Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar as informações métricas e estruturais da stoia sobre a proteína. Todos os complexos ligamentares que expressam células biológicas vivas, as células de levedura são geneticamente modificadas para expressar as proteínas de interesse ligadas a um doador ou a uma sonda fluorescente aceitadora. As sondas doadoras podem ser excitadas diretamente por um laser.

Embora os aceitadores só possam ser excitados por meio de uma transferência de energia de um doador excitado próximo, as células são expostas à luz de um laser infravermelho próximo pulsado. A inseminação fluorescente das sondas é separada em seus componentes espectrais por uma grade de transmissão e projetada na superfície de uma matriz CCD multiplicadora de elétrons. Portanto, espectros fluorescentes completos de indivíduos, todos os ligamentos são obtidos para cada posição na amostra.

O perfil espectral da fluorescência detectada depende da interação específica das proteínas de interesse. Os dados são analisados para determinar para cada pixel de imagem de uma célula de varredura, as emissões separadas das sondas doadora e aceitadora. A eficiência da transferência de energia é determinada em cada pixel da imagem e, em seguida, os pixels são dobrados de acordo com a eficiência do traste e o histograma.

A interpretação do histograma permite a determinação in vivo da proteína, tamanho e configuração do complexo. Olá, meu nome é Michael Stoneman, do Grupo de Pesquisa Riku da Universidade de Wisconsin Milwaukee. Meu nome é Singh.

Eu sou do Rikus Lab em Wisconsin, Milwaukee. A principal vantagem desta técnica é que os perfis de emissão completos de centenas de todos os complexos ligamentares dentro de uma célula são obtidos com uma varredura completa da célula. Normalmente, a maioria dos métodos de microscopia de fluorescência exige que a célula de interesse seja escaneada várias vezes para acumular informações espectrais suficientes para determinar a eficiência do traste em várias regiões de interesse dentro da célula.

No entanto, as reações bioquímicas de difusão podem alterar a composição molecular dessas regiões de interesse e, assim, limitar as informações obtidas na varredura da imagem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo da proteína, interação proteica em células vivas, como qual é o tamanho dos oligômeros dano? Em que estágio do ciclo de vida da proteína os oligômeros cultivam e qual é o papel do oligômero dessa proteína na função celular?

Os dois fotomicroscópios resolvidos espectralmente, acumulam informações espectrais sobre os complexos de olima na célula de imagem, digitalizando o foco do feixe de excitação na amostra de interesse em vários locais. Um par de espelhos de varredura ortogonais é usado para traduzir o foco do feixe de laser através da amostra em duas direções diferentes. O movimento dos espelhos de varredura é controlado por computador e sincronizado com a extração de dados de intensidade de fluorescência da câmera CCD da varredura de linha, os mapas espaciais de intensidade de fluorescência correspondentes a um determinado comprimento de onda de luz podem ser reconstruídos.

Para reconstruir com precisão os mapas espaciais de intensidade fluorescente de raios X e calcular o comprimento de onda real correspondente a cada um desses mapas, o protocolo de varredura de linha deve ser calibrado usando solução de fluoresceína. Para iniciar o procedimento de calibração, envie para o espectro de excitação em um comprimento de onda de 800 nanômetros, que é duas vezes o comprimento de onda máximo de excitação da etiqueta doadora GFP dois dois para enviar para o espectro de excitação, traduza o prisma localizado dentro da cavidade do laser para modificar a dispersão da velocidade do grupo usando o programa de computador ao qual a câmera está conectada. Envie um comando para o chip CCD para diminuir a temperatura do chip CCD para a temperatura mais baixa atingível.

