Indução e pontuação clínica de doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental

Sou Christine Beaton. Sou pesquisadora assistente no laboratório de George Chen, do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E o que vou mostrar a vocês nos próximos dias é como induzir e monitorar a EAE crônica recidivante, que significa Encefalomielite Autoimune Experimental em ratos DA.

Este é um modelo animal para esclerose múltipla, ou melhor, um dos modelos animais para esclerose múltipla. Ele se caracteriza por uma paralisia flácida ascendente nesses animais e por características histológicas que se assemelham à doença humana. Portanto, isso levará vários dias.

No primeiro dia, vou mostrar como preparar a emulsão genética com homogenato de medula espinhal vermelha ingênua em adjuvante completo de Freund. No segundo dia, vou demonstrar como imunizar as ratas contra a EAE, e então aguardaremos entre sete e 15 dias para observar os primeiros sinais clínicos nesses animais, momento em que mostrarei os diferentes estágios de progressão da EAE em diversos animais. Primeiramente, vou mostrar todos os reagentes e materiais necessários para preparar a emulsão.

O que estou usando é o adjuvante completo de H 37 ra, mas, embora ele já contenha Mycobacterium tuberculosis, vou suplementá-lo com quatro miligramas por mL de Mycobacterium tuberculosis desidratado IH 37 ra. Para preparar essas bactérias desidratadas, preciso colocá-las em mais alcatrão e transformá-las em um pó fino com a espátula. Uma vez concluído isso, vou adicionar essas bactérias ao adjuvante.

Então, o adjuvante está pronto. O próximo passo é preparar meu antígeno. Vou retirar as medulas espinhais de rato D congeladas a menos 80, e para mantê-las bem congeladas, vou colocá-las sobre o recipiente de pesagem em gelo seco, e vou retirá-las uma a uma e, usando lâminas de barbear simples, vou picar as medulas espinhais nos recipientes de pesagem.

Vou então colocar meu adjuvante suplementado no vórtex. E, enquanto estiver em vórtice, vou adicionar minha medula espinhal pouco a pouco ao meu adjuvante, após termos misturado completamente a medula espinhal ao adjuvante no vórtex. Vamos manter em vórtice por mais cinco minutos e, depois disso, vamos transferir a imersão preparada para cinco seringas de vidro de M.

Vamos conectar duas seringas de vidro de 5 mL usando uma ponte de 16 G e vamos impulsionar a emulsão de uma seringa para a outra o mais rápido possível para essa ponte. E após alguns minutos, quando a emulsão começar a ficar mais dura, vamos trocar por uma ponte menor. Esta é de 18 G, e isso tornará a emulsão ainda mais dura, e vamos mantê-la nessas seringas com esta ponte coberta com papel alumínio durante a noite na geladeira.

Então, pesei 30 miligramas de Mycobacterium tuberculosis no papel de pesagem. Transfiri os para um moedor. E, utilizando um pistilo, reduzi os agregados de bactérias a um pó fino.

Mas você não deve pressionar muito forte com o pistilo para não quebrar as bactérias. Quando as bactérias estão agregadas no início de um procedimento, elas são amarelo-acinzentadas. Se você obtiver um pó fino e homogêneo, terá, ao final, um pó branco, e é isso que se deseja; no entanto, não se deve pressionar com muita força para evitar romper as bactérias.

Depois de fazer isso, peguei 10 mL de adjuvante completo de trans, e me assegurei de que todas as bactérias estivessem em suspensão. Abri esta amostra e despejei os 10 mL inteiros de adjuvante completo de trans no almofariz, sobre o Mycobacterium tuberculosis desagregado. Agora, vou transferir o adjuvante completo suplementado para um tubo de 50 mL.

Agora estou pegando meu adjuvante completo suplementado e colocando-o em um tubo. Claro, as bactérias estão no fundo do líquido, e vou tentar retirar a maioria delas para dentro do tubo. Mas se eu deixar algumas no almofariz, não será um grande problema, porque vou reutilizar este almofariz sem limpá-lo para preparar minha emulsão de medula espinhal.

Aqui estão as medulas espinhais. Elas foram mantidas congeladas a menos 80. Pesei 10 gramas delas para adicionar a 10 ml do meu adjuvante suplementado.

