Name: Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a realizar triagem em larga escala de pequenas moléculas usando embriões de zebrafish. Este método permite identificar compostos bioativos que modulam o desenvolvimento embrionário e a fisiologia in vivo.

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1) Coleta Egg Zebrafish <ol><li> Na tarde anterior ao dia da tela químicos, criado 10-20 tanques de criação de peixe-zebra. Encher cada tanque com água do sistema de aquicultura. Usando uma rede de pesca, a transferência de um adulto do sexo masculino e 1-2 fêmeas adultas para recipiente interno em cada tanque de criação. Separar os peixes machos e fêmeas do outro com uma divisória. Rótulo as gaiolas e colocar uma tampa em cima deles. </li><li> Na manhã da tela, remover os divisores de tanques de criação e permitir zebrafish para acasalar. Ao longo de 1 hora seguinte, permitem ovos fertilizados para cair através de grade no fundo de cada recipiente interior. </li><li> Depois de uma hora, o retorno zebrafish adulto de volta para os tanques de armazenamento permanente, remova o recipiente interior e recolher os ovos por esforço da água em cada tanque de criação através de um coador de chá de plástico. </li><li> Inverter o filtro mais de uma placa de Petri e lavar o filtro com cuidado para lavar os ovos na placa de Petri, usando um frasco de lavagem contendo o meio E3. </li><li> Todos os ovos não fertilizados, que aparecem opaco, deve ser removido com uma pipeta de plástico descartáveis. Cada cruz de acasalamento deve render cerca de 200 embriões. </li></ol> 2) arraying embriões em placas de 96 poços <ol><li> Transferência de cerca de 5 embriões em meio E3 em cada poço de uma placa de 96 poços usando um copo Pasteur pipeta. </li><li> Uma vez que os embriões são dispostos sobre a placa de 96 poços, remover o máximo do meio E3 possível fora dos poços usando um de 12 canais (3-30 mL) pipeta, tomando cuidado para não perfurar o embrião. Usando a pipeta de 12 canais, entregar 250 L de meio contendo canamicina E3 0.5μg/ml a cada poço o mais rapidamente possível de modo a não permitir que os embriões a secar. </li><li> Coloque as placas de 96 poços em 28,5 ° C incubadora até atingir o estágio desejado quando os compostos a serem adicionados. </li></ol> 3) Transferência da Biblioteca pequena molécula Enquanto a transferência de composto pode ser automatizada com métodos de transferência de robótica, vamos descrever o método de transferência manual. <ol><li> Bibliotecas de moléculas pequenas são normalmente fornecidos em um formato de 96 poços, com cada composto armazenados em DMSO como um estoque de 10 mm. Cerca de 60 minutos antes de os embriões atingem o estágio quando os compostos estão a ser adicionado, descongelar um número desejado de placas de 96 poços contendo alíquotas de pequenas moléculas (placa fonte). Tome nota do número de identificação de série ou outra das placas fonte. Para minimizar a condensação nas placas, o descongelamento pode ocorrer em uma câmara de dessecação contendo Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH). </li><li> Brevemente girar os pratos em uma centrífuga de mesa equipados com multi-bem adaptador placa. </li><li> Remova a fita de vedação de alumínio da placa fonte. Com uma pipeta de 12 canais, diluir os compostos na placa fonte para a concentração de 0,5 mM (por exemplo, se iniciar com 250 nL alíquotas de estoque 10mM, adicionar 4,75 mL de DMSO a cada poço). </li><li> Quando os embriões na placa de 96 poços (placa destinatário) alcançar o estágio desejado, use uma de 12 canais (20-20 mL) pipeta para transferir 2.5μL de compostos (0,5 mm) das placas de origem para as placas contendo o destinatário embriões. </li><li> Registre o número de identificação das placas de fonte nas placas embrião destinatário. Cobrir as placas destinatário agora contendo os embriões e os compostos com tampas, misture delicadamente as placas rodando suavemente, e colocá-los em uma incubadora de 28,5 ° C. </li><li> Cubra cada prato de origem que contém pequenas moléculas não utilizados (0,5 mM), com uma fita de vedação de alumínio e coloque em um freezer -80 ° C para armazenamento de longo prazo. </li></ol> 4) Triagem para efeitos de pequenas moléculas por Inspeção Visual de fenótipos <ol><li> Antes de executar a tela, formular um critério específico para o que constituiria um &quot;hit&quot;. </li><li> Às vezes desejado em desenvolvimento, remover as placas de 96 poços contendo compostos tratados com embriões de incubadora e analisar cada um bem sob um estereomicroscópio. Para melhor visualização de mudanças sutis, tais como mudanças no padrão circulatório, um microscópio de contraste de fase invertido pode ser usado. Microscopia fluorescente pode ser usado para examinar perturbação da expressão de GFP ou proteínas DsRed sob um promotor de tecidos específicos. </li><li> Digitalizar rapidamente as placas de 96 poços para qualquer bem em que pelo menos 3 de 5 embriões apresentam o prescrito &quot;hit&quot; fenótipo. Registo da identidade da placa ea localização de cada bem hit em potencial. </li><li> Reconfirmar um hit em potencial por novos testes dos efeitos do composto em diversas doses (1 uM, 5 uM, 10 mM e 50 mM). Para cada dose, 10 embriões são testados em 0,5 mL de mídia E3 em um formato de placa 48 poços. O momento da adição de compostos de um novo ensaio deve ser idêntica à do exame original. Um hit é confirmado quando o fenótipo é reproduzido em provocou a reavaliação do compound </li><li> Identificar o composto hit do banco de dados de pequenas moléculas na biblioteca química. </li></ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ao planejar uma tela químicos baseados em zebrafish, atenção especial deve ser dada a robustez do fenótipo em questão e da taxa de fundo de fenótipo tal. Isto é particularmente importante para as telas de supressores químicos de um fenótipo induzido. Por exemplo, para um fenótipo causado por choque térmico a indução de um transgene, a condição que induz o fenótipo reproducibly deve ser precisamente traçada antes de iniciar a tela para evitar inaceitavelmente elevado as taxas de falsos positivos. Com um planejamento cuid...

