Name: Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Aprenda a preparar culturas primárias de neurônios a partir de embriões de Drosophila em estágio de gástrula média. Este método permite estudar a excitabilidade elétrica e a transmissão sináptica em neurônios.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH para conceder NS27501 DKOD. Suporte adicional para este trabalho a partir de uma HHMI Professor Grant para DKOD.

I. de colheita de embriões Drosophila <ol><li> Prepare pratos de coleta de ovos <ol><li> Ferva 200 ml dH 2 O com 8 g de agar </li><li> Arrefecer a 50 ° C </li><li> Adicionar 2 ml EtOH e 2 ml de ácido acético </li><li> Despeje em 35 milímetros petri pratos de plástico, tops </li><li> Esfriar e guarde em recipiente apertado do ar a 4 ° C </li><li> Faz cerca de 80 placas </li></ol></li><li> Prepare colar Yeast <ol><li> Dissolver o fermento Fleishmans ativa fermento em água para formar colar </li><li> Microondas por 20-30 segundos para matar levedura (atente para ferver mais) </li><li> Loja em seringa de 10 cc (sem agulha) a 4 ° C por 2 semanas </li></ol></li><li> Moscas: Os adultos utilizados para a coleta de ovos são geralmente mais produtiva entre 3 e 14 dias depois de sair, desde que tenham tido acesso a alimentos frescos. Muitas ações têm mutante diminuição da fertilidade, que pode se manifestar de uma taxa reduzida de postura de ovos e uma mudança na idade em que eles são mais produtivos. Geralmente, várias centenas de adultos fazem para uma população postura boa. </li><li> Procedimento: Espalhe uma camada fina de pasta de levedura em uma placa de coleta de ovos. Isto fornece um substrato favorável para a postura dos ovos. Adulto transferência voa para uma garrafa limpa ovo recolha e tape o prato de coleta para a boca da garrafa. Não deixe as moscas nessas garrafas mais do que 3-4 horas como a umidade aumenta e as moscas ficam presas na pasta e nas laterais do frasco. </li></ol> II. Dechorionation embrião com Bleach <ol><li> Criar um funil de Buchner ligado a um frasco de filtro ligado a um aspirador. Coloque um pedaço de papel Whatman # 1 no funil. Com sucção em execução, molhe o papel com água destilada estéril. </li><li> Enxágüe embriões a partir de chapas para a coleta de papel de filtro com uma corrente de água de uma garrafa de lavagem. </li><li> Lave-os em vários volumes de água estéril, desligue aspirador, em seguida, adicionar um volume funil de água sanitária a 50%. Deixe os ovos sentar 5-10 minutos. O córions será dissolvido em 1-2 minutos, mas quanto mais tempo você deixar os embriões no bleach mais da levedura contaminante será destruída. Escolher os adultos e as larvas que têm lavado prato. </li><li> Enxágüe os embriões em uma placa de Petri estéreis (NÃO cultura de tecidos) com água destilada estéril. Muitos dos embriões grude no fundo do prato, se não tiver sido pré-molhada. Enxaguar várias vezes com água estéril neste prato. </li><li> Examine os embriões com luz transmitida para escolher embriões meados de gástrula palco. </li></ol> III. Preparação de culturas único embrião <ol><li> Faça DDM1 (ver receitas na seção IV) </li><li> Derramar água fora prato de embriões pouco antes de cultivo. Cobrir embriões com meios estéreis. </li><li> Conjunto com 3, 35 pratos de petri milímetros. Coloque em 4 autoclavado lamínulas redondas em cada prato. Em cada lamela, colocar 5 mL de meio. Use Bellco lamínulas de baixa coverlips vidro de chumbo. Bellco Biológica Copos 800-257-7043 Cat # 1943-00012 </li><li> Puxar alguns pipetas razoavelmente bem. O pipetas que usamos são puxados em um extrator Narishige PP-83. As dimensões exatas da pipeta não são cruciais e que geralmente puxá-los mais finos do que queremos e eles quebram a ponta no mesmo campo de visão como o embrião para medir o tamanho. Você não quer para sugar todos os embriões de uma só vez, e seu não quer a ponta tão pequena que leva 5 minutos para sugar as células. Apontar para algures no meio. Examine os embriões com luz transmitida e usar um tubo de sucção da boca ligado ao pipeta para remover o conteúdo do embrião. Dispersar as células para a lamínula cuidadosamente preparado por expelir as células tão perto da lamela possível. Você pode querer examinar as lamelas com maior poder e mais dispersar as células da mesma maneira. </li><li> Permitir que as células sentar-se por não mais que 10 minutos. Flood o prato com a mídia e colocar em incubadora, de 4-5% CO 2 ambiente, se estiver usando meio definido. Temperatura entre 22-24 ° C. Rotineiramente use 23 ° C e umidade de 95%. Umidade é importante, como você quiser evitar a evaporação. Você pode usar uma incubadora de padrão de mamíferos colocado em uma das câmaras frias com controle de temperatura definida para 23 ° C. </li></ol> IV. DDM1 meio definido para o cultivo das culturas <ol><li> Faça DMEM: Para 100 mls de F12/DME Ham Media (DMEM) (Irvine Scientific # 9052). <ol><li> Adicionar 0,476 g Hepes (20mM) (Sigma # H-3375). Mix. </li><li> Adicionar 1,25 ml L-Glutamina 200 mM (Irvine Scientific # 9317). Mix. </li><li> Filtro na capa com 0,2 m de acetato de seringa filtro (precisa de 2 filtros). </li><li> O pH é 6,64 e Osm 288. </li><li> Faça alíquotas de 10ml em tubos de centrífuga de 15ml. </li><li> Armazenar a 4 ° C por não mais de 2 semanas. Nota: Utilize sempre água filtrada e fazer autoclavado em recipientes que são reservados para Mídia e suplementos apenas. Nunca coloque um eletrodo de pH ou agitar bar utilizado para outros fins em Media.To fazer DDM1: suplementos Adicionar listados abaixopara DMEM pouco antes de cultivo. </li></ol></li><li> A 10 ml de DMEM acrescentar: <ul><li> 100 mL Transferrina </li><li> 100 mL Putrescine </li><li> 100 mL Selenium </li><li> 100 mL de progesterona </li><li> 50 mL de insulina </li></ul></li></ol>

