Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação
17 de setembro de 2010
Este protocolo descreve um método não-viral de entrega de construções genéticas para uma determinada área do cérebro de roedores vivos. O método consiste na preparação de plasmídios, fabricação micropipeta, a cirurgia de rato neonatal filhote, microinjeção da construção, e In vivo Eletroporação.
Olá, sou RI Ov. E eu sou Alexia Ying. Somos estudantes de pós-graduação da Cent University. Neste vídeo, apresentaremos um método de eletroporação in vivo para entrega de um gene alvo a uma área específica de um tecido cerebral em desenvolvimento.
Então vamos ver. Vamos ver. O método de eletroporação in vivo oferece uma maneira rápida e eficiente de entregar genes de interesse ou RNA de interferência pequeno a tecido cerebral vivo.
Oferece uma alternativa de baixo custo à criação de animais transgênicos e ao método de entrega viral de genes. Neste vídeo, demonstraremos um procedimento detalhado de entrega gênica pós-natal ao córtex rad neonatal. Utilizaremos o plasmídeo que codifica a proteína verde fluorescente melhorada e o promotor da beta actina de frango com um potenciador CMV.
Realizamos todas as manipulações cirúrgicas dentro de uma cabine de fluxo laminar para manter a esterilidade e minimizar o risco de contaminação bacteriana ou fúngica do animal. Para a entrega de plasmídeo à córtex, utilizamos um microinjetor WPI com controlador eletrônico e uma seringa Hamilton de 10 microlitros acoplada a um manipulador estereotáxico. O filhote vermelho é anestesiado utilizando uma unidade de anestesia composta por uma caixa e uma máscara.
O filhote é então fixado utilizando barras auriculares na mesa aquecida acoplada ao manipulador estereotáxico. Para a manipulação cirúrgica e monitoramento da microinjeção, utilizamos um microscópio binocular. Para a eletroporação, utilizamos o eletrooperador CYV 21 in vivo com eletrodos em formato de pinça.
Para a recuperação dos filhotes. Após a anestesia, utiliza-se uma câmara aquecida. Geralmente, preparamos 10 microlitros da solução de injeção do plasmídeo em um tubo de parede fina de 200 microlitros. Esta solução é suficiente para vários experimentos.
Misturamos oito microlitros da solução de plasmídeo com um microlitro do 10 XPBS e um microlitro da solução aquosa a 0,1% de verde rápido. A concentração final do plasmídeo na solução de injeção deve estar entre um e três microgramas por microlitro. O uso de concentrações mais baixas do DNA plasmidial reduzirá a eficiência de transfeção, enquanto concentrações mais altas de DNA serão muito viscosas para injeção através da ponta fina da capilar de vidro.
Para a preparação da pipeta de vidro, utilizamos capilares de vidro de borossilicato com filamento e o puxador vertical de eletrodos de vidro nos parâmetros máximos de puxamento e aquecimento. Em seguida, quebramos a ponta da pipeta usando um pedaço de papel para obter uma ponta com diâmetro entre 10 e 20 micrômetros. Verificamos a ponta, o diâmetro e a forma sob o objetivo do microscópio.
Usando um capilar fino de polímero, preenchemos aproximadamente um terço do volume de uma seringa Hamilton de 10 microlitros. Com óleo mineral, certificamo-nos de evitar bolhas de ar. Em seguida, preenchemos a pipeta de vidro com óleo mineral e inserimos a pipeta na seringa Hamilton.
Novamente, evitando bolhas de ar. A seringa com pipeta de vidro é então fixada em um microinjetor conectado a um controlador. O conjunto de microinjeção fixado em um instrumento estereotáxico permite imergir com segurança a ponta da pipeta de vidro no tubo contendo uma solução de injeção de plasmídeo.
Quando a ponta toca a superfície da solução, mergulhamos mais um a dois milímetros. Em seguida, utilizamos o controlador do microinjetor para encher a pipeta com aproximadamente um microlitro da mistura de injeção. Todos os experimentos apresentados aqui são realizados de acordo com as regulamentações da Universidade de Helsinque para experimentos com animais.
