Name: Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a adaptar e manter células-tronco pluripotentes induzidas humanas em cultura livre de alimentador usando meio KSR-FF. Este método melhora a consistência e eficiência na pesquisa com células-tronco.

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Nota: Para manter as condições de cultura estéril, todos os procedimentos neste protocolo são realizadas utilizando práticas de laboratório estéril e conduzidos sob uma capela de fluxo laminar. Antes de começar, certifique-se que qualquer mídia é equilibrado a 37 ° C e adequadamente gaseados. Preparar pratos Geltrex revestido Cultura Nota: ver anexo para o uso de placas de cultura de CELLstart revestido <ol><li> Tubo de descongelar um dos Geltrex (1 mL) lentamente a 2-8 ° C e diluir 1:100 em 99 mL de Knockout D-MEM/F-12. Misturar a solução suavemente. Nota: Algumas linhagens de células iPS podem requerer uma diluição Geltrex diferentes para o crescimento ideal. Veja o apêndice para diluições de alternativa. </li><li> Cobrir toda a superfície de cada placa de cultura com a solução Geltrex (1 mL para um prato de 35 mm, 1,5 mL para um prato de 60 mm). </li><li> Seal cada prato com Parafilm para evitar a secagem e incubar os pratos para 1 hora a 37 ° C. Nota: Neste ponto, você pode armazenar os pratos Geltrex revestido cultura a 4 ° C por até 1 mês. Seal cada prato com Parafilm para impedir a Geltrex sequem. </li><li> Antes de usar, transferir os pratos Geltrex revestido a uma capela de fluxo laminar e permitir-lhes atingir a temperatura ambiente (cerca de 1 hora). </li></ol> Preparando Alimentador-Free SR Completa KnockOut Médio <ol><li> Para preparar 1 mL de 10 mcg / ml solução FGF Basic, assepticamente misturar os componentes listados abaixo. Alíquota da solução e armazenar a -20 ° C por até 6 meses. <table border="0"><tbody><tr><td> FGF básico </td><td> 10 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990 mL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 L </td></tr></tbody></table> Nota: BSA pode ser substituído com HSA ou SR Knockout na mesma concentração. </li><li> Para preparar 50 mL de solução 2 Dispase mg / mL, assepticamente misturar os componentes listados abaixo. Filtro de esterilizar a solução e armazenar a 4 ° C por até duas semanas. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Para preparar 100 mL de SR KnockOut completa Alimentador-Free (KSR-FF) médio assepticamente combinar os componentes listados na tabela abaixo. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentração de ações </td><td> Concentração Final </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (Cat. n º. 12.660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> Glutamax-I (Cat. No. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR (sem Cat.. 10.828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (sem Cat.. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (sem Cat.. PHG0024) </td><td> 10 mcg / mL </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 mL </td></tr></tbody></table> Você pode armazenar o meio KSR-FF a 2-8 ° C por até uma semana. </li><li> Pouco antes de pré-equilibrar o meio completo à temperatura e gases, adicionar assepticamente o volume necessário de 2-mercaptoetanol (55 mM de concentração de ações) para uma concentração de 0,1 mM final. Por exemplo, para preparar 100 mL da KSR-FF médio mL adicionar 182 de 55 mM 2-mercaptoetanol (1:550 diluição) Alternativamente, o 2-mercaptoetanol podem ser adicionadas ao meio 1X preenchido e armazenado a 2-8 ° C para até uma semana. </li></ol> Adaptação iPSCs a KSR-FF Médio <ol><li> Antes de começar, pré-equilibrar os seus pratos Geltrex revestidas até a temperatura ambiente no bairro. </li><li> Cultura da iPSCs em células alimentadoras MEF até que sejam confluentes 70-80%. Por favor, consulte o manual Fibroblasto GIBCO embrionárias de camundongos para protocolos baseados em MEF cultura. </li> Pré-aquecer o volume necessário de Dispase em um banho de água 37 ° C. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários. <li> Pré-equilibrar o volume necessário de KSR-FF em um banho de água a 37 ° C for15 min. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários. </li><li> Aspirar o meio dos pratos, cultura e adicionar uma quantidade adequada de solução Dispase. Incubar os pratos a 37 ° C por 3-5 minutos. </li><li> Aspirar a solução de cada navio Dispase cultura e lavar as células alimentador MEF suavemente com D-PBS (2 a 3 vezes). </li><li> Adicionar uma quantidade adequada de meio completo KnockOut SR a cada navio de cultura. Use um raspador de célula ou uma pipeta de 5 mL para raspar suavemente as células da superfície da embarcação cultura. Nota: veja o apêndice para protocolos alternativos para adaptação difícil de se adaptar as linhas de células iPS, </li><li> Recolher a suspensão de células de cada placa de cultura em diferentes tubos de 15 mL cônico. Lave cada navio cultura com uma quantidade adequada de meio completo KnockOut SR, e adicione a D-PBS lavar médio para o 15 mL tubos cônicos contendo a suspensão celular. Seja cauteloso para não quebrar os aglomerados de células em uma única célula </li><li> Centrifugar a 15 mL em tubos cônicos 200 xg por 5 minutos para sedimentar as iPSCs. </li><li> Aspirar o sobrenadante do pellet