Então, o que vou fazer com essas medulas espinhais, mantendo-as congeladas pelo maior tempo possível, é picá-las bem finamente nessas placas de pesagem usando lâminas de barbear. Para picar essas medulas espinhais bem finamente, você precisará de duas lâminas de barbear e uma placa de pesagem. O que faço é pegar uma medula espinhal, colocá-la na minha placa de pesagem e começar a cortá-la, colocando minha mão por cima para que, como está congelada e tem elasticidade, ela não comece a pular; assim, consigo capturar primeiro os pedaços maiores, mas ela começará a descongelar rapidamente e a grudar na lâmina de barbear.

Então eu uso a outra lâmina de barbear para removê-lo, e tento picar o tecido o mais finamente e rapidamente possível, para que ele não tenha tempo de derreter, pois é muito mais difícil cortá-lo uma vez derretido. É extremamente importante que a medula espinhal seja completamente picada, de forma bem fina, porque quanto mais finamente for picada, mais homogênea será a imersão, e mais ratos ficarão doentes, com uma doença mais homogênea. Por isso, é extremamente importante picar muito bem todas essas medulas espinhais.

Agora vou prosseguir picando cada uma dessas medulas espinhais exatamente da mesma maneira até finalizar os 10 gramas inteiras de medula espinhal. Agora, o que vou fazer é misturar um pouco a medula espinhal no almofariz, apenas para garantir que recolho todo o Mycobacterium tuberculosis que ainda restou no almofariz após concluir a suplementação do adjuvante. E o próximo passo será colocar o adjuvante no vórtex.

E enquanto mantenho a vórtex em agitação contínua e o mais rápido possível, vou adicionar minha medula espinal pouco a pouco a este adjuvante. Agora tenho meu adjuvante suplementado na vórtex, e vou começar a adicionar, adicionando meu cordão medular pouco a pouco. A razão pela qual estou adicionando o A, o antígeno, muito lentamente ao adjuvante é porque estamos preparando uma emulsão de água em óleo.

Então, o adjuvante é composto principalmente por óleo mineral, e o antígeno é uma solução em proporção igual. O que queremos fazer é misturar o antígeno muito lentamente ao óleo, de modo que o óleo envolva completamente o antígeno a cada adição. Se o adicionássemos de uma só vez, o antígeno não seria completamente revestido pelo óleo.

Agora adicionei toda a medula espinal média ao adjuvante no vórtex e coloquei o tubo no vórtex para girar por mais cinco minutos, garantindo que tudo seja completamente misturado. Ajusto a velocidade para obter o maior vórtice possível sem perder muito conteúdo na parte superior do tubo. Agora, os cinco minutos adicionais de vórtice terminaram, e vou interromper o vórtex e transferir meu preparado para seringas de vidro.

Então, montei a seringa completa. Conectei-a à ponte de diâmetro maior e, na outra extremidade da ponte, conectei apenas o corpo de uma seringa. Agora vou adicionar a emulsão a essa seringa. Então, agora, não.

Agora vou transferir todo o líquido para a seringa inferior, desconectar a seringa superior, finalizar a montagem da seringa superior, certificando-me de que não há bolhas de ar na minha seringa inferior nem na conexão. E agora vou reconectar. Assim, agora tenho ambas as seringas conectadas uma à outra por meio desta conexão.

Um está cheio de imersão, o outro está vazio. E o que vou fazer agora é empurrar o êmbolo de uma seringa para a outra o mais rápido possível, de um lado para o outro. Agora vou substituir a ponte de grande diâmetro por uma de diâmetro menor, a ponte de 18 G.

A ponte menor vai tornar a emulsão ainda mais espessa. Para trocar as pontes, coloco toda a emulsão em uma seringa, retiro a seringa vazia, verifico se não perco nada na ponte, removo a ponte, coloco a nova, elimino todas as bolhas de ar e reconecto a outra seringa.

E repito o procedimento, agora que a emulsão é muito mais difícil de atravessar, e tenho o cuidado de não romper essa ponte, que é muito frágil. Repito este procedimento com outro conjunto de seringas enquanto ainda houver emulsão no meu tubo. Assim, uso quantas seringas forem necessárias para consumir toda a emulsão.

