Name: Criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando KnockOut Completa Feeder livre de substituição de soro Médio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a criopreservar e recuperar células-tronco iPS humanas usando meio KnockOut SR sem soro. Este protocolo demonstra congelamento a -80°C e descongelamento para manter viabilidade celular em cultura livre de alimentadores.

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Nota: Para manter as condições de cultura estéril, todos os procedimentos neste protocolo são realizadas utilizando práticas de laboratório estéril e conduzidos sob uma capela de fluxo laminar. Antes de começar, certifique-se que qualquer mídia é equilibrado a 37 ° C e adequadamente gaseados. Preparar pratos Geltrex revestido Cultura Nota: ver anexo para o uso de placas de cultura de CELLstart revestido. <ol><li> Tubo de descongelar um dos Geltrex (1 mL) lentamente a 2-8 ° C e diluir 1:100 em 99 mL de Knockout D-MEM/F-12. Misturar a solução suavemente. Nota: Algumas linhagens de células iPS podem requerer uma diluição Geltrex diferentes para o crescimento ideal. Veja o apêndice para diluições de alternativa. </li><li> Cobrir toda a superfície de cada placa de cultura com a solução Geltrex (1 mL para um prato de 35 mm, 1,5 mL para um prato de 60 mm). </li><li> Seal cada prato com Parafilm para evitar a secagem e incubar os pratos para 1 hora a 37 ° C. Nota: Neste ponto, você pode armazenar os pratos Geltrex revestido cultura a 4 ° C por até 1 mês. Seal cada prato com Parafilm para impedir a Geltrex sequem. </li><li> Antes de usar, transferir os pratos Geltrex revestido a uma capela de fluxo laminar e permitir-lhes atingir a temperatura ambiente (cerca de 1 hora). </li></ol> Preparando Alimentador-Free SR Completa KnockOut Médio <ol><li> Para preparar 1 mL de 10 mcg / ml solução FGF Basic, assepticamente misturar os componentes listados abaixo. Alíquota da solução e armazenar a -20 ° C por até 6 meses. <table border="0"><tbody><tr><td> FGF básico </td><td> 10 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 L </td></tr></tbody></table> Nota: BSA pode ser substituído com HSA ou SR Knockout na mesma concentração. </li><li> Para preparar 50 mL de solução 2 Dispase mg / mL, assepticamente misturar os componentes listados abaixo. Filtro de esterilizar a solução e armazenar a 4 ° C por até duas semanas. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Para preparar 100 mL de SR KnockOut completa Alimentador-Free (KSR-FF) assepticamente combinar os componentes listados na tabela abaixo. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentração de ações </td><td> Concentração Final </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (Cat. n º. 12.660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> Glutamax-I (Cat. No. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR (sem Cat.. 10.828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (sem Cat.. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (Cat. n º. PHG0024). </td><td> 10 mcg / mL </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 mL </td></tr></tbody></table> Você pode armazenar o meio KSR-FF a 2-8 ° C por até uma semana. </li><li> Pouco antes de pré-equilibrar o meio completo à temperatura e gases, adicionar assepticamente o volume necessário de 2-mercaptoetanol (55 mM de concentração de ações) para uma concentração de 0,1 mM final. Por exemplo, para preparar 100 mL da KSR-FMédio F adicionar 182 mL de 55 mM 2-mercaptoetanol (1:550 diluição) Alternativamente, o 2-mercaptoetanol podem ser adicionadas ao meio 1X preenchido e armazenado a 2-8 ° C por até uma semana. </li></ol> Preparando congelamento / Criopreservação Médio O meio de criopreservação consiste em dois meios de comunicação; Médio Congelamento A e B. Congelamento Médio Eles são adicionados às células em momentos diferentes e devem permanecer