iPSC. Ressuspender o sedimento em uma quantidade adequada de KSR-FF médio de acordo com a taxa de divisão (Tabela 1). Não quebre os aglomerados de células para um tamanho menor, porque os aglomerados mais pequenos não dão bem para a superfície. Nota: Recomenda-se uma taxa de divisão de 1:2 para os primeiros três passagens após o iPSCs foram várias passagens diretamente do Meio de Cultura iPSC MEF para KSR-FF médio. Normalmente, a razão de separação 01:03 - 01:05 é apropriado, mas passaging em 01:02 garante a maior densidade de células necessárias ao adaptar em uma cultura de alimentação livre. </li><li> Antes de chapeamento do iPSCs em pratos Geltrex revestido, aspirar solução Geltrex residual do prato pré-revestidos, e lentamente adicionar uma quantidade adequada de suspensão de células de cada placa de cultura. Nota: não lavar os pratos antes de chapeamento. </li><li> Mover a placa de cultura e para trás e para os lados várias vezes para dispersar as células em toda a superfície do prato. Delicadamente, coloque o prato de cultura em uma incubadora de 37 ° C com uma atmosfera húmida de 4 a 6% CO 2 no ar. Substituir o médio gasto com KSR-FF a cada dia. </li></ol> Passaging células iPS usando KSR-FF <ol start="13"><li> Observar o iPSCs humana crescendo em completa KSR-FF sob o microscópio para confirmar que as células são 70-80% confluentes e pronto para ser repicadas. Consulte a Figura 1. Nota: Se colônias tornam-se muito denso ou muito grande, maior diferenciação ocorre. </li><li> Cortar e remover qualquer colônias diferenciada iPSC antes passaging a cultura. </li><li> Pré-aquecer o volume necessário de Dispase em um banho de água 37 ° C. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários. </li><li> Pré-equilibrar o volume necessário de KSR-FF em um banho de água a 37 ° C for15 min. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários. </li><li> Aspirar o meio de gastos do navio cultura usando uma pipeta, e lavar as células duas vezes com D-PBS. </li><li> Delicadamente adicionar pré-aquecido Dispase solução para o navio de cultura (por exemplo, 1 mL de solução Dispase por 60 mm placa de cultura). Redemoinho do navio cultura para revestir a superfície da célula inteira. </li><li> Incubar a embarcação cultura a 37 ° C por 3 minutos. </li><li> Remover o navio da incubadora, aspire a solução Dispase e lavar cuidadosamente as células com D-PBS. </li><li> Raspe as células da superfície da placa de cultura com uma espátula de células, e transferência das células para um tubo de centrifugação estéril 15ml. </li><li> Lavar o prato de cultura duas vezes com KSR-FF, gentilmente "pulverização off" as células que não tenham destacado. Piscina do enxágüe meio com as células no tubo de 15mL. </li><li> Centrifugar o tubo a 200 xg por 5 minutos em temperatura ambiente para agregar as células. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e descartá-lo. </li><li> Agite suavemente o tubo para expulsar totalmente o pellet celular a partir do fundo do tubo. </li><li> Delicadamente ressuspender as células pré-equilibradas KSR-FF com uma pipeta de 5mL sorológicos. Não triturar. Nota: é fundamental na etapa delicadamente ressuspender as células sem usar a força para evitar danos. </li><li> Transferência das células para um novo prato de 60 mm Geltrex revestido na razão de separação desejada e mova a placa de cultura e para trás e para os lados várias vezes para dispersar as células em sua superfície. </li><li> Coloque o prato de cultura em uma incubadora de 37 ° C com uma atmosfera húmida de4 a 6% CO 2 no ar. </li><li> No dia seguinte, colocar suavemente o médio gasto com KSR-FF para remover restos celulares. Substituir o médio passou todos os dias depois. Observe as células iPS diárias e passagem-los conforme necessário (aproximadamente a cada 4-5 dias). Passaging é recomendada quando as células atingem confluência de 70-80%. Para criopreservação de células iPS e descongelamento, consulte nosso protocolo intitulado "criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando Completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro Medium". </li></ol> Resultados esperados <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="Cultura de células ao microscópio; estudo do crescimento celular; imagens de microscopia; pesquisa biológica." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A imagem abaixo mostra contraste de fase iPSCs cultivadas em pratos Geltrex revestido cultura usando completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum médio. O iPSCs apresentam morfologia semelhante ao hESCs, caracterizado por núcleos grandes e citoplasma escasso. (40x) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Dish 35 milímetros </td><td> Dish 60 milímetros </td><td> Dish 100 milímetros </td></tr><tr valign="top"><td> Completa KnockOut SR médio </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex Solution </td><td> 1 mL </td><td> 1,5 mL </td><td> 4-5 mL </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0,5 mL </td><td> 1 mL </td><td> ML 3-4 </td></tr><tr valign="top"><td> D-PBS para lavagem </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Volumes recomendado <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">Por favor, clique aqui para ver o apêndice</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

