Name: Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprenda a registrar a ativação de canais BK em oócitos de Xenopus usando técnicas de grampo patch e sistema de perfusão. Este método permite estudar a dependência de voltagem e cálcio em canais iônicos.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health bolsas R01-R01-HL70393 e NS060706 para JCJC é um professor de engenharia biomédica na T. Spencer Olin Endowment.

1. Injeção de mRNA em oócitos <ol><li> Injetar 0,05-50 ng de RNA mensageiro que foi transcrita in vitro em oócitos Xenopus laevis (estágio V-VI), utilizando Nanoject II Auto-nanolitros Injector (Drummond empresa Scientific, modelo 3-000-204). Repetir a injecção em uma dúzia de ovócitos para cada mRNA. </li><li> Enxágüe os oócitos injetados duas vezes com solução ND-96 (96 mM de cloreto de sódio (NaCl, deputado 58,44 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, deputado 74,56 g / mol), 1,8 mM de cloreto de cálcio (CaCl 2 • 2H 2 O , o Sr. 147,02), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl 2 • 6H 2 O, o Sr. 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, deputado 238,31 g / mol), 2,5 mM piruvato de sódio (Mr 110,04 g / mol), pH e 1x penicilina-estreptomicina. 7.6), em seguida, colocá-los em uma placa de cultura e incubar a 18 ° C por 2 dias +. </li></ol> 2. Preparando o sistema de perfusão <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Ilustração do sistema de perfusão Automatize ValveLink 16. O sistema de perfusão usa nitrogênio pressurizado para empurrar soluções para perfusão fora dos reservatórios de solução, através da perfusão tubulações, e para o lápis de perfusão e gorjeta. O fluxo de cada fluxo de solução de perfusão é controlada por uma válvula do reservatório e uma válvula eletrônica. Neste protocolo, um dos reservatórios não é pressurizado e funciona como um coletor de resíduos, bem como um mecanismo de liberação de pressão. (Imagem adaptada de http://www.autom8.com fornecedor website) <ol><li> Conectar as tubulações para o lápis de perfusão. Ligue o controlador de válvula eletrônica e abrir as válvulas eletrônicas. </li><li> Para assegurar que as tubulações e os lápis de perfusão são livres de bolhas de entupir e ar, empurrar a água (DI) deionizada através de cada tubo usando uma seringa com água deionizada. </li><li> Conecte o tubulações aos reservatórios solução e abrir a válvula do cilindro de gás nitrogênio pressurizado para aplicar. </li><li> Abrir a válvula do reservatório para encher o tubo com a solução do reservatório. Flick da válvula do reservatório para remover as bolhas na solução, se necessário. Feche a válvula após o tubo é preenchido com a solução. </li><li> Preencha a ponta de perfusão com água e aperte-o para o lápis de perfusão. Tenha cuidado para não prender as bolhas ao se conectar a ponta. </li><li> Fixar o lápis de perfusão para o palco banho usando massa de modelar. Certifique-se que a ponta de perfusão é no espaço do banho. O sistema de perfusão está agora configurado. </li><li> Adicione a água DI no banho. Certifique-se que a ponta de perfusão está submerso na água. </li><li> Teste que cada solução de perfusão sai da ponta de perfusão corretamente. Fechar a válvula eletrônico conectado à tubulação do coletor de resíduos e abrir a válvula para uma solução de perfusão de cada vez (140 mM de hidróxido de potássio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroxietil) -1 - piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM de etileno glicol bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraacetic ácido (EGTA, M r 380,35 g / mol), pH é ajustado para 7,1-7,2 por metanosulfonico ácido (meso 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + ou Mg2 + é adicionado à concentração desejada quando necessário). Sob o microscópio, observe o jato de líquido de perfusão que sai da ponta de perfusão. Fechar a válvula para solução de perfusão e abrir a válvula para o coletor de resíduos. O jato de perfusão deve quase desaparecer. Repita o mesmo teste para todas as soluções para perfusão. </li><li> Quando você tiver verificado que todas as soluções de fluxo de perfusão corretamente, substituir a água DI no banho com uma solução de banho (140 mM de hidróxido de potássio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, M r 74,56 g / mol), pH é ajustado para 7,1-7,2 por metanosulfonico ácido (meso 3, M r 96,1 g / mol)). </li></ol> 3. Patch clamping <ol><li> Recobrimento do eletrodo de registro Ag com AgCl antes de cada patch clamping sessão. Primeiro, remova o fio de eletrodo do porta-pipeta e submergir o meia ponta do arame-eletrodo em um frasco contendo lixívia fresca pelo menos durante 15 minutos. Este depósitos uma camada de AgCl sobre o fio. </li><li> Lavar o arame eletrodo com água deionizada e secar. Em seguida, instalar o eletrodo Ag / AgCl de volta no suporte da pipeta. </li><li> Conecte o banho de eletrodo (referência) para o headstage e colocá-lo no banho. Isso prepara os eletrodos para gravação. </li><li> Agora preparar para aquisição de dados. Ligue o computador e ligue a chave de hardware na porta da impressora de seu computador. A chave de hardware deve ser ligada para que você use o software de aquisição