Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

Meu nome é Diana Dowd e sou professora do departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento e anatomia e neurobiologia da UC Irvine. E hoje vou demonstrar a preparação de culturas neuronais primárias a partir de embriões de drosófila. E o que isso implica é realmente remover todas as células de um estágio gastro intermediário, embrião de drosófila, e colocá-las em cultura de células.

E o que usamos essas culturas é realmente entender quais são os genes e fatores ambientais que são importantes para a regulação da excitabilidade elétrica e transmissão sináptica entre os neurônios da drosófila. Para iniciar este procedimento, temos que coletar embriões de drosófila. Para fazer isso, pegamos pratos de coleta de ovos, espalhamos um pouco de pasta de fermento sobre eles.

É um substrato favorável para as moscas adultas colocarem seus ovos. Colocamos esses pratos em garrafas contendo uma população de moscas adultas, geralmente de cem a 200 moscas. E então deixamos as moscas, moscas adultas colocarem seus ovos por cerca de duas a três horas.

Em seguida, removemos as placas de coleta de óvulos, e esses são os embriões que usamos para o procedimento de cultura. O próximo passo no procedimento é revestir os embriões, e isso significa que realmente removemos o córion. Fazemos isso lavando os embriões em um funil Buechner no qual temos um pedaço de papel de filtro para capturar os embriões.

Permitimos que eles fiquem no funil de Buchner em uma solução de alvejante a 50%. Esta solução de alvejante a 50% não apenas dissolve o córon, mas também serve como parte de nosso procedimento de esterilização. Na verdade, não estamos fazendo esse procedimento no capô, está fora do capô, então os embriões são, uma vez desclorados, nós os lavamos em uma placa de Petri.

Na verdade, quando o Corian se foi, a membrana viel fica bastante pegajosa e gruda bem em uma placa de Petri. Você pode então derramar água destilada em cima deles e remover a água destilada duas ou três vezes e, na verdade, apenas jogar a água fora e os embriões grudarão na placa de Petri. Não use um prato de plástico para cultura de tecidos.

Eles não se apegam a isso. Começamos a parte estéril do procedimento pegando as placas de Petri dos embriões e levando-as para uma capela de fluxo laminar. Estas são lamínulas Bellco.

Eles não são revestidos, mas foram autoclavados e não foram lavados. Descobrimos que eles não funcionam muito bem. Quando são lavados, geralmente retiramos quatro lamínulas e as colocamos em uma única placa de Petri.

Então, faremos quatro culturas de embriões em cada placa de Petri. Ok, então essa placa de Petri está basicamente pronta para começarmos a cultivar, e eu costumo fazer 12 culturas, 12 a 16 culturas de cada vez. Okey? O meio de cultura que usamos é um meio definido relativamente simples.

É a base ADME, e nós preparamos esse meio líquido uma vez a cada duas semanas para que fique bom por duas semanas na geladeira. Isso foi esterilizado. Ele foi colocado em um filtro estéril de 0,2 mícron e, em seguida, adicionamos cinco suplementos à mídia.

Eles são preparados uma vez a cada dois meses e depois congelados em alíquotas que são adicionadas a 10 mils do meio líquido. Então, apenas removemos o conteúdo. Final, então isso é apenas, apenas invertemos suavemente essa mídia para misturá-la e estamos prontos para começar. Okey.

Tudo está configurado. Eu tenho minha placa de cultura que está pronta, aquela ou minha placa de Petri que tem quatro lamínulas prontas para uso. E agora vou levar meu prato com embriões e vou, eles agora estão sentados na água destilada.

Vou remover a água destilada apenas sacudindo-a. É assim que eu faço direto para a lata de lixo. E agora vou derramar cerca de dois moinhos da mídia nesses embriões, e agora eles estão prontos para eu realmente inserir a agulha de vidro em embriões individuais e remover o conteúdo.

Você tem que ter a mídia do lado de fora. Obviamente, se houvesse água lá fora, você teria um choque osmótico. Agora, para me preparar para realmente preparar as culturas antes de remover o conteúdo do embrião, coloquei a gota de cinco microlitros nas lamínulas.

Se você deixar por muito tempo, o pH da mídia muda. Ok, agora vou colocar uma gota de cinco microlitros no centro de cada uma das quatro lamínulas. Na verdade, é importante que essas gotas digam para ficar o mais intacto possível.

Se a mídia se espalhar por toda a lamínula, as células serão revestidas em algumas, uma camada muito fina de fluido é difícil. Você quer que eles coloquem as células em uma bela gota redonda de fluido. Como você pode ver lá, temos quatro belas gotas redondas de fluido prontas para uso.

E agora vou pegar uma das pipetas que puxei e depois prendê-la a este tubo de pipeta de boca. Você pode usar qualquer tubo que quiser, mas o bom deste tubo é que ele vem com pipetas de 100 microlitros calibradas com tubos da VWR. E neles temos, há uma pequena junta de borracha aqui.

