Criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando KnockOut Completa Feeder livre de substituição de soro Médio
July 15th, 2010
Este protocolo descreve o procedimento detalhado para a criopreservação de células iPS humanas no meio de criopreservação KnockOut SR e recuperação destas células em completa KnockOut Feeder SR Free (KSR-FF) médio ou alimentação baseada em médias KnockOut SR.
O objetivo geral deste procedimento é criopreservar e recuperar células IPS em condições de cultura baseadas em alimentador ou sem alimentador. Isso é feito começando a empacotar seus IPCs como faria normalmente. A segunda etapa do procedimento é transferir as células para o meio de congelamento livre de soro.
A terceira etapa do procedimento é criopreservar como faria normalmente. A etapa final do procedimento é descongelar as células e iniciar a manutenção. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram congelamento e descongelamento bem-sucedidos de células IPS em meio de congelamento livre de soro por meio de morfologia saudável e recuperação pós-descongelamento.
Olá, sou Kate Wagner no site GCO da Life Technologies. A demonstração visual desse protocolo é crítica porque os IPCs podem ser muito sensíveis ao congelamento e ao T fine. O que torna esse protocolo mais fácil é que a reposição do soro knockout pode ser usada em todo o seu fluxo de trabalho.
Hoje, a família de produtos KSR inclui uma lista completa de meios e reagentes para cultura sem ração e sem xeno de suas células-tronco embrionárias e células-tronco pluripotentes induzidas. O KSR pode ser usado para crescimento de derivação, criopreservação, expansão e os primeiros passos iniciais de diferenciação. O vídeo a seguir mostrará você descongelar e congelar usando KSR em uma máquina livre de Peter.
Para iniciar este procedimento. Primeiro aqueça em uma quantidade apropriada de meio livre de alimentador completo a 37 graus Celsius em banho-maria aspire o meio gasto do recipiente de cultura, que é um prato de 60 milímetros. Neste caso, lave as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos duas vezes com DPBS.
Em seguida, adicione um mililitro de dispa ao prato. Incube o prato a 37 graus Celsius por três minutos. Depois disso, aspire a solução dispa e lave suavemente as células com DPBS.
Em seguida, adicione um meio completo sem alimentador para cobrir o prato e use um raspador de células para raspar suavemente as células de transferência para um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Enxágue o prato com ração completa de meio livre, borrifando suavemente as células que não se soltaram. Transfira a solução de enxágue para o mesmo tubo de 15 mililitros que contém as células.
Enxágue o prato uma segunda vez com meio e puxe a solução de enxágue com as células de pellet por centrifugação a 1000 RPM por três minutos em temperatura ambiente. Após centrifugação, aspirar cuidadosamente e rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Agite suavemente o tubo para desalojar completamente o pellet celular do fundo do tubo.
Em seguida, adicione um mililitro de meio congelante A, usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros e ressuspenda as células pipetando suavemente para cima e para baixo. Após a suspensão uniforme dos aglomerados, adicione um mililitro de meio de congelamento B ao tubo de maneira gota a gota, girando suavemente a suspensão celular para misturar. Aloque um mililitro de suspensão celular em cada células de congelamento criogênico vil a menos 80 graus Celsius durante a noite em uma câmara de isopropanol.
No dia seguinte, transfira os frascos das células para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Descongele rapidamente o frasco congelado de células, colocando-o em banho-maria a 37 graus Celsius por cerca de três a quatro minutos até que apenas um pequeno pedaço congelado permaneça no frasco. Depois de remover o frasco do banho-maria, borrife com isopropanol a 70% para descontaminá-lo, use uma pipeta de cinco mililitros para transferir assepticamente todo o conteúdo do frasco para um tubo cônico de 15 mililitros.
O próximo passo pode ser o aspecto mais difícil do procedimento. O meio livre de alimentador deve ser adicionado lenta e cuidadosamente às células. Para reduzir o choque osmótico Adicione lentamente quatro mililitros de meio completo sem alimentador gota a gota às células no tubo cônico de 15 mililitros.
Ao adicionar o meio, mova suavemente o tubo para frente e para trás para misturar as células. Isso reduzirá o choque osmótico nas células. O meio sem alimentador completo pode ser substituído por substituição de soro knockout contendo meio condicionado com metanfetamina ou meio de substituição de soro knockout para uso com alimentadores, consulte o texto do protocolo para obter instruções de preparação do meio.
Uma vez que todos os quatro mililitros de meio tenham sido adicionados, centrifugue as células a 1000 RPM por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente e descarte o sane sem perturbar o pellet celular. Ressuspenda suavemente o pellet celular em quatro mililitros de meio completo sem alimentador.