Para cada experimento, preenchemos uma seringa estéril com isoflurano. Fixamos a seringa na unidade de anestesia conectada à fonte de fluxo de ar, ao animal em movimento e à máscara fixada no conjunto estereotáxico. Na unidade de anestesia, ajustamos o fluxo de ar para aproximadamente 250 mililitros por minuto e o nível de isoflurano para 4%. Colocamos o animal na caixa com fluxo vermelho por dois a cinco minutos.
Quando o P para de se mover, colocamo-lo sobre a placa aquecida acoplada ao conjunto estereotáxico. Posicionamos a parte rostral da cabeça do P na máscara. Normalmente, leva de cinco a dez minutos para que a cria entre em anestesia profunda.
Quando isso for alcançado, reduzimos o isoflurano no fluxo para aproximadamente 1,5 a 2%. Tratamos a pele na cabeça da cria com etanol 70% utilizando pequenos bisturis e pinças finas. Cortamos a pele da nuca da cria até a testa, dobramos as laterais das bordas da pele e puxamos levemente as hastes auriculares para dentro das aberturas orais do crânio para fixação da cabeça e da pele. Utilizando um microscópio binocular, localizamos o ponto bregmático no crânio para identificar a região de interesse com base nas coordenadas estereotáxicas, posicionamos a pipeta de injeção acima dessa região e a marcamos ao depositar de 25 a 50 nanolitros da solução injetável sobre a superfície do crânio.
Fazemos uma perfuração suave e cuidadosa no crânio no ponto marcado, utilizando uma broca cirúrgica de alta velocidade sob o microscópio, até que um líquido apareça na área perfurada. Fixamos as pinças de eletroporação, com eletrodos nos lados do crânio. Aplicamos um gel condutor para obter melhor condutividade.
Removemos a gota de líquido da área perfurada usando um pequeno tampão e mergulhamos a agulha de vidro no orifício. De acordo com as coordenadas do local de injeção, infundimos de 25 a cem nanolitros da solução injetável à taxa de cinco a 20 nanolitros por segundo. Em seguida, removemos rapidamente a pipeta e prosseguimos imediatamente com a eletroporação.
A eletroporação é realizada aplicando cinco pulsos com duração de 50 milissegundos, amplitude de pulso de 99 volts e frequência de um hertz. Removemos os eletrodos e as barras auriculares. Suturamos a pele cortada utilizando uma combinação de pinças rombas e pontiagudas e os fios cirúrgicos.
Colocamos a ninhada em uma câmara aquecida por 15 a 30 minutos para auxiliar sua recuperação após a anestesia. Em seguida, devolvemos a ninhada à gaiola da mãe. A expressão do transgene nas células transfectadas com sucesso aparecerá cerca de 10 horas após a eletroporação e permanecerá estável por várias semanas.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos. Tchau.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método não viral para entregar construtos genéticos a áreas específicas do cérebro de roedores vivos utilizando eletroporação in vivo. O método é eficiente e permite a entrega rápida de genes ao tecido cerebral.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Entrega Gênica
- Técnicas de Eletroporação
Antecedentes
- A entrega de genes ao cérebro é essencial para o estudo da função gênica.
- Os métodos tradicionais podem ser invasivos e menos eficientes.
- A eletroporação in vivo oferece uma alternativa não viral.
- Este método pode direcionar regiões cerebrais específicas de forma eficaz.
Objetivo do Estudo
- Apresentar um método não viral para entrega de genes no cérebro de roedores.
- Demonstrar a eficiência da eletroporação in vivo.
- Facilitar pesquisas sobre função gênica e estudos neurológicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de plasmídeos para entrega gênica.
- Fabricação de micropipetas para microinjeção.
- Cirurgia em filhotes de ratos neonatos para entrega direcionada.