Eu posso inserir o pipetador bucal, quero dizer, a pipeta de vidro nesta extremidade do pipetador. E então, quando eu sugar o conteúdo do embrião, não vou subir mais do que isso, a região onde ele começa a se estreitar. Então, há essa enorme área me separando usando a sucção do mouse aqui e o lugar onde estão as células.

Portanto, não há, não há problema com contaminação. Se você acidentalmente sugar o conteúdo para esta área, terá enormes problemas de contaminação. Em nossas capelas de fluxo laminar, temos microscópios de dissecação que são de base scópica.

Isso permite que a luz entre de baixo do embrião, e isso nos permite realmente ver o sulco cefálico e o intestino médio e a imaginação que você verá quando olharmos para os embriões reais. E é assim que realmente escolhemos o estágio do embrião que é importante para a cultura para remover o conteúdo do embrião. Usamos pipetas de vidro, puxamos um extrator de microeletrodo comum que usamos para fazer nossas pipetas de registro de patch.

Nós realmente não nos importamos com quais são as configurações. Puxamos pipetas muito finas porque vamos quebrar a pipeta no prato ao lado do embrião no tamanho que realmente queremos. Em seguida, pegamos essas pipetas de vidro, inserimo-las através da membrana viel do embrião e usamos um tubo de sucção bucal que é conectado à parte de trás da parte de trás da pipeta.

Em seguida, extraímos o conteúdo de todo o embrião. Em seguida, movemos a tomada, retiramos a pipeta e passamos para outro prato que tenha uma lamínula com uma gota de cinco microlitros de mídia. E expelimos o conteúdo do embrião para aquela gota de cinco microlitros.

Pipetamos para cima e para baixo várias vezes para dispersar as células e, em seguida, deixamos a tampa descansar no prato por cerca de 10 minutos antes de inundarmos o prato com dois moinhos de mídia. Os pratos das células depois de banhados são colocados em uma incubadora de 5% de CO2. Isso é muito importante porque o meio que usamos é um meio tamponado de bicarbonato.

Temos alguns HEPs lá, mas não é suficiente para armazenar no ambiente aéreo. E então você tem que usar uma incubadora de 5% de CO2. No entanto, tem que estar a uma temperatura relativamente baixa em torno de 22 a 23 graus é o ideal.

Então, pegamos uma incubadora de CO2 padrão que seria usada de culturas de mamíferos e a aquecemos a 37 graus. O que fazemos é desligar o aquecedor, colocá-lo em nosso laboratório e podemos colocar gelo no fundo da incubadora, e isso mantém a temperatura em torno de 21 a 25 graus. A outra técnica que usamos é pegar, novamente, uma dessas incubadoras de CO2 de aquecimento padrão e colocar a incubadora em uma câmara fria.

Então você pode realmente aquecer a incubadora de forma bastante eficaz a 23 graus se a temperatura ambiente for a temperatura da sala fria. E então esses são os dois métodos que usamos para ter uma foca padrão, foca de mamífero para incubadora para nos permitirmos sobreviver. Tudo bem, esta é uma cultura que foi banhada há uma hora com a mesma ampliação que vimos logo após o revestimento uma hora após o revestimento.

Aqui vemos neurônios que se diferenciaram por cerca de dois dias. Em cultura, os neuroblastos se dividiram uma ou mais vezes e depois deram origem a neurônios, que estendem processos que formam extensas redes neuróticas sobrepostas. Aqui temos dois corpos celulares que estão frente a frente.

O superior está estendendo um processo às 11 horas, e o inferior está estendendo um processo às cinco horas. Essas são suas principais extensões. E então você pode ver que eles formam ramos mais finos.

Eles estão muito aderidos ao substrato de vidro, e há processos que você pode ver que também vêm de outras células que se sobrepõem a eles. E esses são locais de conexão sináptica potencial. Nós remendaríamos uma dessas células e, em geral, com esse nível de elaboração do processo, elas teriam correntes sinápticas funcionais sinápticas.

Agora nossas células crescem em cultura 12 horas após o revestimento. Eles terão processos muito bons estendidos. Nossa fisiologia padrão, começamos a fazer cerca de um a dois após o cultivo.

E você pode ver que eles realmente continuam a aumentar os processos pelos próximos quatro ou cinco dias. E registramos de células de até duas semanas em cultura, mas a maioria de nossas gravações está entre dois e seis dias em cultura com essas culturas, então que acabamos de preparar a partir de embriões de drosófila em estágio gastro intermediário, temos redes de neurônios que se comunicam em cultura. Somos capazes de realmente olhar para as propriedades de disparo dessas células.

Eles têm diversas propriedades de queima. Eles têm, eles disparam repetitivamente, algumas células disparam repetidamente, outras células disparam no nascimento, e essas células são principalmente colinérgicas ou GABAérgicas. E nós olhamos, podemos olhar para as correntes sinápticas que são mediadas por eles, por receptores nicotínicos, Aach, H e receptores GABA.