separados. Eles estão cada 50% do volume total de Medium Criopreservação necessário. O volume total de Medium Criopreservação necessário é 1 mL para cada frasco a ser congelados. Um prato de 90% confluentes 60mm de CTEh pode ser usado para o banco 2 frascos de CTEh na mídia criopreservação. Prepare volume suficiente de cada meio de congelamento, com um extra de 2-5 mL para garantir excedente. <table border="1"><tbody><tr><td> Congelamento Médio A (50% do volume final): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> KSR 50% </td></tr><tr><td> Congelamento Médio B (50% do volume final): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% DMSO </td></tr></tbody></table> Exemplo: Se você está congelando 20 frascos de células, você precisará de 20 mL de Criopreservação Médio. Adicionar 4 ml de sobrecarga para um total de Medium Criopreservação 24mL. Isso significa que você vai precisar de 12 ml Médio Congelamento A. (50% de 24mL) e 12 ml de B Freezing Medium (50% de 24mL) <table border="1"><tbody><tr><td> Congelamento Médio A (12 ml): </td><td> 6 mL DMEM/F12 </td><td> 6 mL KSR </td></tr><tr><td> Congelamento Médio B (12 mL): </td><td> 9,6 mL DMEM/F12 </td><td> 2,4 mL DMSO </td></tr></tbody></table> A composição final do Médio Criopreservação é de 65% DMEM/F12, KSR 25% e DMSO 10%. Criopreservação iPSCs <ol><li> Pré-aquecer o volume necessário de Dispase em um banho de água 37 ° C. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários. </li><li> Pré-equilibrar o volume necessário de KSR-FF em um banho de água a 37 ° C for15 min. Consulte a Tabela 1below para obter detalhes sobre os volumes necessários. </li><li> Aspirar o meio de gastos do navio cultura usando uma pipeta, e lavar as células duas vezes com D-PBS. </li><li> Delicadamente adicionar pré-aquecido Dispase solução para o navio de cultura (por exemplo, 1 mL de solução Dispase por 60 mm placa de cultura). Redemoinho do navio cultura para revestir a superfície da célula inteira. </li><li> Incubar a embarcação cultura a 37 ° C por 3 minutos. </li><li> Remover o navio da incubadora, aspire a solução Dispase e lavar cuidadosamente as células com D-PBS. </li><li> Raspe as células da superfície da placa de cultura com uma espátula de células, e transferência das células para um tubo de centrifugação estéril 15ml. </li><li> Lavar o prato de cultura duas vezes com KSR-FF, gentilmente &quot;pulverização off&quot; as células que não tenham destacado. Piscina do enxágüe meio com as células no tubo de 15mL. </li><li> Centrifugar o tubo a 200 xg por 5 minutos em temperatura ambiente para agregar as células. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e descartá-lo. </li><li> Prepare uma quantidade suficiente de criotubos. Uma vez que as células estão em contato com DMSO, devem ser aliquotado e congelado dentro de 2-3 minutos. </li><li> Agite suavemente o tubo, para desalojar totalmente o pellet celular a partir do fundo do tubo e volte a suspender as células em A. Medium Congelamento [cuidado pipetando para cima e para baixo usando a 5 mL pipeta sorológica]. Após suspensão uniforme de aglomerados, adicionar igual volume de B Freezing Medium para ele, de uma forma sábia queda, enquanto gentilmente agitando o suspensão de células para misturar. Nota: Neste ponto, as células estão em contato com DMSO e trabalho deve ser realizado de forma eficiente. Uma vez que as células estão em contato com DMSO, devem ser aliquotado e congelado dentro de 2-3 minutos. </li><li> Ml 1 alíquota da suspensão de células em cada cryovial. </li><li> Rapidamente colocar os frascos em um Mr. Frosty [para congelar rapidamente] e transferi-lo para -80 ° C durante a noite. </li><li> Após o armazenamento durante a noite a -80 ° C, a transferência das células para um tanque de nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo. </li></ol> iPSC descongelar frasco e recuperação das células