Os autores deste artigo são empregados por Life Technologies, que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 Knockout</td><td></td><td>Cat. no. 12660-012</td><td>Observação: veja o apêndice para o uso de produtos DMEM alternativos</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Cat. No. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Substituto Sérico KnockOut</td><td></td><td>KnockOut SR, Cat. no. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail de Fatores de Crescimento do Substituto Sérico KnockOut</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante básica de FGF humana, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, Cat. no. PHG0024</td><td>Observação: veja o apêndice para tamanhos alternativos de embalagem de bFGF.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;etanol</td><td></td><td>Cat. no. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>Cat. no. 17105-041</td><td>Observação: veja o apêndice para métodos alternativos de passagem.</td></tr><tr><td>Matriz da Lâmina Basal com Fator de Crescimento Reduzido Geltrex hESC-Qualificado, 1 mL</td><td></td><td>Cat. no. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco&amp;rsquo;s (D-PBS) sem cálcio e magnésio</td><td></td><td>Cat. no. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Capa de Segurança em Cultura de Tecidos Esterilizada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ajustada a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria ajustado a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estéreis (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de centrífuga de 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos tratadas de 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

alimentador livre adaptação, cultura e passaging de células ips humanas usando completa knockout alimentador-free substituição serum médio

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

A descoberta em 2006 que fibroblastos humanos e mouse poderia ser reprogramado para gerar células iPS 1-3 com qualidades muito semelhantes às células-tronco embrionárias criou uma valiosa fonte de novas células pluripotentes para descoberta de medicamentos, terapia celular, e pesquisa básica. Media GIBCO e reagentes têm estado na vanguarda da pesquisa com células-tronco pluripotentes por anos. Knockout DMEM suplementado com Knockout Serum substituição é a mídia de sua escolha para o crescimento de células-tronco embrionárias e, agora, de cultura de células iPS 3-9. Este padrão ouro sistema de mídia agora pode ser usado para alimentação livre de cultura com a adição de Knockout SR Cocktail Fator de Crescimento. ES humana e métodos tradicionais de cultura de células iPS requerem o uso de mouse ou camadas de alimentação humana de fibroblastos, ou alimentador condicionado médio. Estes métodos cultura são de trabalho intensivo, difícil de escala e é difícil manter quadris células indiferenciadas, devido às condições indefinido. Invitrogen desenvolveu Knockout SR Cocktail Fator de Crescimento para permitir que você facilmente a transição do seu celular para culturas quadris alimentador livre, mantendo o uso do SR Knockout.

O protocolo a seguir fornece instruções para a adaptação humana tronco pluripotentes induzidas (iPS) células para alimentação livre de cultura usando completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro médio (KSR-FF). Uma vez adaptado, instruções para a manutenção contínua também são fornecidos.

Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio

A descoberta em 2006 de que fibroblastos humanos e de camundongos poderiam ser reprogramados para gerar células iPS 1-3 com qualidades notavelmente semelhantes às de células-tronco embrionárias ...