<ol><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic-AMP-dependent+plasticity+at+excitatory+cholinergic+synapses+in+Drosophila+neurons%3A+Alterations+in+the+memory+mutant+dunce%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce.</a> J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).</li>
<li>Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tipE+regulates+sodium-dependent+repetitive+firing+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).</li>
<li>Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+receptors+containing+Rdl+subunits+mediate+fast+inhibitory+synaptic+transmission+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).</li>
</ol>

Em culturas de Drosophila preparados a partir de embriões em estágio midgastrula os neurônios surgem a partir de precursores neuroblastos, muitos dos quais divide antes de diferenciação in vitro. Este sistema, portanto, proporciona uma oportunidade única para a exploração de fatores genéticos e ambientais importantes em fases muito iniciais de desenvolvimento neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Nós temos mostrado que os neurônios cultivados em um meio simples definida diferenciar em neurônios eletricamente excitáveis ​​que também forma funci...

As culturas feitas neste mídia deve ser mantida em uma incubadora de 5% CO2 em cerca de 22-24 ° C. Usamos um padrão de cultura de tecidos de mamíferos incubadora colocado em uma sala fria e aquecida a 23 ° C. Sempre usada água filtrada e fazer autoclavado em recipientes que são reservados para a mídia e os suplementos apenas. Nunca coloque um medidor de pH ou agitar bar utilizado para outros fins nos meios de comunicação.

preparação de culturas de neurônios a partir de embriões midgastrula stage drosophila