Nota: KSR-FF pode ser substituído com KSR meio contendo MEF-condicionado, ou médio KSR para uso com alimentadores. Veja o apêndice para obter instruções para a preparação de meios de comunicação. Pré-aquecer 10ml de KSR-FF médio em um tubo de 50 mL. <ol><li> Equilibrar a quantidade adequada de Geltrex revestido pratos à temperatura ambiente e aspirar qualquer tipo de líquido a partir os pratos antes que você platingr células. </li><li> Remova cuidadosamente a CTEh (ou iPSC) frasco de Tanque de armazenamento de nitrogênio líquido. </li><li> Descongelar rapidamente frasco frozen de células em um banho de água 37 ° C, até que apenas um pequeno pedaço congelado permanece no frasco. </li><li> Pulverizador frasco com 70% isopropanol para descontaminar-lo e transferi-la para a capa estéreis de cultura de tecidos. </li><li> Transferir assepticamente todo o conteúdo do frasco em um tubo cônico de 15 mL utilizando uma pipeta de 5 mL. </li><li> Lavar o frasco com 1 mL de KSR-FF e adicione este ao tubo de centrifugação de 15 mL. </li><li> Lentamente, adicionar 4 mL da KSR-FF gota a gota, para as células no tubo de 15mL cônico. Ao adicionar o meio, gentilmente mova o tubo para trás e para misturar as células. (Isto reduz choque osmótico para as células). </li><li> Centrifugar o tubo de 15 mL com a suspensão de células em 1000rpm (200 x g) por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Aspirar cuidadosamente e descartar o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. </li><li> Re-suspender o pellet celular pré-aquecido KSR-FF (por exemplo, prato 4mL/60 milímetros), utilizando uma pipeta de 5 mL e gentilmente pipeta as células para cima e para baixo até pellet celular está totalmente dispersa. A viabilidade de mais de 70% é esperado, no entanto, se a viabilidade é inferior a 70%, pode demorar mais tempo para as células para chegar a confluência. </li><li> Usando a mesma pipeta, transferir a suspensão celular gota a gota, a Geltrex revestido placa de cultura pré-equilibradas à temperatura ambiente. </li><li> Coloque o prato de cultura em uma incubadora de 37 ° C, com uma atmosfera húmida de 4 a 6% CO 2 no ar. Cuidadosamente redemoinho em um navio norte a sul, de leste a oeste padrão para distribuir uniformemente as células. </li><li> Suavemente fluido mudar a placa de cultura de 24 horas pós-descongelamento, e depois diariamente para remover os restos celulares e para fornecer nutrientes fresco até que o prato é de aproximadamente 70-80% confluentes. Para a cultura e continuou passaging de células iPS seu, consulte nosso protocolo intitulado &quot;Alimentador-Livre Cultura e Passaging das células humanas iPS usando Completa KnockOut substituição Feeder Serum-Free Medium&quot; </li></ol> Resultados esperados As células devem ser cerca de 70-80% confluentes antes da criopreservação. Dispase resultados na digestão enrolando e dobrando das colônias ao longo das margens da colônia. Após a colheita as células são congeladas como pequenos aglomerados na mídia criopreservação. Uma vez que o frasco é descongelado, as células se recuperar e anexar o prato pré-revestidos como pequenos aglomerados. Eles crescem rapidamente levando a um prato confluentes em 5-6 dias. Tabela 1 - Volumes recomendadas <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Dish 35 milímetros </td><td> Dish 60 milímetros </td><td> Dish 100 milímetros </td></tr><tr><td> Completa KnockOut SR médio </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Geltrex Solution </td><td> 1 mL </td><td> 1,5 mL </td><td> 4-5 mL </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0,5 mL </td><td> 1 mL </td><td> ML 3-4 </td></tr><tr><td> D-PBS para lavagem </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr></tbody></table> Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">clique aqui para ver o apêndice</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

