Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio

O objetivo geral deste procedimento é adaptar e manter células-tronco pluripotentes induzidas humanas em cultura livre de camada de alimentação, utilizando meio livre de camada de alimentação com substituição completa de soro knockout. Isso é realizado primeiramente preparando placas recobertas com gelt, TRX ou Cell Start. O segundo passo do procedimento consiste em repicar suas células IPS de MEFs para meio livre de camada de alimentação utilizando espaço em disco.

O passo final do procedimento é manter continuamente suas células IPS livres de células de apoio. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram crescimento celular e pluripotência semelhantes aos encontrados em culturas com metilo, por meio de imunomarcação com marcadores de pluripotência. Olá, sou Kate Wagner no site da GIB co da Life Technologies.

A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes é que é possível economizar tempo e aumentar a consistência no seu cultivo celular ao utilizar o substituto de soro sem atividade (knockout) em todo o seu fluxo de trabalho. Hoje, a família de produtos knockout inclui uma lista completa de meios e reagentes para condições com células de suporte, sem células de suporte e livres de componentes xenógenos para células-tronco embrionárias humanas, células-tronco embrionárias de camundongo e células-tronco pluripotentes induzidas. O KSR pode ser usado para derivação, crescimento, expansão, criopreservação e as etapas iniciais da diferenciação.

O vídeo a seguir mostrará como adaptar e embalar suas células usando KSR em condições livres de células alimentadoras. É necessário utilizar placas de cultura revestidas com Gel TRX para adaptar e embalar células-tronco pluripotentes induzidas humanas em condições livres de células alimentadoras. Um dia antes do preparo dessas placas revestidas, descongele lentamente um tubo de gelt TRX deixando-o na geladeira durante a noite. No dia seguinte, dilua o tubo de gelt TRX descongelado na proporção de 1 para 100 em meio basal, transferindo um mililitro de gel Rex para um frasco contendo 99 mililitros de meio basal. Misture a solução suavemente.

Recomendamos o uso do meio basal D-M-E-M-F 12 sem soro, mas consulte o texto do protocolo para outras opções. Cubra toda a superfície de cada placa de cultura com a solução gel Rex. Para cada placa de 60 milímetros, adicione 1,5 mililitro da solução gel trek.

Incube as placas por uma hora a 37 graus Celsius. Placas adicionais podem ser embrulhadas em papel alumínio e armazenadas na geladeira por até quatro semanas. Gelt TRX adicional diluído pode ser distribuído e armazenado a menos 20 a menos 80 graus Celsius, mas ciclos repetidos de congelamento e descongelamento devem ser evitados antes do uso.

Transfira as placas revestidas com gelt TRX para uma cabine de fluxo laminar ou capela e deixe-as equilibrar à temperatura ambiente. Além disso, prepare todos os outros reagentes necessários e certifique-se de que todos os meios estejam equilibrados a 37 graus Celsius e adequadamente gaseificados. Para adaptar os IPCs humanos ao meio livre de alimentadores, primeiro o cultivo.

As CIPSi estão em células alimentadoras de metionina até atingirem de 70 a 80% de confluência. Aspire o meio de cada placa de cultura de 60 milímetros e adicione uma quantidade apropriada de solução de dispase, que é um mililitro. Neste caso, incube as placas a 37 graus Celsius por três a cinco minutos.

Aspire a solução dispa de cada placa de cultura e lave suavemente as células alimentadoras com DPBS duas a três vezes. Em seguida, adicione uma quantidade apropriada de meio completo com substituto sérico a cada placa de cultura. Usando um espátula celular, desprenda suavemente as células da superfície da placa.

Colete a suspensão celular de cada placa em tubos cónicos separados de 15 mililitros. Enxágue cada placa de cultura com uma quantidade apropriada de meio completo com substituto sérico e adicione o meio de enxágue aos tubos cónicos de 15 mililitros contendo a suspensão celular. Centrifugue os tubos cónicos de 15 mililitros a 200 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente para obter o pellet celular.

Após a centrifugação, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Agite suavemente o tubo para desprender completamente o pellet celular do fundo do tubo. Adicione uma quantidade apropriada de meio completo com substituto sérico, livre de células alimentadoras, de acordo com a razão de divisão desejada.

E ressuspenda suavemente o pellet. Não quebre os agregados celulares em tamanhos menores, pois os agregados menores não aderem bem à superfície. Aspire qualquer solução residual de gel TRE das placas de cultura recobertas com gel Rex previamente preparadas e adicione lentamente uma quantidade apropriada de suspensão celular a cada placa de cultura.

Mova o recipiente de cultura para frente e para trás, e de um lado para o outro, várias vezes para dispersar as células pela superfície do recipiente. Coloque cuidadosamente os recipientes de cultura em uma incubadora a 37 graus Celsius com atmosfera umidificada de 4 a 6% de CO₂ no ar. Substitua o meio usado diariamente a partir de então, até que as células atinjam cerca de 70 a 80% de confluência.

Quando as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, cultivadas em meio livre de alimentadores e com substituto completo de soro, atingirem de 70 a 80% de confluência, estarão prontas para serem subcultivadas. Se houver quaisquer células diferenciadas, remova-as antes do envasamento. Aspire o meio usado do prato de cultura de 60 milímetros utilizando uma pipeta e lave as células duas vezes.

Com DPBS, adicione cuidadosamente um mililitro de solução pré-aquecida baseada em disco à placa de cultivo. Agite suavemente a placa para revestir toda a superfície celular. Incube o cultivo a 37 graus Celsius por três a cinco minutos.

Em seguida, aspire a solução do meio de cultura e lave suavemente as células duas vezes com DPBS, adicione o meio completo com substituto sérico, livre de células alimentadoras, e desprenda suavemente as células da superfície do recipiente de cultura. Usando um espátula para células, transfira as células para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Enxágue o recipiente de cultura duas vezes com o meio completo contendo substituto sérico.

Aplicar suavemente o meio livre de células alimentadoras para remover quaisquer células que não tenham se destacado. Recolher o meio de ambas as lavagens com as células no tubo de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 200 G durante cinco minutos à temperatura ambiente para formar o pellet celular sem perturbar o pellet de células.

Aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Agite suavemente o tubo para desprender completamente o pellet celular do fundo do tubo. Reuspenda suavemente as células no substituto completo de soro.

Meio livre de células alimentadoras usando uma pipeta serológica de cinco mililitros. Não triar. Transfira as células para uma nova placa de 60 milímetros revestida com gelt TRX na proporção de divisão desejada.

Mova o recipiente de cultura para frente e para trás, e de um lado para o outro, várias vezes para dispersar as células por sua superfície. Coloque o recipiente de cultura em um incubador a 37 graus Celsius com uma atmosfera umidificada de quatro a 6% de dióxido de carbono no ar no dia seguinte. Substitua suavemente o meio usado pelo substituto completo de soro.

Alimente com meio livre de células para remover detritos celulares. Substitua o meio usado a cada dia a partir de então. Esta imagem em contraste de fase mostra células-tronco pluripotentes induzidas humanas cultivadas em placas de cultura revestidas com gelt TRX, utilizando meio livre de células de alimentação e substituto sérico completo.

A morfologia das CIPs é semelhante à das células-tronco embrionárias humanas, caracterizada por núcleos grandes e citoplasma escasso. A coloração imunológica mostra que as CIPs cultivadas em meio com substituto de soro tipo knockout mais um coquetel de fatores de crescimento expressaram os marcadores de pluripotência OCT4 e SSEA-4. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como adaptar e manter suas CIPs em condições livres de soro tipo knockout e sem camada de sustentação. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.