A fim de reduzir o ruído escuro. Pipete 10 microlitros de solução de fluoresceína em uma tampa de lâmina de microscópio com uma lamínula de cobertura para que uma fina camada da amostra seja uniformemente dispersa na região entre a lamínula e a lâmina do microscópio, coloque uma pequena gota de óleo de imersão na superfície da lamínula. Agora prenda o microscópio, deslize para o estágio de translação XY, Z e traduza a lâmina e o estágio na direção do eixo óptico Ajustando manualmente o atuador linear, traduza a lâmina até que a objetiva do microscópio entre em contato com a gota de óleo de imersão, mude a câmera para um modo de vídeo de aquisição de dados para que a luz admitida que atinge a matriz CCD seja exibida na tela do computador em tempo real.

Desligue todas as luzes ambiente da sala para diminuir o ruído de fundo detectado na matriz CCD. Ajuste lentamente o micrômetro que controla o estágio de translação na direção do eixo óptico para trazer a amostra para o ponto focal do feixe de laser. Quando a amostra de fluoresceína estiver em foco, a emissão aparecerá como uma linha nítida na matriz CCD.

Baixe a leitura das intensidades de pixel da matriz CCD para o computador. Meça a intensidade do pixel em função da posição na matriz CCD abrindo a matriz baixada de valores de intensidade na imagem J e desenhando uma linha através da região fluorescente. Use o comando image day.

Analise o perfil do gráfico para criar um gráfico que ilustre o espectro de emissão da amostra de fluoresceína. Ajuste o parâmetro incremental do espelho, que controla o movimento do laser. Foco na direção Y, de modo que as posições y adjacentes dentro da amostra resultem no movimento do pico dos espectros fluorescentes em exatamente um pixel ao longo da dimensão espectral na matriz CCD.

Para monitorar isso, baixe a intensidade do espectro de fluoresceína para duas posições Y diferentes na amostra. Em seguida, abra as imagens de intensidade com a imagem J e encontre a posição do pixel de pico para cada um dos espectros fluorescentes. Usando o cursor J da imagem, deixando o obturador do CCD aberto, escaneie o foco do laser na amostra na direção X.

A luz emitida por cada voxel ao longo da linha da varredura deve incidir sobre a matriz CCD no final de cada varredura de linha, armazenar os dados da matriz CCD obtidos para esta varredura de linha e, em seguida, limpar os pixels da matriz CCD. Mova a posição do laser. Foque na direção Y pelo valor determinado anteriormente.

Em seguida, escaneie o feixe de laser na direção X através da amostra. Mais uma vez, deixando aberto o obturador do CCD armazenar os dados. Repita este procedimento de varredura de linha até que uma área física cerca de 50% maior que as dimensões de uma única célula biológica tenha sido iluminada por luz laser.

A relação entre o número de linhas de uma imagem de varredura de linha específica e o comprimento de onda deve ser usada para reconstruir as imagens para obter vários mapas faciais de intensidades fluorescentes de ex-esposa em diferentes comprimentos de onda. Para obter a imagem de envio fluorescente da ex-esposa para um determinado comprimento de onda, encontre o número da linha na imagem obtida na varredura da primeira linha que corresponde a esse comprimento de onda. Em seguida, a linha adjacente da imagem de varredura de linha subsequente corresponde à próxima linha da imagem de emissão fluorescente.

Para esse comprimento de onda específico, empilhe todas as linhas de imagens que correspondem a esse comprimento de onda para obter os mapas espaciais de intensidade fluorescente XY da amostra nesse comprimento de onda. Repita este procedimento para todos os outros comprimentos de onda obtidos para coletar dados sobre suas amostras. Primeiro, remova da incubadora as placas com colônias de leveduras transformadas.

Deve haver pelo menos três tipos de células transformadas. Células que expressam as proteínas de interesse marcadas com ambos os tipos de sondas fluorescentes. Células que expressam apenas proteínas marcadas com as sondas fluorescentes do dador e células que expressam apenas proteínas marcadas com as sondas fluorescentes aceptoras.