- Aplicação de eletroporação in vivo para aumentar a captação gênica.
Resultados Principais
- Entrega bem-sucedida de construtos genéticos para áreas cerebrais específicas.
- Eficiência comprovada do método de eletroporação.
- Aplicações potenciais em terapia gênica e pesquisa em neurociência.
- Invasividade reduzida em comparação com métodos tradicionais.
Conclusões
- O método não viral é eficaz para a entrega de genes in vivo.
- A eletroporação in vivo é uma técnica promissora para a pesquisa em neurociência.
- Essa abordagem pode aprimorar estudos sobre a função gênica no cérebro.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A entrega direcionada de genes em tecido cerebral pós-natal permite a investigação funcional de circuitos neuronais sem compensação durante o desenvolvimento, apoiando a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos. Essa abordagem não viral oferece uma alternativa econômica e escalonável aos modelos transgênicos para fluxos de trabalho de descoberta precoce. Ela facilita a avaliação rápida da função gênica em sistemas relevantes para doenças, melhorando a confiança preditiva na identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite o controle espacial e temporal da expressão gênica para investigar hipóteses terapêuticas no cérebro pós-natal.
- Valor Operacional: Oferece um método rápido e de baixo custo para validação funcional de alvos sem modificação da linhagem germinativa.
- Valor Preditivo: Reduz a ambiguidade mecanicista ao limitar a transfeção a regiões cerebrais definidas, apoiando a triagem de portfólios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera eficiência de transfeção quantitativamente avaliável por meio da expressão de repórter fluorescente em fatias cerebrais agudas.
- Valor Operacional: Padroniza parâmetros de entrega (tensão, duração do pulso, volume) para leituras eletrofisiológicas ou de imagem reprodutíveis.
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em culturas neuronais ou preparações de fatias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia modelos de doenças pós-natais em que a letalidade durante o desenvolvimento confunde estudos com eliminação constitutiva de genes.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a modulação gênica dependente de dose para avaliar o engajamento do alvo e a modulação da via.
- Alinhamento Pré-clínico: Possibilita a utilização de imagem por dois fótons e eletrofisiologia para correlacionar a modulação do alvo com fenótipos funcionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método conecta a descoberta inicial (teste de hipótese do alvo) e a validação pré-clínica ao permitir a modulação gênica específica de regiões em sistemas cerebrais pós-natais relevantes para a doença.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação baseada em hipóteses da função gênica em circuitos neurais definidos, sem interferentes do desenvolvimento.
- Triagem: Permite avaliação padronizada e quantitativa da expressão de transgênico para validação do efeito de compostos em fatias cerebrais.
- Análises: Fornece leituras fluorescentes e eletrofisiológicas para quantificar modulação do alvo e atividade da via.
- Pesquisa Translacional: Conecta intervenção molecular a desfechos funcionais em preparações agudas de fatias, apoiando avaliação fenotípica alinhada a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para validação iterativa de alvos em múltiplas indicações neurológicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao permitir entrega gênica com precisão espacial e temporal no cérebro pós-natal.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de parâmetros padronizados de eletroporação e fluxo cirúrgico estéril.
- Valor Estratégico: Reduz a dependência de modelos transgênicos demorados, acelerando decisões de avanço ou interrupção na validação de alvos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao esclarecer o mecanismo do alvo em contextos neuronais relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia de roedores neonatos, coordenação estereotáxica e técnicas microcirúrgicas.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo microinjetores, eletroporadores com eletrodos moldados e microscópios binoculares.
- Necessita padronização da concentração do plasmídeo, volume de injeção e parâmetros de pulso entre operadores e locais.
- A adaptação a outras regiões cerebrais ou idades pós-natais exige otimização empírica das coordenadas e parâmetros de entrega.
- Limitações práticas incluem eficiência variável de transfeção conforme a qualidade da ponta da pipeta e a integridade do tecido durante a cirurgia.