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Este vídeo ilustra o procedimento para a tomada de culturas primárias de neurônios a partir de embriões midgastrula estágio Drosophila. Os métodos de coleta de embriões e sua dechorionation o uso de alvejante são demonstradas. Usando uma pipeta de vidro ligado a um tubo de sucção da boca, que ilustram a remoção de todas as células de embriões individuais. O método para dispersar as células de cada embrionários em uma queda (5 l) pequenas de meio sobre uma lamela de vidro sem revestimento é demonstrada. Uma visão através do microscópio, 1 hora após o plaqueamento ilustra a densidade celular preferido. A maioria das células que sobrevivem quando cultivada em meio definido são neuroblastos que dividem uma ou mais vezes na cultura antes de estender processos neuríticas por 12-24 horas. Uma visão através do microscópio ilustra o nível de crescimento de neuritos e ramificação esperado em uma cultura saudável de dois dias in vitro. As culturas são cultivadas em um bicarbonato simples, baseada médio definido, em um 5% CO 2 incubadora a 22-24 ° C. Processos neuríticas continuar a desenvolver durante a primeira semana de cultura e quando fazem contato com neurites de células vizinhas que muitas vezes forma funcional conexões sinápticas. Neurônios nessas culturas, se manifesta de sódio voltagem dependentes, cálcio e canais de potássio e são eletricamente excitáveis. Este sistema de cultura é útil para estudar molecular fatores genéticos e ambientais que regulam a diferenciação neuronal, excitabilidade, e formação de sinapses / função.

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios a partir de embriões midgastrula estágio Drosophila. Pontos de vista de culturas vivas mostram as células de 1 hora após o plaqueamento e neurônios diferenciados após 2 dias de crescimento em um meio de bicarbonato baseado definido. Os neurônios são eletricamente excitáveis ​​e formam conexões sinápticas.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

Este vídeo ilustra o procedimento para a realização de culturas neuronais primárias a partir de embriões de Drosophila em estágio de gastrulação média. Os métodos para a coleta de embriões...