O objetivo geral deste procedimento é adaptar e manter células-tronco pluripotentes induzidas humanas em cultura livre de camada de alimentação, utilizando meio livre de camada de alimentação com substituição completa de soro knockout. Isso é realizado primeiramente preparando placas recobertas com gelt, TRX ou Cell Start. O segundo passo do procedimento consiste em repicar suas células IPS de MEFs para meio livre de camada de alimentação utilizando espaço em disco.O passo final do procedimento é manter continuamente suas células IPS livres de células de apoio. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram crescimento celular e pluripotência semelhantes aos encontrados em culturas com metilo, por meio de imunomarcação com marcadores de pluripotência. Olá, sou Kate Wagner no site da GIB co da Life Technologies.A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes é que é possível economizar tempo e aumentar a consistência no seu cultivo celular ao utilizar o substituto de soro sem atividade (knockout) em todo o seu fluxo de trabalho. Hoje, a família de produtos knockout inclui uma lista completa de meios e reagentes para condições com células de suporte, sem células de suporte e livres de componentes xenógenos para células-tronco embrionárias humanas, células-tronco embrionárias de camundongo e células-tronco pluripotentes induzidas. O KSR pode ser usado para derivação, crescimento, expansão, criopreservação e as etapas iniciais da diferenciação.O vídeo a seguir mostrará como adaptar e embalar suas células usando KSR em condições livres de células alimentadoras. É necessário utilizar placas de cultura revestidas com Gel TRX para adaptar e embalar células-tronco pluripotentes induzidas humanas em condições livres de células alimentadoras. Um dia antes do preparo dessas placas revestidas, descongele lentamente um tubo de gelt TRX deixando-o na geladeira durante a noite. No dia seguinte, dilua o tubo de gelt TRX descongelado na proporção de 1 para 100 em meio basal, transferindo um mililitro de gel Rex para um frasco contendo 99 mililitros de meio basal. Misture a solução suavemente.Recomendamos o uso do meio basal D-M-E-M-F 12 sem soro, mas consulte o texto do protocolo para outras opções. Cubra toda a superfície de cada placa de cultura com a solução gel Rex. Para cada placa de 60 milímetros, adicione 1,5 mililitro da solução gel trek.Incube as placas por uma hora a 37 graus Celsius. Placas adicionais podem ser embrulhadas em papel alumínio e armazenadas na geladeira por até quatro semanas. Gelt TRX adicional diluído pode ser distribuído e armazenado a menos 20 a menos 80 graus Celsius, mas ciclos repetidos de congelamento e descongelamento devem ser evitados antes do uso.Transfira as placas revestidas com gelt TRX para uma cabine de fluxo laminar ou capela e deixe-as equilibrar à temperatura ambiente. Além disso, prepare todos os outros reagentes necessários e certifique-se de que todos os meios estejam equilibrados a 37 graus Celsius e adequadamente gaseificados. Para adaptar os IPCs humanos ao meio livre de alimentadores, primeiro o cultivo.As CIPSi estão em células alimentadoras de metionina até atingirem de 70 a 80% de confluência. Aspire o meio de cada placa de cultura de 60 milímetros e adicione uma quantidade apropriada de solução de dispase, que é um mililitro. Neste caso, incube as placas a 37 graus Celsius por três a cinco minutos.Aspire a solução dispa de cada placa de cultura e lave suavemente as células alimentadoras com DPBS duas a três vezes. Em seguida, adicione uma quantidade apropriada de meio completo com substituto sérico a cada placa de cultura. Usando um espátula celular, desprenda suavemente as células da superfície da placa.Colete a suspensão celular de cada placa em tubos cónicos separados de 15 mililitros. Enxágue cada placa de cultura com uma quantidade apropriada de meio completo com substituto sérico e adicione o meio de enxágue aos tubos cónicos de 15 mililitros contendo a suspensão celular. Centrifugue os tubos cónicos de 15 mililitros a 200 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente para obter o pellet celular.Após a centrifugação, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Agite suavemente o tubo