Os autores deste artigo são empregados por Life Technologies, que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 Knockout</td><td></td><td>12660-012</td><td>Observação: veja o apêndice para o uso de produtos alternativos de DMEM com GlutaMAX-I (n.º do catálogo 35050-061)</td></tr><tr><td>Substituto Sérico KnockOut</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail de Fatores de Crescimento do Substituto Sérico KnockOut</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-básico, proteína recombinante humana, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Observação: veja o apêndice para tamanhos alternativos de embalagem de bFGF.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;etanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>Observação: veja o apêndice para métodos alternativos de passagem</td></tr><tr><td>Matriz Basal com Fator de Crescimento Reduzido Geltrex Qualificada para hESC, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco&amp;rsquo;s (D-PBS) sem cálcio e magnésio</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500 mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Capa de Fluxo Laminar Estéril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ajustada a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria ajustado a 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estéreis (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de centrífuga de 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura celular tratadas de 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tanque de armazenamento em nitrogênio líquido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipientes estéreis para congelação com isopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos criogênicos de 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

criopreservação e recuperação das células humanas ips usando knockout completa feeder livre de substituição de soro médio

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

A descoberta em 2006 que fibroblastos humanos e mouse poderia ser reprogramado para gerar células iPS 1-3 com qualidades muito semelhantes às células-tronco embrionárias criou uma valiosa fonte de novas células pluripotentes para descoberta de medicamentos, terapia celular, e pesquisa básica. Media GIBCO e reagentes têm estado na vanguarda da pesquisa com células-tronco pluripotentes por anos. Knockout DMEM suplementado com Knockout Serum substituição é a mídia de sua escolha para o crescimento de células-tronco embrionárias e, agora, de cultura de células iPS 3-9. Este padrão ouro sistema de mídia agora pode ser usado para alimentação livre de cultura com a adição de Knockout SR Cocktail Fator de Crescimento. ES humana e métodos tradicionais de cultura de células iPS requerem o uso de mouse ou camadas de alimentação humana de fibroblastos, ou alimentador condicionado médio. Estes métodos cultura são de trabalho intensivo, difícil de escala e é difícil manter quadris células indiferenciadas, devido às condições indefinido. Invitrogen desenvolveu Knockout SR Cocktail Fator de Crescimento para permitir que você facilmente transição seus quadris e culturas de células-tronco embrionárias humanas para alimentação livre, mantendo o uso do SR Knockout.

Este protocolo descreve o procedimento detalhado para a criopreservação de células iPS humanas no meio de criopreservação KnockOut SR e recuperação destas células em completa KnockOut Feeder SR Free (KSR-FF) médio ou alimentação baseada em médias KnockOut SR.

Criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando KnockOut Completa Feeder livre de substituição de soro Médio

A descoberta em 2006 de que fibroblastos humanos e de camundongo poderiam ser reprogramados para gerar células iPS 1-3 com qualidades notavelmente semelhantes às de células-tronco embrionárias ...