Meu nome é Diana Dowd, e sou professora do departamento de Biologia do Desenvolvimento e Células e anatomia e neurobiologia na uc Irvine. E hoje vou demonstrar o preparo de culturas neuronais primárias a partir de embriões de drosophila. O que isso envolve é, na verdade, remover todas as células de um embrião de drosophila em estágio de meio gastrula e colocá-las em cultura celular.E o que utilizamos essas culturas para é compreender realmente quais são os genes e fatores ambientais importantes para a regulação da excitabilidade elétrica e da transmissão sináptica entre neurônios de drosófila. Para iniciar este procedimento, precisamos coletar embriões de drosófila. Para isso, pegamos placas de coleta de ovos e espalhamos um pouco de pasta de levedura sobre elas.É um substrato favorável para as moscas adultas depositarem seus ovos. Colocamos essas placas sobre frascos contendo uma população de moscas adultas, geralmente de cem a 200 moscas. Em seguida, deixamos as moscas adultas depositarem seus ovos por cerca de duas a três horas.Em seguida, removemos as placas de coleta de ovos, e esses são os embriões que utilizamos para o procedimento de Cultura. O próximo passo do procedimento é desencapsular os embriões, o que significa remover efetivamente o córion. Fazemos isso lavando os embriões para dentro de um funil de Büchner sobre o qual colocamos um pedaço de papel filtro, para que este retenha os embriões.Deixamos que fiquem em repouso no funil de Büchner em uma solução de hipoclorito a 50%. Essa solução a 50% de hipoclorito dissolve não apenas o córion, mas também atua como parte do nosso procedimento de esterilização. Realizamos este procedimento fora da câmara de fluxo laminar, ou seja, fora da capela, de modo que, após a descloração, lavamos os embriões para uma placa de Petri.Na verdade, quando o Corian desaparece, a membrana viel é bastante aderente e grudará bem em uma placa de Petri. Em seguida, você pode despejar água destilada sobre eles, remover a água destilada duas ou três vezes e simplesmente jogar a água fora; os embriões permanecerão aderidos à placa de Petri. Não utilize uma placa de plástico para cultura de tecidos.Eles não aderem a isso. Iniciamos a parte estéril do procedimento pegando as placas de Petri com embriões e levando-as para uma cabine de fluxo laminar. Estas são lamínulas Bellco.Eles não são revestidos, mas foram autoclavados e não foram lavados. Verificamos que eles não funcionam muito bem. Quando são lavados, retiramos geralmente quatro lamínulas e as colocamos em uma única placa de Petri.Então, faremos quatro culturas de embriões em cada placa de Petri. Ok, essa placa está basicamente pronta para iniciarmos o cultivo, e normalmente faço 12 culturas, de 12 a 16 culturas por vez. Entendido? O meio de cultura que utilizamos é um meio definido relativamente simples.É uma base A-D-M-E-M, e preparamos este meio líquido uma vez a cada duas semanas, para que permaneça adequado por duas semanas na geladeira. Este meio foi esterilizado. Foi filtrado através de um filtro estéril de 0,2 mícron, e então adicionamos cinco suplementos ao meio.Eles são preparados uma vez a cada dois meses e depois congelados em alíquotas que são adicionadas a 10 mililitros do meio líquido. Então, simplesmente removemos o conteúdo. Por último, basta virar suavemente este meio para misturá-lo, e estamos prontos para começar. Ok.Tudo está preparado. Tenho minha placa de cultura pronta, ou minha placa de Petri com quatro lamínulas dentro, prontas para uso. Agora vou pegar minha placa com embriões, que estão em água destilada.Vou remover a água destilada apenas sacudindo-a. É assim que faço, diretamente no lixo. Agora vou despejar cerca de dois mililitros do meio sobre esses embriões, e agora eles estão prontos para que eu insira a agulha de vidro em embriões individuais e remova o conteúdo.Você precisa ter o meio no exterior. Obviamente, se houvesse água ali, ocorreria choque osmótico. Agora, para se preparar e realmente preparar os cultivos logo antes de remover o conteúdo do embrião, coloco efetivamente uma gota de cinco microlitros sobre as lamínulas.Se você deixar por muito tempo, o pH do meio muda. Ok, agora vou colocar uma gota de cinco microlitros no centro de cada uma das quatro lamínulas. É realmente importante que essas gotas permaneçam o mais intactas possível.Se o meio se espalhar por toda a lamínula, então as células são semeadas em uma camada muito fina de líquido, o que é difícil. Você deseja semear as células em uma gota redonda e bem definida de líquido. Como é possível observar ali, temos quatro gotas redondas e bem definidas de líquido prontas para uso.E agora vou pegar uma das pipetas que preparei e simplesmente a fixo neste tubo de pipeta bucal. Você pode usar qualquer tubo que desejar, mas a vantagem deste é que ele vem com pipetas graduadas de 100 microlitros da VWR. Nestas, temos uma pequena junta de borracha aqui.Posso inserir o pipetador bucal, quero dizer, a pipeta de vidro nesta extremidade do pipetador. E quando aspirar o conteúdo do embrião, não vou avançar além desta região, onde ele começa a afinar. Então, há uma grande área separando o local onde aplico a sucção com o pipetador aqui em cima e o local onde estão