Usando uma pipeta de cinco mililitros, adicione suavemente a suspensão da célula gota a gota a uma placa de cultura de 60 milímetros revestida com caminhões gelt. Coloque a placa de cultura em uma incubadora de 36 a 38 graus Celsius com uma atmosfera umidificada de quatro a 6% de dióxido de carbono no ar. Gire cuidadosamente o prato em um padrão de norte a sul, leste a oeste para distribuir uniformemente as células.
24 horas após o descongelamento. Substitua o meio no prato por meio fresco. Substitua o meio gasto diariamente até que as células se tornem aproximadamente 70 a 80% confluentes.
Esta imagem de contraste mostra células-tronco pluripotentes induzidas por humanos cultivadas em placas de cultura revestidas com gelt TRX usando substituição completa de soro, meio livre de alimentador. Os IPCs exibem morfologia semelhante às células-tronco embrionárias humanas, caracterizadas por núcleos grandes e citoplasma escasso. Um exemplo de células pós-descongelamento e substituição de soro nocaute.
O meio livre do alimentador no gelt TrackX é mostrado aqui. Ao seguir este procedimento, é importante lembrar de manter todas as colônias de células do mesmo tamanho. Ao criopreservar, isso melhora a recuperação celular.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este protocolo descreve o procedimento para a criopreservação de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPS) usando o meio de criopreservação KnockOut SR e sua recuperação em meio completo KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) ou meio KnockOut SR baseado em feeder. O método enfatiza a importância da demonstração visual devido à sensibilidade das células iPS durante o congelamento e o descongelamento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Pesquisa de Células-tronco
- Técnicas de Criopreservação
Fundamento
- As células iPS humanas são sensíveis aos processos de congelamento e descongelamento.
- Os produtos KnockOut SR facilitam várias etapas da cultura de células-tronco.
- A criopreservação adequada é crucial para manter a viabilidade celular.
- Condições de cultura sem feeder e baseadas em feeder podem ser utilizadas para células iPS.
Propósito do Estudo
- Fornecer um protocolo confiável para a criopreservação de células iPS.
- Garantir a recuperação bem-sucedida das células após o descongelamento.
- Demonstrar o uso dos produtos KSR ao longo do fluxo de trabalho.
Métodos Utilizados
- Preparação das células iPS para criopreservação.
- Uso de meio de congelamento sem soro para preservação celular.
- Criopreservação a -80 graus Celsius seguida por armazenamento em nitrogênio líquido.
- Descongelamento e ressuspensão das células em meio completo sem feeder.
Principais Resultados
- Congelamento e descongelamento bem-sucedidos das células iPS demonstrados por morfologia saudável.
- As células mantiveram viabilidade e crescimento em condições tanto sem feeder quanto baseadas em feeder.
- A eficácia do protocolo confirmada através da avaliação visual da recuperação celular.
- A manutenção de tamanho uniforme das colônias celulares melhorou as taxas de recuperação.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem sistemática para a criopreservação de células iPS.
- Os produtos KnockOut SR são eficazes para manter a saúde celular durante o processo.
- Demonstrações visuais melhoram a compreensão e a execução do protocolo.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Reliable cryopreservation and recovery of human iPS cells using feeder-free, defined media directly addresses scalability and standardization challenges in early discovery and translational research. This protocol enables consistent pluripotent cell banking, supporting robust assay development and downstream applications in drug discovery portfolios. Feeder-free workflows reduce biological variability, enhancing predictive confidence and portfolio triage at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent banking of pluripotent cells for repeated hypothesis testing and pathway interrogation.
- Reduces biological variability by eliminating feeder layers, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by maintaining cell health and pluripotency post-thaw.
- Supports predictive confidence in early-stage screening and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, feeder-free system for preparing validated iPS cells for high-throughput assays.
- Improves reproducibility and scalability of cell-based assays by using defined media components.
- Enables reliable compound evaluation by ensuring healthy, undifferentiated cell recovery.
- Supports platform reuse and assay standardization across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Maintains disease-relevant cell models for translational biomarker studies when using patient-derived iPS cells.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting robust cell recovery and expansion.
- Reduces risk of batch-to-batch variability in preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing reliable cell sources.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation and recovery protocol fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless transitions between banking, expansion, and assay deployment stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by providing healthy, pluripotent cells on demand.
- Screening: Delivers assay-ready iPS cells with reproducible morphology and viability for quantitative readouts.
- Analytics: Enables consistent measurement of cell health and recovery, supporting cross-condition comparisons.
- Translational Research: Maintains continuity for disease modeling and biomarker alignment when using patient-derived lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, feeder-free workflow for pluripotent cell management across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Standardizes cryopreservation and recovery, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pluripotent stem cell handling and feeder-free culture techniques.
- Needs access to defined media, cryopreservation equipment, and controlled thawing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell colony size and handling procedures for optimal recovery.
- Adaptation may be needed for different iPS cell lines or disease models.
- Careful osmotic shock management is critical for maintaining cell viability post-thaw.