O objetivo geral deste procedimento é criopreservar e recuperar células IPS em condições de cultivo com ou sem células de suporte. Isso é realizado inicialmente embalando suas células IPS da maneira habitual. O segundo passo do procedimento é transferir as células para um meio de congelamento livre de soro.O terceiro passo do procedimento é realizar a criopreservação da maneira habitual. O passo final do procedimento é descongelar as células e iniciar a manutenção. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o congelamento e descongelamento bem-sucedidos de células IPS em meio de congelamento livre de soro, por meio da morfologia saudável e da recuperação após o descongelamento.Olá, sou Kate Wagner no local da GCO na Life Technologies. A demonstração visual deste protocolo é fundamental porque os IPCs podem ser muito sensíveis ao congelamento e à temperatura fina. O que torna este protocolo mais fácil é que o substituto de soro sem células pode ser usado em todo o seu fluxo de trabalho.Hoje, a família de produtos KSR inclui uma lista completa de meios e reagentes para o cultivo com ou sem células de alimentação, livre de soro e livre de componentes xenógenos, de suas células-tronco embrionárias e células-tronco pluripotentes induzidas. O KSR pode ser utilizado na derivação, crescimento, criopreservação, expansão e nos primeiros passos iniciais da diferenciação. O vídeo a seguir mostrará a você como descongelar e congelar sozinho, utilizando KSR em uma máquina livre de Peter.Para iniciar este procedimento, primeiro aqueça uma quantidade apropriada de meio completo livre de células alimentadoras a 37 graus Celsius em banho-maria, aspire o meio usado do recipiente de cultura, que é uma placa de 60 milímetros. Neste caso, lave as células-tronco pluripotentes induzidas humanas duas vezes com DPBS.Em seguida, adicione um mililitro de dispa à placa. Incube a placa a 37 graus Celsius por três minutos. Após isso, aspire a solução de dispa e lave suavemente as células com DPBS.Em seguida, adicione meio completo sem células alimentadoras para cobrir a placa e use um espátula celular para desprender suavemente as células, transferindo-as para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Enxágue a placa com meio completo sem células alimentadoras, borrifando suavemente para remover quaisquer células que não tenham se destacado. Transfira a solução de enxágue para o mesmo tubo cônico de 15 mililitros contendo as células.Enxágue o recipiente uma segunda vez com meio e recolha essa solução de enxágue com as células, centrifugando o pellet celular a 1000 RPM durante três minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Agite suavemente o tubo para desprender completamente o pellet celular do fundo do tubo.Em seguida, adicione um mililitro do meio de congelamento A, utilizando uma pipeta serológica de cinco mililitros, e ressuspenda as células pipetando suavemente para cima e para baixo. Após a suspensão uniforme dos agregados, adicione um mililitro do meio de congelamento B ao tubo em gotas, agitando suavemente a suspensão celular em movimentos de rotação para misturar. Distribua um mililitro da suspensão celular em cada tubo criogênico e congele as células a menos 80 graus Celsius durante a noite em uma câmara de isopropanol.No dia seguinte, transfira os frascos com células para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Descongele rapidamente o frasco congelado de células colocando-o em banho-maria a 37 graus Celsius por cerca de três a quatro minutos, até que reste apenas um pequeno pedaço congelado no frasco. Após remover o frasco do banho-maria, pulverize com isopropanol a 70% para descontaminá-lo e, em seguida, use uma pipeta de cinco mililitros para transferir assépticamente todo o conteúdo do frasco para um tubo cônico de 15 mililitros.O próximo passo pode ser o aspecto mais difícil do procedimento. O meio livre de células alimentadoras deve ser adicionado lentamente e com cuidado às células. Para reduzir o choque osmótico, adicione lentamente quatro mililitros de meio completo livre de células alimentadoras gota a gota às células no tubo cônico de 15 mililitros.Enquanto adiciona o meio, mova suavemente o tubo de um lado para o outro para misturar as células. Isso reduzirá o choque osmótico nas células. O meio completo livre de células alimentadoras pode ser substituído por meio condicionado com metionina contendo substituto sérico knockout ou por meio com substituto sérico knockout para uso com células alimentadoras; consulte o texto do protocolo para instruções de preparação dos meios.Após a adição dos quatro mililitros de meio, centrifugue as células a 1000 RPM durante cinco minutos em temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Resuspenda suavemente o pellet celular em quatro mililitros de meio completo livre de células alimentadoras.Usando uma pipeta de cinco mililitros, adicione suavemente a suspensão celular gota a gota em uma placa de cultura de 60 milímetros revestida com gel. Coloque a placa de cultura em um incubador a 36 a 38 graus Celsius, com uma atmosfera umidificada contendo de 4 a 6% de dióxido de carbono no ar. Agite cuidadosamente a placa em um padrão de norte a sul, leste a oeste, para distribuir as células uniformemente.24 horas após o descongelamento. Substitua o meio no recipiente por meio fresco. Substitua o meio usado diariamente a partir de então até que as células atinjam cerca de 70 a 80% de confluência.Esta imagem de contraste mostra células-tronco pluripotentes induzidas humanas cultivadas em placas de cultura revestidas com gelt TRX, utilizando meio livre de camada de alimentação e substituição sérica completa. As CIPs exibem morfologia semelhante à das células-tronco embrionárias humanas, caracterizada por núcleos grandes e citoplasma escasso. Um exemplo de células após o descongelamento e substituição do soro knockout.Meio livre de células alimentadoras em gelt TrackX é mostrado aqui. Ao seguir este procedimento, é importante lembrar-se de manter todas as suas colônias celulares com o mesmo tamanho. Ao congelar criogenicamente, isso melhora a recuperação celular.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

