, o que faremos agora é remover todo o sobrenadante para um recipiente de resíduo líquido. Neste momento, precisamos ressuspender nossas bactérias.

Vou ressuspendê-lo em dois mililitros do nosso meio de cultura, que é o meio de insetos de Schneider, suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor. E vou simplesmente ressuspendar o pellet pipetando para cima e para baixo até que todas as bactérias estejam novamente em solução. Agora que nossas bactérias estão novamente em suspensão, vamos realizar mais uma etapa de purificação apenas para nos livrarmos de quaisquer outros detritos celulares do hospedeiro que possam estar presentes.

Para isso, vamos utilizar um filtro de 2,7 mícron. O que gosto de fazer é usar a carcaça de plástico do nosso filtro de cinco mícrons como suporte. Assim, podemos aspirar a nossa solução, rosquear a seringa ao filtro de 2,7 mícron e, agora, filtrar em um tubo para armazenamento de longo prazo.

Assim como no outro filtro, basta pressionar suavemente o êmbolo. E agora temos nossa solução de bactérias purificadas. A seguir, vou mostrar como realizamos o ensaio de viabilidade.

Utilizamos o kit de viabilidade bacteriana "live dead" com retroiluminação da Molecular Probes. Este kit inclui dois corantes: iodeto de propídio e citoe nove iodeto de propídio. O iodeto de propídio é vermelho, apresenta fluorescência vermelha e cora apenas bactérias que possuem uma membrana bacteriana não completamente intacta, enquanto o citoe nove cora todas as bactérias.

Portanto, quando você observar essas bactérias ao microscópio equipado com óptica de fluorescência, todas as bactérias fluorescerão em verde e, em seguida, um subconjunto, aquelas que estão mortas, fluorescerá em vermelho. Coletamos uma pequena alíquota da nossa amostra purificada e, neste caso, vou pegar apenas 10 microlitros, o suficiente para preparar uma lâmina. E vou distribuí-la em outras duas.

Em seguida, vou adicionar nossos outros dois corantes, apenas um microlitro da mistura de iodeto de propídio e citocina, à nossa suspensão bacteriana. Depois, você pode deixar incubando no escuro por 15 minutos. No entanto, verificamos que, na verdade, é possível montar a lâmina e observá-la quase imediatamente para visualizar os resultados.

Ok, agora vou observar ao microscópio meu lâmina contendo a coloração bacteriana com a coloração de vida/morte com contraluz. Vou dispensar a amostra sobre minha lâmina, colocar uma lamínula e depois observar. Vou utilizar nosso filtro misto vermelho-verde para poder avaliar a viabilidade das minhas bactérias.

Então, quando abro o obturador, vejo minhas bactérias, que são mais ou menos como pequenos pontos. Mas percebo que aproximadamente de 90 a 95% das bactérias são verdes, enquanto apenas cerca de 5% são vermelhas. Assim, temos uma taxa de viabilidade muito alta, não é?

Então, acabei de mostrar a você o processo de purificação de Akia viáveis a partir de células de insetos cultivadas. Este protocolo incluiu a disruptura física das células hospedeiras eucarióticas e, em seguida, a centrifugação diferencial para isolar as bactérias purificadas, bem como uma série de etapas de filtração para garantir a qualidade das bactérias purificadas, removendo completamente todos os componentes das células hospedeiras. Em seguida, descrevemos o ensaio de células vivas e mortas por contraluz, que utiliza dois corantes para avaliar a viabilidade das suas bactérias.

E você pode usar, agora, suas bactérias purificadas em diversas aplicações, incluindo infecção de outros sistemas de células cultivadas para aumentar a infecção de um sistema específico. Você também pode realizar estudos metabólicos ou inúmeros outros estudos utilizando suas bactérias purificadas vivas.