para desprender completamente o pellet celular do fundo do tubo. Adicione uma quantidade apropriada de meio completo com substituto sérico, livre de células alimentadoras, de acordo com a razão de divisão desejada.E ressuspenda suavemente o pellet. Não quebre os agregados celulares em tamanhos menores, pois os agregados menores não aderem bem à superfície. Aspire qualquer solução residual de gel TRE das placas de cultura recobertas com gel Rex previamente preparadas e adicione lentamente uma quantidade apropriada de suspensão celular a cada placa de cultura.Mova o recipiente de cultura para frente e para trás, e de um lado para o outro, várias vezes para dispersar as células pela superfície do recipiente. Coloque cuidadosamente os recipientes de cultura em uma incubadora a 37 graus Celsius com atmosfera umidificada de 4 a 6% de CO₂ no ar. Substitua o meio usado diariamente a partir de então, até que as células atinjam cerca de 70 a 80% de confluência.Quando as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, cultivadas em meio livre de alimentadores e com substituto completo de soro, atingirem de 70 a 80% de confluência, estarão prontas para serem subcultivadas. Se houver quaisquer células diferenciadas, remova-as antes do envasamento. Aspire o meio usado do prato de cultura de 60 milímetros utilizando uma pipeta e lave as células duas vezes.Com DPBS, adicione cuidadosamente um mililitro de solução pré-aquecida baseada em disco à placa de cultivo. Agite suavemente a placa para revestir toda a superfície celular. Incube o cultivo a 37 graus Celsius por três a cinco minutos.Em seguida, aspire a solução do meio de cultura e lave suavemente as células duas vezes com DPBS, adicione o meio completo com substituto sérico, livre de células alimentadoras, e desprenda suavemente as células da superfície do recipiente de cultura. Usando um espátula para células, transfira as células para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Enxágue o recipiente de cultura duas vezes com o meio completo contendo substituto sérico.Aplicar suavemente o meio livre de células alimentadoras para remover quaisquer células que não tenham se destacado. Recolher o meio de ambas as lavagens com as células no tubo de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 200 G durante cinco minutos à temperatura ambiente para formar o pellet celular sem perturbar o pellet de células.Aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Agite suavemente o tubo para desprender completamente o pellet celular do fundo do tubo. Reuspenda suavemente as células no substituto completo de soro.Meio livre de células alimentadoras usando uma pipeta serológica de cinco mililitros. Não triar. Transfira as células para uma nova placa de 60 milímetros revestida com gelt TRX na proporção de divisão desejada.Mova o recipiente de cultura para frente e para trás, e de um lado para o outro, várias vezes para dispersar as células por sua superfície. Coloque o recipiente de cultura em um incubador a 37 graus Celsius com uma atmosfera umidificada de quatro a 6% de dióxido de carbono no ar no dia seguinte. Substitua suavemente o meio usado pelo substituto completo de soro.Alimente com meio livre de células para remover detritos celulares. Substitua o meio usado a cada dia a partir de então. Esta imagem em contraste de fase mostra células-tronco pluripotentes induzidas humanas cultivadas em placas de cultura revestidas com gelt TRX, utilizando meio livre de células de alimentação e substituto sérico completo.A morfologia das CIPs é semelhante à das células-tronco embrionárias humanas, caracterizada por núcleos grandes e citoplasma escasso. A coloração imunológica mostra que as CIPs cultivadas em meio com substituto de soro tipo knockout mais um coquetel de fatores de crescimento expressaram os marcadores de pluripotência OCT4 e SSEA-4. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como adaptar e manter suas CIPs em condições livres de soro tipo knockout e sem camada de sustentação. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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Criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando KnockOut Completa Feeder livre de substituição de soro Médio