Agora já misturei a emulsão várias vezes, talvez 10, 15 vezes, mas isso varia conforme os lotes. E agora está ficando extremamente difícil de agitar. Vou fazer mais algumas vezes, bem, ou talvez não.

Está realmente emperrado agora, então vou deixá-lo assim. Caso contrário, há o risco de quebrar a seringa ou a ponte. Portanto, quando parar de passar, se isso acontecer muito cedo, significa que talvez a ponte esteja entupida.

Mas neste momento, como já mexi pelo menos 10 ou 15 vezes, isso significa que a emulsão está pronta. É muito espessa, então devo deixá-la em repouso. Agora vou envolvê-la com papel alumínio e colocá-la na geladeira durante a noite.

Ontem preparamos a emulsão com medulas espinhais vermelhas e deixamos a emulsão durante a noite na geladeira. Hoje vamos retirá-la e injetar 200 microlitros por rato na base da cauda. Mas antes de injetar, precisamos garantir que a emulsão está adequada.

Portanto, ainda deve estar sólido, e continua sendo um bom sólido. A rachadura que você vê aqui inclusive nos indica que é um bom sólido, não está separado em fases, em duas fases, o que seria ruim. Assim, esta emulsão está adequada para uso.

Assim, cada gaiola receberá 200 microlitros da nossa emulsão. Para injetar, utilizamos seringas de três mililitros, mas garantimos o uso de seringas com ponta lu lock, pois, se usarmos seringas com ponta lisa, a emulsão é tão espessa que a agulha pode sair durante a injeção.

Portanto, utilize sempre uma seringa do tipo lu lock. Quanto à agulha, tentamos usar a menor agulha possível, mas, com uma emulsão tão espessa, precisamos usar uma agulha de calibre 20. Como é necessário injetar com muita precisão na base da cauda, anestesiamos os ratos por alguns minutos e aproveitamos o momento em que os animais estão profundamente adormecidos para marcá-los.

Utilizamos furos nas orelhas, e cada rato é identificado por um padrão específico desses furos. Agora estamos prontos para injetar os ratos, e vamos administrar a cada rato 200 microlitros de emulsão na base da cauda, marcando ao mesmo tempo as orelhas. Preparo a emulsão na seringa de injeção apenas para um rato por vez, porque muitas vezes é realmente difícil injetar, e preciso exercer muita pressão; não quero administrar a um rato mais do que ele necessita.

Então, eu encho a seringa apenas para uma hu de cada vez. Para encher a seringa, conecto minha seringa plástica de injeção à ponte que, por sua vez, está conectada à seringa de vidro que contém a emulsão. Coloco cerca de 300 microlitros de emulsão na minha seringa plástica.

Então conecto a agulha e pressiono o ar para fora da agulha para não perder esses 50 microlitros de espaço morto na agulha. E verifico se restam exatamente 200 microlitros, e então injeto na base da cauda da rata. Agora que injetamos em todos os nossos animais, vamos monitorá-los diariamente.

Portanto, vamos pesá-los todas as manhãs e verificar duas vezes ao dia sinais clínicos de EAE. Os primeiros sinais, como mostrarei quando aparecerem, serão uma cauda flácida, e esperamos observar esses sinais nos primeiros ratos por volta do sétimo ou oitavo dia após a injeção. A maioria dos ratos adoecerá por volta do décimo ao décimo segundo dia, e os ratos mais tardios adoecerão por volta do décimo quinto ao décimo sétimo dia.

Estamos agora no dia 13 após termos imunizado nossos camundongos com a emulsão de medula espinhal, e agora vou monitorar esses animais para verificar sua pontuação clínica. Mas antes de fazer isso, permita-me apresentar como acomodamos nossos animais. As doenças autoimunes possuem esta característica: qualquer patógeno presente no animal irá reduzir a resposta autoimune.

Para evitar isso ao máximo, mantemos nossas ratas em condições específicas. Elas são mantidas neste cubículo, que contém ar filtrado e está sob pressão positiva, e os animais são alojados em gaiolas autoclavadas. Assim, absolutamente tudo dentro da gaiola é autoclavado antes de colocarmos a rata.