O protocolo a seguir fornece instruções para a adaptação humana tronco pluripotentes induzidas (iPS) células para alimentação livre de cultura usando completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro médio (KSR-FF). Uma vez adaptado, instruções para a manutenção contínua também são fornecidos.

Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio

Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem a partir do sangue periférico usando uma estratégia de reprogramação episome base e inibidores da histona deacetilase.

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

A caracterização regular de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), para verificar a manutenção de seu estado pluripotente, é um passo importante antes que essas células sejam usadas para outras aplicações. Aqui descrevemos um método para a propagação em pequena escala de iPSCs humanas especificamente projetado para permitir sua caracterização fácil e rotineira via imunocitoquímica.

Propagação em pequena escala de iPSCs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina

Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema tridimensional (3-D) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) chamado corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D pode ser usado como uma cultura de fatia organotípica para modelar o desenvolvimento cortical humano e para a interrogação fisiológica do desenvolvimento de circuitos neurais.

Desenvolvimento de corpos de embrióide livres de soro derivado de HiPSC para a interrogação de culturas de células estaminais 3-D usando ensaios relevantes para o fisiologismo

A produção de células especializadas da retina, de células-tronco pluripotentes é um ponto de viragem no desenvolvimento da terapia baseada em células-tronco para doenças da retina. O presente documento descreve um método simples para uma eficiente geração de organoids da retina e Epitélio pigmentado da retina para pesquisa básica, translacional e clínica.

Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos

As células germinativas primordiais (PGCs) são precursores comuns de esperma e de ovos. PGCs embrionárias humanas são especificados de células do epiblasto pluripotentes através de interações de citocinas. Aqui, descrevemos um protocolo de 13 dias de induzir células humanas transcriptomally PGCs assemelhando-se à superfície dos órgãos do embryoid de células-tronco pluripotentes aprontado-pluripotência induzida.

Geração de células humanas de células germinativas, como Primordial na superfície dos órgãos do Embryoid de aprontado-pluripotência induzida por células estaminais pluripotentes

Os progenitores endoteliais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC-EPs) têm potencial para revolucionar os tratamentos de doenças cardiovasculares e possibilitar a criação de modelos de doenças cardiovasculares mais fiéis. Nisto, o encapsulamento de iPSC-EPs em microambientes tridimensionais do colagénio (3D) e uma análise quantitativa do potencial vasculogenic destas pilhas são descritos.

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Este estudo fornece um protocolo detalhado para a criopreservação eficiente de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco humanas.

Criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal

Aqui, apresentamos um método para diferenciar e expandir células assassinas naturais que expressam o receptor de antígeno quimérico derivado de iPSC humano (CAR) com morte aprimorada contra várias malignidades. Este protocolo demonstra a diferenciação e expansão de células CAR-NK derivadas de iPSC otimizadas para natural killer (NK) e a medição da atividade antitumoral contra várias linhagens de células tumorais.

Avanços em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam o receptor natural killer do antígeno quimérico derivado de células-tronco

Aprenda a criopreservar e recuperar células-tronco iPS humanas usando meio KnockOut SR sem soro. Este protocolo demonstra congelamento a -80°C e descongelamento para manter viabilidade celular em cultura livre de alimentadores.

Criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando KnockOut Completa Feeder livre de substituição de soro Médio

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