de dados, que é Heka pulso. </li><li> Ligue o amplificador (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) e começar a Heka Pulse. Carregar o arquivo de protocolo e ajustar as definições de configuração, tais como a Escala de estímulo. A meta para ajustar as definições de configuração é garantir que o potencial de teste é exatamente igual ao potencial de comando. Isso prepara o equipamento de aquisição de dados. </li><li> Prepare oócitos. Oócito submergir o stripping em solução (200 mM N-Metil-D-glucamina (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM Aspartato (sem K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM de etileno glicol bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraacetic ácido (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), pH é ajustado para 7,4 por hidróxido de sódio (NaOH, M r 40,0 g / mol) por 5 -. 10 min A solução stripping destaca a membrana vitelina da membrana plasmática que torna possível para tirar a membrana vitelina. </li><li> Gentilmente tira a membrana vitelina do oócito usando dois pares de fórceps. Um ovócito devitellinized é extremamente frágil e, portanto, deve ser movido o mínimo necessário. </li><li> Tendo o cuidado de evitar expor o ovócito devitellinized ao ar ou bolhas, use uma pipeta de vidro preenchidos com solução suficiente para transferir o ovócito ao banho. Isso prepara o óvulo para a gravação. </li><li> Prepare pipetas patch. Puxe a pipetas de vidro após a inserção de um tubo de vidro capilar (VWR International, Cat # 53432-921) em um Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipeta Puller. Observe as pipetas ao microscópio para determinar a forma da ponta e diâmetro de abertura. O diâmetro de abertura deve ser 2-4 micrômetros. </li><li> Para reduzir a corrente capacitiva durante a gravação e para garantir uma ponta lisa, o revestimento da ponta com cera e depois do fogo-polonês-lo. </li><li> Encha a ponta da pipeta, colocando a ponta da pipeta dentro da solução de pipeta (140 mM de hidróxido de potássio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de cloreto de potássio (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM de cloreto de magnésio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), pH é ajustado para 7,1-7,2 por metanosulfonico ácido (meso 3, M r 96,1 g / mol)) e desenho o êmbolo. Este molha a ponta. </li><li> Preencha pipeta 03/01 completa com pipeta solução utilizando uma seringa e coloque a pipeta no suporte da pipeta com a parte interna do eletrodo Ag / AgCl e entrar em contato com a solução da pipeta. Isto prepara a pipeta patch. </li><li> Para extirpar um patch de dentro para fora do oócito preparado, encontrar a clara vantagem do ovócito sob o microscópio. Mover a pipeta de patch perto do oócito usando manipulador. Anote a resistência série do pipeta. A resistência série ideal da pipeta patch é entre 1-1,5 mohms quando preenchido com solução de pipeta e submerso em solução de banho. </li><li> Empurre lentamente a pipeta contra o ovócito até a resistência aproximadamente dobra. </li><li> Aplicar sucção suave para a membrana por via oral, através de um tubo de sucção que é conectado ao titular da pipeta até um selo giga-ohm é obtido. Estabilizar o patch, segurando-o em tensão -30 mV para um par de minutos. </li><li> Para obter uma mancha de dentro para fora sobre o consumo, o patch rapidamente por empurrar a pipeta mais para o ovócito e, em seguida, puxando-o para fora. </li><li> O patch de dentro para fora agora está pronto para fixação. Mover a pipeta holding o patch de dentro para fora para cerca de 100 mícrons de distância da abertura da ponta de perfusão. </li><li> Fechar a válvula eletrônica para a recolha de resíduos e abrir a válvula do reservatório para a solução de perfusão desejado </li><li> Começar a gravar correntes em todo o patch. Mudar a tensão e soluções de perfusão, como desejado. </li><li> Quando você terminar a gravação, limpa a perfusão tubulações lápis, e empurrando a ponta através da água deionizada para evitar obstruções. </li></ol> 4. Resultados representante Durante a preparação dos ovócitos para patch clamp, o tratamento 10/05 min de solução stripping seria separar a membrana vitelina da membrana plasmática, o que torna possível stripping a membrana vitelina. A resistência série ideal da pipeta patch é entre 1-1,5 mohms quando preenchido com solução de pipeta e submerso em solução de banho. Segue-se uma gravação representante de canais do tipo selvagem BK em um remendo de membrana de ovócitos. No canto superior esquerdo, as ondas quadradas indicam a tensão aplicada ao patch - a segunda etapa do aumentos de tensão de 50 mV a 200 mV com incremento de 50 mV. Abaixo está os traços correspondentes atuais, quando a solução de perfusão foi nominal 0 Ca 2 + (livre [Ca 2 +] é cerca de 0,5 nM). O emaumento da amplitude da corrente indica que a probabilidade de abrir canais BK aumenta com a tensão. No lado direito, o patch mesmo é perfundido com 1,0 mM Ca 2 +, quando aplicado com o protocolo mesma tensão. A amplitude da corrente aumenta mais sob a mesma tensão, indicando que a probabilidade aumenta com open [Ca 2 +]. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2">