E eles têm filtros na parte superior das gaiolas. A ração é a ração padrão para roedores. É I originated.

E também fornecemos água acidificada para nossas ratas. Tomamos água potável normal e adicionamos ácido clorídrico seguindo protocolos padrão, utilizando águas acidificadas para manter a flora intestinal no mínimo, o que reduzirá o risco de comprometer nossa resposta autoimune. Agora estou pronto para realizar a pontuação clínica de minhas ratas.

A pontuação varia de zero, que corresponde à ausência de sinais clínicos, até seis, que representa um estado mórbido no qual o animal deve ser sacrificado. Agora vou guiá-lo passo a passo, mostrando exemplos de cada pontuação clínica que podemos encontrar neste modelo. Estamos agora no dia 13 após a imunização dos ratos com UCAE.

E naquela gaiola eu tenho duas ratas que ainda não adoeceram. Portanto, elas não apresentam absolutamente nenhum sinal clínico de doença. Assim, ambas as ratas ainda estão saudáveis.

Eles estão se movendo de um lado para o outro, correndo, e como você pode ver, quando se movem, levantam a cauda do substrato. Às vezes, deixam a cauda secar, mas na maioria das vezes tentam mantê-la elevada do substrato. E, se tiverem a oportunidade, também tentarão sair da gaiola, o que indica que têm controle completo sobre os quatro membros e podem se levantar, se necessário.

Assim, o primeiro sinal clínico de AE é uma cauda mole. Portanto, se eu levanto uma rata e pressiono o dedo contra a cauda, o rato tenderá a agarrar com a ponta da cauda. Como você acabou de ver, este rato não tem cauda mole, e posso fazer o mesmo com o outro.

A cauda agarra o dedo, o que significa que essas ratas têm uma cauda totalmente reativa. Elas têm um escore clínico de zero, o que na verdade significa ausência completa de sintomas. Aqui está uma rata com escore clínico de 0,5.

Então, se você apenas observar o animal na gaiola, ele se comporta absolutamente normal: está correndo, subindo pelas laterais da gaiola, mas a ponta da cauda nunca se afasta da cama de material. Assim, este rato pode ter uma paralisia parcial da cauda. O que faço então é pegar o rato e realizar o mesmo teste; embora a cauda apresente certo tônus, a extremidade não se enrosca completamente no meu dedo.

Então, atribuirei a esta rata uma pontuação de 1,5, que corresponde a paralisia parcial da cauda. Uma pontuação clínica de um é caracterizada por cauda flácida completa, ou seja, nenhuma parte da cauda possui tônus muscular, mas o animal ainda consegue usar as patas traseiras. Como é possível observar, essa rata está se apoiando na lateral da gaiola, o que demonstra que suas patas traseiras estão funcionando normalmente.

Mas se eu verificar a cauda desses ratos ao pegá-los, não há absolutamente nenhum tônus em suas caudas. Outro teste que você pode fazer é, enquanto a UR está no fundo da gaiola, se você levantar a cauda com uma UR normal, a cauda descerá lentamente ou talvez nem chegue ao chão com a UR com pontuação de um. Se você levantar a cauda, ela cairá imediatamente no chão.

Este RU aqui pode mover todos os quatro membros, mas os membros posteriores são muito fracos para permitir que este RU se levante. Portanto, classificarei este RU com um escore clínico de dois. Assim, a principal diferença entre um escore de um e dois é que o escore de um é apenas uma cauda frouxa.

As patas traseiras são totalmente funcionais, e a pontuação três indica que o rato estaria caindo de lado. Dois é um valor intermediário, ou seja, o rato consegue usar as patas traseiras, mas elas são muito mais fracas do que as de um rato normal. Assim, este rato apresenta uma característica incomum da EAE.

Normalmente, a EAE é caracterizada como uma paralisia flácida ascendente, mas em alguns casos, bastante raros, como este, os ratos desenvolvem primeiro paralisia dos membros dianteiros antes que os membros traseiros fiquem paralisados. E este é o caso desse rato. Então, se você observar, a cabeça dele está mais baixa que o resto do corpo porque ele tem dificuldades com os membros dianteiros e não consegue subir nas laterais da gaiola.