as células.Portanto, não há, não existe problema de contaminação. Se você acidentalmente aspirar o conteúdo para esta área, terá grandes problemas de contaminação. Em nossas câmaras de fluxo laminar, temos microscópios estereoscópicos que estão montados sobre uma base estereoscópica.Isso permite que a luz entre por baixo do embrião, o que nos permite visualizar efetivamente o sulco cefálico, o intestino médio e as imagens que você verá ao observar os embriões reais. É assim que identificamos o estágio do embrião importante para o cultivo, com o objetivo de remover o conteúdo do embrião. Utilizamos pipetas de vidro, puxadas em um puxador de microeletrodos comum, o mesmo que usamos para fabricar nossas pipetas para gravação em patch.Não nos importamos realmente com as configurações. Preparamos pipetas bem finas porque vamos quebrar a ponta da pipeta no recipiente ao lado do embrião, no tamanho que desejamos. Em seguida, pegamos essas pipetas de vidro, inserimos através da membrana vilosa do embrião e utilizamos um tubo de sucção bucal conectado à extremidade traseira da pipeta.Em seguida, extraímos o conteúdo de todo o embrião. Depois, movemos e retiramos a pipeta, transferindo-a para outro recipiente que contém uma lamínula com uma gota de cinco microlitros de meio. E expelimos o conteúdo do embrião nessa gota de cinco microlitros de meio.Pipetamos para cima e para baixo várias vezes para dispersar as células e, em seguida, deixamos essa lamínula repousar no recipiente por cerca de 10 minutos antes de inundar o recipiente com dois mililitros de meio. Os recipientes com células, após serem semeados, são colocados em uma incubadora com 5% de CO₂. Isso é muito importante porque o meio que utilizamos é um meio tamponado com bicarbonato.Temos alguns HEPs ali, mas não é suficiente para tamponar no ambiente atmosférico. Portanto, é necessário usar uma estufa com 5% de CO2. No entanto, ela precisa estar a uma temperatura relativamente baixa, sendo ideal entre 22 e 23 graus.Então, pegamos um incubador de CO₂ padrão que seria usado para culturas de mamíferos e o aquecemos a 37 graus. O que fazemos é desligar o aquecedor, deixando-o em repouso no nosso laboratório, e colocamos gelo no fundo do incubador, o que mantém a temperatura em torno de 21 a 25 graus. A outra técnica que utilizamos consiste em pegar, novamente, um desses incubadores padrão com aquecimento e colocar o incubador em uma câmara fria.Então você pode aquecer de forma bastante eficaz o incubador a 23 graus, caso a temperatura ambiente seja a de uma sala fria. Assim, esses são os dois métodos que utilizamos para obter um selamento padrão, selamento de mamífero ao incubador, permitindo que as culturas sobrevivam. Tudo bem, esta é uma cultura que foi semeada há uma hora, com a mesma ampliação com que a observamos logo após a semeadura, uma hora após a placação.Aqui observamos neurônios que se diferenciaram por cerca de dois dias. Em cultura, o neuroblasto dividiu-se uma ou mais vezes e, em seguida, deu origem a neurônios, que estendem prolongamentos que formam extensas redes neurais sobrepostas. Aqui temos dois corpos celulares dispostos cabeça a cabeça.O de cima está estendendo um processo às 11 horas, e o de baixo está estendendo um processo às cinco horas. Essas são suas extensões principais. E então você pode observar que eles formam ramificações mais finas.Estas estão muito aderidas ao substrato de vidro, e há processos que podem ser vistos vindo de outras células também, que se sobrepõem a essas. E esses são locais de conexão sináptica potencial. Nós realizaríamos um "patch" em uma dessas células, e, em geral, com esse nível de elaboração de processos, elas apresentariam correntes sinápticas funcionais.Agora nossas células crescem em cultura por 12 horas após a semeadura. Elas terão estendido processos bastante definidos. Em nossa fisiologia padrão, começamos a realizar cerca de uma a duas horas após o cultivo.E você pode observar que eles realmente continuam a desenvolver processos pelos próximos quatro ou cinco dias. E registramos atividade de células por até duas semanas em cultura, mas a maioria de nossos registros é realizada entre dois e seis dias em cultura. Com essas culturas recém-preparadas a partir de embriões de drosófila em estágio médio de gastrulação, temos redes de neurônios que se comunicam em cultura. Somos capazes de analisar efetivamente as propriedades de disparo dessas células.Eles possuem propriedades de disparo diversas. Alguns células disparam de forma repetitiva, outras células disparam em rajadas, e essas células são principalmente colinérgicas ou GABAérgicas. E analisamos correntes sinápticas mediadas por esses receptores, os receptores nicotínicos de ACh e os receptores de GABA.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

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No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

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Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula

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Isolamento e cultura de neurônios dopaminérgicos embrionários primários do mesencéfalo de camundongos

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