Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

O objetivo geral do experimento a seguir é descobrir moléculas pequenas que modulam especificamente aspectos-chave do desenvolvimento embrionário e da fisiologia. Isso é alcançado colocando um grande número de ovos fertilizados em placas de triagem de 96 poços como segundo passo. Aliquotas de uma biblioteca de moléculas pequenas são adicionadas aos poços das placas de 96, em seguida, aos embriões no 96.

Placas de cultura são examinadas quanto a fenótipos induzidos pelas moléculas pequenas. São obtidos resultados que mostram quais moléculas pequenas afetam especificamente o desenvolvimento ou a fisiologia do peixe super. Olá, meu nome é Charles Hong na Escola de Medicina da Universidade de Vanderbilt.

Em nosso laboratório, realizamos triagens químicas de alto rendimento utilizando embriões de peixe-zebra. Esta é uma técnica relativamente simples que pode ser amplamente adaptada para descobrir novos compostos bioativos. Na tarde anterior ao dia da triagem química, prepare de 10 a 20 tanques de reprodução de peixe-zebra.

Coloque um divisor em cada tanque e encha cada tanque com água do sistema de aquicultura, utilizando uma peneira para transferir um macho adulto e uma a duas fêmeas adultas para o recipiente interno. Em cada tanque de reprodução, identifique os tanques e coloque uma tampa sobre eles na manhã do experimento. Remova os divisores dos tanques de reprodução e permita que os peixes-zebra acasalem.

Ao longo da próxima hora, permita que os ovos fertilizados caiam através da grade na parte inferior de cada recipiente interno. Após uma hora, devolva os peixes adultos de seber aos tanques de armazenamento permanentes.

Remova o recipiente interno e colete os ovos filtrando a água de cada tanque de reprodução por meio de um coador plástico para chá. Vire o coador sobre uma placa de Petri e enxágue suavemente o coador para transferir os ovos para a placa de Petri. Utilizando um frasco de lavagem contendo meio E3, remova todos os ovos não fertilizados, que aparecem opacos.

Utilizando uma pipeta plástica descartável, cada cruzamento de acasalamento deve produzir aproximadamente 200 embriões. Em seguida, transfira cerca de cinco embriões para o meio E três em cada poço de uma placa de 96 poços utilizando uma pipeta de vidro de Pasteur. Uma vez que os embriões estejam dispostos na placa de 96 poços.

Remova o máximo possível do meio E três dos poços utilizando uma pipeta de 12 canais. Tenha cuidado para não perfurar os embriões. Com a pipeta de 12 canais, adicione 250 microlitros de E três.

Meio contendo 0,5 microgramas por mililitro de canamicina em cada poço o mais rapidamente possível, para não permitir que os embriões sequem. Coloque as placas de 96 poços em um incubador a 28,5 graus Celsius até que atinjam o estágio desejado, momento em que os compostos serão adicionados. Neste protocolo, procuramos compostos que perturbem o padrão embrionário inicial e incubaremos os embriões por três horas ou até que o estágio de 1000 células seja atingido por mais de 90% dos embriões, conforme normalmente fornecido pelas bibliotecas de moléculas de pequeno porte.

Em uma placa-fonte de 96 poços com cada composto armazenado em DMSO como estoque de 10 milimolar, cerca de 60 minutos antes de os embriões atingirem o estágio desejado, descongele um número apropriado de placas de 96 poços contendo alíquotas de moléculas pequenas. Anote o número de série ou outra identificação das placas-fonte para minimizar a condensação nas placas. Coloque-as em uma câmara de dessecação contendo agente secante.

Centrifugue brevemente as placas em uma centrífuga de bancada equipada com adaptador para placas de múltiplas poções. Remova a fita de alumínio da placa de origem usando uma pipeta de 12 canais e dilua os compostos na placa de origem até a concentração desejada com DMSO. Neste protocolo, utilizamos uma concentração final de 0,5 milimolar e adicionamos 4,75 microlitros de DMSO para diluir a placa estoque de 10 milimolar.

Quando os embriões na placa de 96 poços atingirem o estágio desejado, utilize uma pipeta de 12 canais para transferir 2,5 microlitros de compostos das placas de origem para as placas receptoras contendo os embriões. Tampe as placas que agora contêm os embriões e os compostos, e registre o número de identificação das placas de origem nas placas de embriões. Agite suavemente as placas para misturar e coloque-as em um incubador a 28,5 graus Celsius.

Cubra cada placa de origem contendo pequenas moléculas não utilizadas com folha de alumínio adesiva e coloque no congelador a menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Antes de realizar a triagem visual, defina um critério específico de acerto. Por exemplo, em uma triagem de inibidores de pequenas moléculas para o desenvolvimento de quatro estruturas cerebrais, um acerto pode ser um composto que provoque a perda do prosencéfalo.

A ausência de olhos é um indicador visual simples da perda do prosencéfalo e não requer fluorescência para análise nos momentos desejados do desenvolvimento. Remova as placas de 96 poços contendo embriões tratados com o composto do incubador e examine cada poço sob um microscópio estereoscópico ao realizar triagem de inibidores de pequenas moléculas do desenvolvimento do cérebro anterior; examine as placas às 28 horas para verificar a perda do olho como marcador de inibição do desenvolvimento do cérebro anterior. Registre a identidade da placa e a localização do poço para qualquer poço em que pelo menos três dos cinco embriões exibam o fenótipo hi prescrito. Coloque a placa de 96 poços de volta no incubador.

Reconfirme a perda dos olhos e do prosencéfalo às 48 horas. Embora os embriões não tenham prosencéfalo, sobreviverão por pelo menos quatro dias. Reconfirme um possível acerto testando novamente os efeitos do composto em várias doses; para cada dose, 10 embriões são testados em 0,5 mililitros de meio E3 em formato de placa de 48 poços.

O momento da adição do composto para reteste deve ser idêntico ao do ensaio original. Um HIIT é confirmado quando o fenótipo induzido é reproduzido de maneira dependente da dose durante o reteste do composto. Por fim, identifique o composto hi a partir do banco de dados de moléculas pequenas na biblioteca química.

Utilizando uma tela química visual baseada em peixe-zebra, descobrimos um inibidor do sinal hedgehog de pequena molécula com base em seu efeito no eixo corporal. Esta imagem mostra embriões expostos ao inibidor hedgehog exibindo acentuada curvatura ventral da cauda. Após 24 horas, os mesmos embriões examinados em 48 horas ainda exibem o fenótipo de curvatura ventral.

Esta imagem exibe o embrião tratado com o composto em comparação com o embrião mutante da via hedgehog. Uma vez dominada esta técnica, uma pessoa pode analisar aproximadamente 400 compostos por semana em apenas algumas horas. Esta técnica também abriu caminho para que biólogos químicos estudem fenômenos como o desenvolvimento celular, vias de sinalização celular e desenvolvimento embrionário.

Ao trabalhar com moléculas pequenas não caracterizadas, é importante adotar medidas adequadas de segurança, utilizando jalecos e luvas laboratoriais, pois essas moléculas não caracterizadas podem ser potencialmente perigosas.