Adicione 100 microlitros de cloreto de potássio 100 milimolar a um tubo de microcentrífuga. Em seguida, usando uma ponta de micropipeta, raspe de três a cinco colônias de levedura da placa de células que expressam proteínas marcadas com o doador e exceto uma sonda fluorescente e inocule o cloreto de potássio 100 milimolar. Com essas células, remova 10 microlitros da suspensão celular e dispense-a em um novo microscópio. Deslizar.

Cubra a gota com uma lamínula e coloque uma gota de óleo na superfície da lamínula. Em seguida, feche manualmente o obturador no caminho do feixe de laser para impedir que a luz do laser atinja a objetiva do microscópio. Prenda a lâmina do microscópio ao estágio de translação XY, Z e translade o estágio da lâmina na direção do eixo óptico até que a objetiva do microscópio entre em contato com a gota de óleo de imersão.

Agora ligue a iluminação da luz de campo amplo e vá para a câmera. Modo de vídeo de coleta de dados. A imagem de campo amplo da amostra ficará severamente borrada devido à presença da grade de transmissão no caminho de emissão.

Portanto, coloque um filtro passa-banda com uma pequena largura total na metade máxima no caminho óptico que precede a grade de transmissão. Traduza lentamente o estágio de translação na direção do eixo óptico enquanto visualiza a imagem das células na tela da câmera até que as células sejam focadas. Traduza o estágio na direção X ou Y para trazer uma única célula para o local do foco do feixe de laser.

Desligue a fonte de iluminação de campo amplo e remova o filtro de caminho de banda do caminho de emissão. Desbloqueie o feixe de laser por um curto período de tempo enquanto simultaneamente visualiza o sinal recebido na matriz CCD. Se um sinal fluorescente for detectado na matriz CCD durante o tempo em que o feixe de laser incidir sobre a célula, execute uma varredura completa de aquisição de dados fluorescentes dessa célula.

É vital usar os mesmos parâmetros de varredura, especificamente o número de linhas e o incremento conforme determinado no procedimento de calibração demonstrado anteriormente. Repita o processo de localização celular e aquisição de dados de fluorescência para um grande número de células que expressam proteínas ligadas a etiquetas de doadores e aceitadoras. Depois de acumular imagens de fluorescência suficientes de células que expressam proteínas marcadas com ambos os receptores, repita todo o processo para ambas as células que expressam apenas proteínas marcadas com as sondas fluorescentes doadoras e células que expressam apenas proteínas marcadas com as sondas fluorescentes aceitadoras.

Finalmente, reconstrua todas as varreduras para obter resolução espectral. Os mapas espaciais de intensidade fluorescente XY para cada conjunto de dados usando o procedimento descrito anteriormente ilustrado nessas três figuras são os mapas espaciais resultantes calculados a partir de duas medições de microscopia de fótons espectralmente resolvidas realizadas em uma célula de levedura expressando o receptor estéril para o fator alfa. Mapas bidimensionais de sinais doadores e aceptores foram obtidos a partir da análise dos perfis de emissão espectral obtidos de cada local da célula.

As intensidades de fluorescência são atribuídas a cores falsas de acordo com seus valores, e a escala é mostrada como uma inserção. Um mapa bidimensional das eficiências aparentes do traste foi então calculado usando as imagens KDA e KAD usando os valores extraídos do mapa de eficiências aparentes do traste da célula que acabamos de mostrar, um gráfico de histograma foi preparado. Os valores EAPP medidos da célula são representados por círculos.

A linha sólida vermelha representa o melhor ajuste aos dados medidos usando a soma das funções individuais de cálcio representadas por linhas verdes sólidas. A análise do histograma, que é descrito no texto do protocolo, confirma que o complexo ligamentar estéril de dois fatores alfa assume a forma de um tetrâmero em forma de RBA in vivo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 12 horas se executada corretamente.

Ao fazer este experimento, é importante manter o poder da fonte de excitação baixo. É importante evitar a excitação múltipla do doador por um único pulso.