E embora seus membros posteriores estejam funcionando normalmente, ele não consegue empurrar com os membros anteriores. Portanto, eu ainda pontuaria essa rata com uma pontuação de dois, o que corresponderia a uma paraparesia leve, embora normalmente vejamos isso com membros posteriores neste RU, aqui observamos com os quatro membros. Assim, este RU apresenta um fenótipo muito mais grave do que os anteriores.

Apresenta um escore clínico de três. Como vou mostrar a você, os membros dianteiros estão funcionando absolutamente normalmente, mas os dois membros posteriores apresentam uma paralisia moderada. Assim, ambos os membros posteriores são utilizáveis pelo animal para se mover, mas o animal cai de lado e não consegue controlar completamente essas pernas.

Esses esporos estão ficando muito mais fracos do que normalmente seriam sem EE. E nessa fase, já não nos preocupamos mais com a flacidez da cauda, porque muitos desses ratos, após certo tempo, começam a apresentar uma cauda muito rígida. Este ainda tem uma cauda muito flácida, mas às vezes é possível observar alguma distonia. Assim, a cauda começa a se mover de maneira descoordenada.

Portanto, neste nível, não observamos mais a cauda, analisamos apenas o funcionamento dos membros. Pontuamos isso com 3,5 porque, ao examinar as patas traseiras dele, uma se move, mas a outra está completamente paralisada e de forma alguma contribui para o movimento para frente do rato. Assim, isso é considerado uma paralisia completa de uma pata traseira e, portanto, uma pontuação de 3,5.

Este RU possui um escore clínico de quatro, o que significa paralisia completa da linha traseira, caracterizada pela incapacidade total de movimentar as patas traseiras. O rato que temos nesta gaiola possui um escore clínico de cinco, o que corresponde a uma paralisia completa da linha traseira com incontinência adicional. Este animal é incontinente, como podemos observar, está completamente molhado nesta região, o que não vemos nos outros animais que não são incontinentes.

Quando nossos HUS apresentam pontuações de três ou mais, fornecemos garrafas de água com tubos longos para beber, garantindo que possam acessar a água. Também colocamos alimento no fundo da gaiola e fornecemos pacotes de gel. No entanto, apesar de todas essas medidas, cada vez que retiramos os ratos para monitorá-los, o que ocorre duas vezes ao dia, sempre oferecemos água, caso não tenham ingerido quantidade suficiente ao longo do dia.

Aqui tenho um rato com um escore clínico de quatro. E nesse estágio, esses animais precisam ser um pouco estimulados a se alimentar. Então, o que faço é umedecer sua ração, o que facilita muito a mastigação.

Nas últimas duas semanas, mostrei a vocês como induzir e monitorar a EAE crônica recidivante em ratos DA. No primeiro passo, demonstrei como preparar a imersão da medula espinhal e, em seguida, como injetá-la na base da cauda desses ratos. E hoje mostrei a vocês como pontuar esses ratos com diferentes níveis de doença.

É claro que este é um modelo crônico com recaídas, portanto esperamos que os ratos apresentem pontuações flutuantes. A doença entrará em remissão em alguns dias e sofrerá recaídas ao longo do tempo. Alguns ratos entrarão em uma fase mais crônica da doença.

Isso varia de animal para animal. Agora, antes de encerrarmos este vídeo, quero enfatizar um aspecto sobre a testagem de fármacos nesses modelos. O ponto muito importante é randomizar os animais da melhor forma possível.

Uma coisa muito importante a saber é que quanto mais cedo o animal adoece, mais grave será a doença. Portanto, você não deve agrupar todos os seus animais controle no primeiro dia e os animais tratados nos próximos dias. O que fazemos é, assim que um animal adoece e no dia em que desejamos iniciar o tratamento, distribuir aleatoriamente os animais em dois grupos diferentes.

Se tivermos, por exemplo, um grupo controle e um grupo tratado, o primeiro animal irá para o grupo controle, o segundo para o grupo tratado, e assim por diante até que todos os animais sejam alocados em seus respectivos grupos. Porém, garantimos que essa randomização ocorra o mais cedo possível no protocolo. Espero que este vídeo tenha sido útil para você e que você consiga induzir e monitorar a EAE crônica recidivante em ratos D.

E boa sorte com seus experimentos.