<ol><li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes%3A+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).</li>
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<li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2%2B+coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li>
<li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%7Bbeta%7D+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O sistema de expressão de ovócitos é ideal para a caracterização eletrofisiológica de canais voltagem-dependentes de íons devido ao fundo relativamente baixo de canais endógena. Além disso, uma vez que é um sistema de expressão transitória, ela fornece um método eficiente de realizar estudo de mutagênese destes canais. No entanto, deve-se notar que o sistema de expressão de ovócitos é diferente do que em células de mamíferos, assim, pode haver diferenças na modificação pós-traducional e associação com subunidades difere...

<table><tbody><tr><td>Injetor Automático em Nanolitros Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de Micropipetas Flaming/Brown P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Perfusão e Controlador Eletrônico</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>ValveLink 16</td><td>Diâmetro interno da ponta de perfusão: 100 micrômetros</td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Vidro</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de Micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Axon Instruments</td><td>AXOPATCH 200B</td><td></td></tr><tr><td>Interface de Computador</td><td>INSTRUTECH Corporation</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Cabeçote</td><td>Axon Instruments</td><td>CV 203BU</td><td></td></tr></tbody></table>

grampo patch e técnicas de perfusão para estudar canais iônicos expresso em xenopus oócitos

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

O protocolo aqui apresentado foi concebido para estudar a ativação da condutância grande tensão e Ca 2 +-K + ativados (BK) canais. O protocolo também pode ser usado para estudar a relação estrutura-função de canais iônicos e outros receptores de neurotransmissores 1. Canais BK são amplamente expressos em diferentes tecidos e têm sido implicados em muitas funções fisiológicas, incluindo a regulação da contração do músculo liso, Afinação da frequência de células ciliadas internas e regulação da liberação de neurotransmissores 2-6. BK canais são ativados por despolarização da membrana e por Ca 2 + intracelular e Mg 2 + 6-9. Portanto, o protocolo é projetado para controlar a tensão de membrana ea solução intracelular. Neste protocolo, o RNA mensageiro dos canais BK é injetado dentro de oócitos Xenopus laevis (estágio V-VI), seguido de 2-5 dias de incubação a 18 ° C 10-13. Remendos da membrana que contêm um ou vários canais BK são excisadas com a configuração de dentro para fora usando técnicas de patch-clamp 10-13. O lado intracelular do patch é perfundido com soluções desejadas durante a gravação de modo que a ativação de canais em diferentes condições podem ser examinados. Para resumir, o mRNA de canais BK é injetado dentro de oócitos Xenopus laevis para expressar proteínas canal na membrana do oócito; técnicas de patch clamp são usados ​​para gravar correntes que fluem através dos canais sob tensão controlada e soluções intracelular.