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Coleção de sérica e sem Alimentador rato-tronco embrionárias Médio condicionado celular para uma abordagem livre de celular

A caracterização regular de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), para verificar a manutenção de seu estado pluripotente, é um passo importante antes que essas células sejam usadas para outras aplicações. Aqui descrevemos um método para a propagação em pequena escala de iPSCs humanas especificamente projetado para permitir sua caracterização fácil e rotineira via imunocitoquímica.

Propagação em pequena escala de iPSCs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina

A produção de células especializadas da retina, de células-tronco pluripotentes é um ponto de viragem no desenvolvimento da terapia baseada em células-tronco para doenças da retina. O presente documento descreve um método simples para uma eficiente geração de organoids da retina e Epitélio pigmentado da retina para pesquisa básica, translacional e clínica.

Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos

Apresentamos aqui um protocolo para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas humanas em cada derivado do somite (Miótomo, sclerotome, dermátomo e syndetome) em condições quimicamente definidas, que tem aplicações em modelagem de doenças futuras e terapias baseadas em células em cirurgia ortopédica.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

Para evitar as limitações associadas à passagem enzimática ou mecânica de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) cultivadas em células alimentadoras, estabelecemos um método rápido, eficaz, econômico e de alto rendimento para a colheita de colônias hESC ou hiPSC mantidas em uma camada de células alimentadoras de fibroblastos de prepúcio humano usando desadesão mediada por EDTA.

Passagem rápida, econômica e livre de enzimas de células-tronco pluripotentes humanas em células alimentadoras por adesão mediada pelo ácido etilenodiaminotetracético

Aqui, apresentamos um método para diferenciar e expandir células assassinas naturais que expressam o receptor de antígeno quimérico derivado de iPSC humano (CAR) com morte aprimorada contra várias malignidades. Este protocolo demonstra a diferenciação e expansão de células CAR-NK derivadas de iPSC otimizadas para natural killer (NK) e a medição da atividade antitumoral contra várias linhagens de células tumorais.

Avanços em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam o receptor natural killer do antígeno quimérico derivado de células-tronco

Aprenda a adaptar e manter células-tronco pluripotentes induzidas humanas em cultura livre de alimentador usando meio KSR-FF. Este método melhora a consistência e eficiência na pesquisa com células-tronco.

Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio (Vídeo) | JoVE Journal

Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio

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