<ol><li> Mínimo de 20 pares de peixe-zebra adulto do genótipo desejado. </li><li> Redes de peixes, tanques de criação, com recipiente interno removível e divisores (Habitats Aquáticos). </li><li> Placas de Petri (10 cm). </li><li> Coador de chá de plástico. </li><li> Lavar garrafa de água embrião containg. </li><li> Pipetas de transferência descartável de polietileno. </li><li> Poliestireno de 96 poços de fundo redondo de placas de ensaio (Corning COSTAR; Lowell, MA). </li><li> Pasteur de vidro pipeta (Fisher Scientific). </li><li> Manual da bomba de pipeta, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ). </li><li> Médio embrião E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, contendo 0,003% PTU (feniltio-carbamida, Sigma, St. Louis, MO). PTU pode ser preparado como uma solução 10x dissolvendo 0,3 g-PTU em 1 L de mídia embrião E3. Soluções contendo PTU deve ser protegido da luz, cobrindo com papel alumínio. </li><li> 12 canais pipetas, 20-20 mL (Eppendorf). </li><li> 12 canais pipetas, 300-300 mL (Eppendorf). </li><li> Descartáveis ​​de poliestireno pipeta bacia, 50 mL (Fisher Scientific). </li><li> Biblioteca pequena molécula de compostos estruturalmente diversos, dispostos em um formato de 96 wll menos 10 ações mM em DMSO. Cada prato principal é aliquotado em placas de 96 poços de armazenamento de polipropileno (Corning), e armazenadas a -80 ° C até o uso. </li><li> Vedação de alumínio fita para placas de 96 poços (Nunc, Rochester, NY). </li><li> DMSO (Sigma, St. Louis, MO). </li><li> Básicos incubadora, 28,5 ° C (Fisher Scientific). </li><li> Estereomicroscópio com base de luz transmitida (Leica Microsystems, Bannockburn, IL). </li></ol>

grande escala zebrafish-based in vivo tela pequena molécula

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Dado o seu tamanho pequeno embrião, o rápido desenvolvimento, a transparência, a fecundidade, e numerosas semelhanças moleculares, morfológicas e fisiológicas para os mamíferos, peixe-zebra tem emergido como uma poderosa<em&gt; In vivo</em&gt; Plataforma para telas baseadas em fenótipo de drogas e análise química genética. Aqui, nós demonstramos um método simples e prática em larga escala de triagem de pequenas moléculas usando embriões zebrafish.

Peixe-zebra tem emergido como uma poderosa<em&gt; In vivo</em&gt; Plataforma para telas baseadas em fenótipo de drogas e análise química genética. Aqui, nós demonstramos um método simples e prática em larga escala de triagem de pequenas moléculas usando embriões zebrafish.

Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

Devido ao pequeno tamanho de seus embriões, ao desenvolvimento rápido, à transparência, à fecundidade e a inúmeras semelhanças moleculares, morfológicas e fisiológicas com...

O objetivo geral do seguinte experimento é descobrir moléculas pequenas que modulam especificamente aspectos-chave do desenvolvimento embrionário e da fisiologia. Isso é alcançado colocando um grande número de ovos fertilizados em placas de triagem de 96 poços como segundo passo. Aliquotas de uma biblioteca de moléculas pequenas são adicionadas aos poços das placas de 96, seguidos pelos embriões no 96.As placas de poços são examinadas quanto a fenótipos induzidos pelas moléculas pequenas. São obtidos resultados que mostram quais moléculas pequenas afetam especificamente o desenvolvimento ou a fisiologia do super peixe. Olá, meu nome é Charles Hong na Escola de Medicina da Universidade de Vanderbilt.Em nosso laboratório, realizamos triagens químicas de alto rendimento utilizando embriões de peixe-zebra. Esta é uma técnica relativamente simples que pode ser amplamente adaptada para descobrir novos compostos bioativos. Na tarde anterior ao dia da triagem química, prepare de 10 a 20 tanques de reprodução de peixe-zebra.Coloque um divisor em cada tanque e encha cada tanque com água do sistema de aquicultura, utilizando uma rede de peixes para transferir um macho adulto e uma a duas fême

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Relata-se o desenvolvimento de um sistema automatizado para geração de imagens e análise de zebrafish embriões transgênicos em placas de vários poços. Isso demonstra a capacidade de medir os efeitos dose-dependente de uma pequena molécula, BCI, na expressão do gene Fator de Crescimento de Fibroblastos repórter e fornecer tecnologia para o estabelecimento de high-throughput telas química zebrafish.

Desenvolvimento de imagem automatizada e análise química para as telas de zebrafish.

Neste artigo, embriões de peixe-zebra são usados para triagem de toxicidade química. A toxicidade química está correlacionada com as leituras de fenótipo. O protocolo de amostra mostra uma abordagem metodológica para a realização da triagem de toxicidade química.

Triagem de toxicidade química baseada em embriões: avaliando os efeitos no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Este artigo descreve o vídeo elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida com sucesso para infectar e analisar um grande número de embriões de peixes-zebra proporcionando uma nova ferramenta poderosa para o teste e composto de descoberta de medicamentos usando um animal vertebrado organismo inteiro.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

O peixe-zebra é um excelente organismo experimental para estudar os processos de desenvolvimento de vertebrados e modelo da doença humana. Aqui, nós descrevemos um protocolo sobre como executar uma tela química Manual de alto rendimento em embriões de peixe-zebra com um todo-mount hibridização in situ (desejo) de leitura.

Um manual de tela pequena molécula Aproximando de alta capacidade Usando embriões Zebrafish

O peixe-zebra é um excelente sistema modelo para estudos genéticos e de desenvolvimento. O implante de contas é uma técnica valiosa de manipulação de tecidos que pode ser usada para interrogar os mecanismos de desenvolvimento, introduzindo alterações nos ambientes celulares locais. Este protocolo descreve como realizar a implantação de microesferas no embrião de peixe-zebra.

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Embriões de zebrafish são utilizados para avaliar a toxicidade de compostos químicos. Desenvolvem-se externamente e são sensíveis aos produtos químicos, permitindo a deteção de mudanças fenotípicas sutis. O experimento requer apenas uma pequena quantidade de composto, que é diretamente adicionado à placa contendo embriões, tornando o sistema de teste eficiente e rentável.

Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish

Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.

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RASopatias são síndromes genéticas multissistêmicas causadas pela hiperativação da via RAS-MAPK. Variantes potencialmente patogênicas que aguardam validação surgem continuamente, enquanto evidências pré-clínicas fracas limitam a terapia. Aqui, descrevemos nosso protocolo in vivo para testar e validar os níveis de ativação de ERK associados à RASopatia e sua modulação farmacológica durante a embriogênese por imagens FRET ao vivo em peixe-zebra Teen-reporter.

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Aprenda a realizar triagem em larga escala de pequenas moléculas usando embriões de zebrafish. Este método permite identificar compostos bioativos que modulam o desenvolvimento embrionário e a fisiologia in vivo.

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