Criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando KnockOut Completa Feeder livre de substituição de soro Médio
15 de julho de 2010
Este protocolo descreve o procedimento detalhado para a criopreservação de células iPS humanas no meio de criopreservação KnockOut SR e recuperação destas células em completa KnockOut Feeder SR Free (KSR-FF) médio ou alimentação baseada em médias KnockOut SR.
O objetivo geral deste procedimento é criopreservar e recuperar células IPS em condições de cultivo com ou sem células de suporte. Isso é realizado inicialmente embalando suas células IPS da maneira habitual. O segundo passo do procedimento é transferir as células para um meio de congelamento livre de soro.
O terceiro passo do procedimento é realizar a criopreservação da maneira habitual. O passo final do procedimento é descongelar as células e iniciar a manutenção. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o congelamento e descongelamento bem-sucedidos de células IPS em meio de congelamento livre de soro, por meio da morfologia saudável e da recuperação após o descongelamento.
Olá, sou Kate Wagner no local da GCO na Life Technologies. A demonstração visual deste protocolo é fundamental porque os IPCs podem ser muito sensíveis ao congelamento e à temperatura fina. O que torna este protocolo mais fácil é que o substituto de soro sem células pode ser usado em todo o seu fluxo de trabalho.
Hoje, a família de produtos KSR inclui uma lista completa de meios e reagentes para o cultivo com ou sem células de alimentação, livre de soro e livre de componentes xenógenos, de suas células-tronco embrionárias e células-tronco pluripotentes induzidas. O KSR pode ser utilizado na derivação, crescimento, criopreservação, expansão e nos primeiros passos iniciais da diferenciação. O vídeo a seguir mostrará a você como descongelar e congelar sozinho, utilizando KSR em uma máquina livre de Peter.
Para iniciar este procedimento, primeiro aqueça uma quantidade apropriada de meio completo livre de células alimentadoras a 37 graus Celsius em banho-maria, aspire o meio usado do recipiente de cultura, que é uma placa de 60 milímetros. Neste caso, lave as células-tronco pluripotentes induzidas humanas duas vezes com DPBS.
Em seguida, adicione um mililitro de dispa à placa. Incube a placa a 37 graus Celsius por três minutos. Após isso, aspire a solução de dispa e lave suavemente as células com DPBS.
Em seguida, adicione meio completo sem células alimentadoras para cobrir a placa e use um espátula celular para desprender suavemente as células, transferindo-as para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Enxágue a placa com meio completo sem células alimentadoras, borrifando suavemente para remover quaisquer células que não tenham se destacado. Transfira a solução de enxágue para o mesmo tubo cônico de 15 mililitros contendo as células.
Enxágue o recipiente uma segunda vez com meio e recolha essa solução de enxágue com as células, centrifugando o pellet celular a 1000 RPM durante três minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Agite suavemente o tubo para desprender completamente o pellet celular do fundo do tubo.
Em seguida, adicione um mililitro do meio de congelamento A, utilizando uma pipeta serológica de cinco mililitros, e ressuspenda as células pipetando suavemente para cima e para baixo. Após a suspensão uniforme dos agregados, adicione um mililitro do meio de congelamento B ao tubo em gotas, agitando suavemente a suspensão celular em movimentos de rotação para misturar. Distribua um mililitro da suspensão celular em cada tubo criogênico e congele as células a menos 80 graus Celsius durante a noite em uma câmara de isopropanol.
No dia seguinte, transfira os frascos com células para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Descongele rapidamente o frasco congelado de células colocando-o em banho-maria a 37 graus Celsius por cerca de três a quatro minutos, até que reste apenas um pequeno pedaço congelado no frasco. Após remover o frasco do banho-maria, pulverize com isopropanol a 70% para descontaminá-lo e, em seguida, use uma pipeta de cinco mililitros para transferir assépticamente todo o conteúdo do frasco para um tubo cônico de 15 mililitros.
O próximo passo pode ser o aspecto mais difícil do procedimento. O meio livre de células alimentadoras deve ser adicionado lentamente e com cuidado às células. Para reduzir o choque osmótico, adicione lentamente quatro mililitros de meio completo livre de células alimentadoras gota a gota às células no tubo cônico de 15 mililitros.
Enquanto adiciona o meio, mova suavemente o tubo de um lado para o outro para misturar as células. Isso reduzirá o choque osmótico nas células. O meio completo livre de células alimentadoras pode ser substituído por meio condicionado com metionina contendo substituto sérico knockout ou por meio com substituto sérico knockout para uso com células alimentadoras; consulte o texto do protocolo para instruções de preparação dos meios.
Após a adição dos quatro mililitros de meio, centrifugue as células a 1000 RPM durante cinco minutos em temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Resuspenda suavemente o pellet celular em quatro mililitros de meio completo livre de células alimentadoras.
Usando uma pipeta de cinco mililitros, adicione suavemente a suspensão celular gota a gota em uma placa de cultura de 60 milímetros revestida com gel. Coloque a placa de cultura em um incubador a 36 a 38 graus Celsius, com uma atmosfera umidificada contendo de 4 a 6% de dióxido de carbono no ar. Agite cuidadosamente a placa em um padrão de norte a sul, leste a oeste, para distribuir as células uniformemente.
24 horas após o descongelamento. Substitua o meio no recipiente por meio fresco. Substitua o meio usado diariamente a partir de então até que as células atinjam cerca de 70 a 80% de confluência.
Esta imagem de contraste mostra células-tronco pluripotentes induzidas humanas cultivadas em placas de cultura revestidas com gelt TRX, utilizando meio livre de camada de alimentação e substituição sérica completa. As CIPs exibem morfologia semelhante à das células-tronco embrionárias humanas, caracterizada por núcleos grandes e citoplasma escasso. Um exemplo de células após o descongelamento e substituição do soro knockout.
Meio livre de células alimentadoras em gelt TrackX é mostrado aqui. Ao seguir este procedimento, é importante lembrar-se de manter todas as suas colônias celulares com o mesmo tamanho. Ao congelar criogenicamente, isso melhora a recuperação celular.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este protocolo descreve o procedimento para criopreservação de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPS) utilizando o meio de criopreservação KnockOut SR e o seu posterior recuperação em meio completo KnockOut SR sem fibroblastos (KSR-FF) ou em meio KnockOut SR com fibroblastos. O método enfatiza a importância da demonstração visual devido à sensibilidade das células iPS durante o congelamento e o descongelamento.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia Celular
- Pesquisa com Células-Tronco
- Técnicas de Criopreservação
Antecedentes
- As células iPS humanas são sensíveis aos processos de congelamento e descongelamento.
- Os produtos KnockOut SR facilitam diversas etapas do cultivo de células-tronco.
- A criopreservação adequada é crucial para manter a viabilidade celular.
- Condições de cultivo com e sem células de suporte podem ser utilizadas para células iPS.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo confiável para a criopreservação de células iPS.
- Garantir a recuperação bem-sucedida das células após o descongelamento.
- Demonstrar o uso de produtos KSR em todo o fluxo de trabalho.
Métodos Utilizados
- Preparação de células iPS para criopreservação.
- Uso de meio de congelamento sem soro para preservação celular.
- Criopreservação a -80 graus Celsius seguida por armazenamento em nitrogênio líquido.
- Descongelamento e ressuspendimento das células em meio completo sem camada de alimentação.
Resultados Principais
- Congelamento e descongelamento bem-sucedidos de células iPS demonstrados por morfologia saudável.
- As células mantiveram viabilidade e crescimento tanto em condições sem camada de sustentação quanto com camada de sustentação.
- A eficácia do protocolo confirmada por meio da avaliação visual da recuperação celular.
- A manutenção de tamanho uniforme das colônias celulares melhorou as taxas de recuperação.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem sistemática para a criopreservação de células iPS.
- Os produtos KnockOut SR são eficazes para manter a saúde celular durante o processo.
- Demonstrações visuais aprimoram a compreensão e a execução do protocolo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A criopreservação confiável e a recuperação de células iPS humanas utilizando meios definidos livres de camada de alimentação abordam diretamente os desafios de escalabilidade e padronização na descoberta inicial e na pesquisa translacional. Este protocolo permite o armazenamento consistente de células pluripotentes, apoiando o desenvolvimento robusto de ensaios e aplicações posteriores em portfólios de descoberta de fármacos. Os fluxos de trabalho livres de camada de alimentação reduzem a variabilidade biológica, aumentando a confiança preditiva e a triagem de portfólio em pontos críticos de inflexão.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite o armazenamento consistente de células pluripotentes para testes de hipóteses repetidos e investigação de vias celulares.
- Reduz a variabilidade biológica ao eliminar camadas de células de suporte, favorecendo a validação funcional de alvos.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao manter a saúde celular e a pluripotência após o descongelamento.
- Apoia a confiança preditiva em decisões de triagem e seleção em estágios iniciais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema padronizado e livre de células alimentadoras para o preparo de células iPS validadas para ensaios de alto rendimento.
- Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios baseados em células ao utilizar componentes definidos de meio de cultura.
- Permite avaliação confiável de compostos ao garantir recuperação saudável de células indiferenciadas.
- Apóia a reutilização de plataformas e padronização de ensaios entre equipes de descoberta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Mantém modelos celulares relevantes para doenças em estudos translacionais de biomarcadores ao usar células iPS derivadas de pacientes.
- Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, apoiando a recuperação e expansão celular robustas.
- Reduz o risco de variabilidade entre lotes no desenvolvimento de modelos pré-clínicos.
- Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao fornecer fontes celulares confiáveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de criopreservação e recuperação é adequado desde as fases iniciais de descoberta até a pesquisa pré-clínica, permitindo transições contínuas entre as etapas de armazenamento, expansão e aplicação de ensaios.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos ao fornecer células pluripotentes saudáveis sob demanda.
- Triagem: Fornece células iPS prontas para ensaios, com morfologia e viabilidade reprodutíveis, para leituras quantitativas.
- Análises: Permite medições consistentes da saúde e recuperação celular, apoiando comparações entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Mantém a continuidade na modelagem de doenças e no alinhamento de biomarcadores ao utilizar linhagens derivadas de pacientes.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável e livre de células alimentadoras para o manejo de células pluripotentes em diversos programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos baseados em células.
- Valor Operacional: Padroniza a criopreservação e recuperação, melhorando a reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de avançar/não avançar e maior eficiência no uso de capital, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas de descoberta e translacionais.
Considerações de Implementação
- Exige experiência no manejo de células-tronco pluripotentes e técnicas de cultivo sem camada de sustentação.
- Requer acesso a meios definidos, equipamentos de criopreservação e infraestrutura de descongelamento controlado.
- Exige padronização entre equipes quanto ao tamanho das colônias celulares e procedimentos de manejo para recuperação ideal.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de células iPS ou modelos de doenças.
- O manejo cuidadoso do choque osmótico é essencial para manter a viabilidade celular após o descongelamento.