Corrente iônica de canais BK é gravado usando técnicas de patch clamp. Canais BK são expressos em<em&gt; Oócitos Xenopus</em&gt; Através da injeção de RNA mensageiro. A solução intracelular durante gravações de patch clamp é controlado por um sistema de perfusão.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

O protocolo aqui apresentado foi desenvolvido para estudar a ativação dos canais de K+ de grande condutância, ativados por voltagem e Ca2+ (canais BK). O protocolo pode ...

O objetivo geral deste procedimento é registrar a ativação do canal BK sob voltagem controlada, ao mesmo tempo em que se controla a solução intracelular. Isso é realizado primeiramente pela expressão de canais BK em ovócitos de Xenopus por meio da injeção com mRNA do canal BK. O segundo passo do procedimento é preparar o sistema de perfusão.O terceiro passo do procedimento é formar um selo giga entre a membrana do ovócito e a pipeta de grampo. O passo final do procedimento é excisar o fragmento de membrana. Em última análise, os resultados obtidos utilizando a tecnologia de grampo de patch acoplada a um sistema de perfusão mostram que os canais BK são ativados por alterações na voltagem e na concentração de cálcio.Olá, sou Jin Cho Young do laboratório da Dra. Jamie Zu na Universidade de Washington. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência, incluindo questões sobre o mecanismo molecular da ativação de canais iônicos. Então, vamos começar.O primeiro passo do procedimento começa alguns dias antes do patch clamping e utiliza mRNA do canal BK transcrito in vitro. Após coletar os ovócitos de Xenopus Lavu na fase cinco a seis, injete de 0,05 a 50

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este destina-se como uma introdução para o patch clamp de gravação a partir de oócitos Xenopus laevis. Abrange vitelínico remoção da membrana, a formação de um selo gigaohm (gigaseal), ea conversão opcional do patch para a topologia de fora-out.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Vamos demonstrar como estudar o efeito de uma única mutação de ponto na função de um canal iônico.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

Descrevemos um método para quantificar a atividade de ATPases do tipo P de contratransporte de K+ pela expressão heteróloga das enzimas em oócitos de Xenopus e medindo a captação de Rb+ ou Li+ em células individuais por espectrofotometria de absorção atômica. O método é uma alternativa sensível e segura aos experimentos de fluxo de radioisótopos, facilitando estudos cinéticos complexos.

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Para complementar os métodos habitualmente utilizados para estudar TRPV4 de, dois métodos são descritos: O mecanosensibilidade pode ser estudada por Ca 2 +-aequorina luminometria em leveduras transgénicas após desafio com hipo-osmótico. Ele também pode ser examinada em TRPV4-ARN injectado oócitos de Xenopus a-célula inteira de dois eléctrodos de aperto de voltagem ou remendo grampo em no modo de célula ou excisadas.

Luminométricos levedura e Xenopus ovócitos eletrofisiológicos Exames do mecanosensibilidade Molecular de TRPV4

A abordagem lacuna vaselina cut-aberto é usado para obter baixos gravações de ruídos de correntes iônicas e gating de canais iônicos dependentes de voltagem expressos em oócitos de Xenopus com alta resolução de cinética de canais rápidos. Com modificações menores, fixador de tensão fluorometria pode ser acoplado com o protocolo do oócito corte aberto.

O<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Cut-aberto vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Com Fluorometria

Descrito aqui é um procedimento para a obtenção de longos trechos de gravação atual de um canal iônico com a técnica de patch-clamp anexado à célula. Este método permite observar, em tempo real, o padrão de open-close conformações dos canais que estão na base do sinal biológico. Estes dados informar sobre as propriedades dos canais nas membranas biológicas não perturbadas.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Procedimentos otimizados para o isolamento de folículos únicos, microinjeções de RNA citoplasmático, remoção de camadas de células circundantes e expressão de proteínas em oócitos de Xenopus são descritos. Além disso, é apresentado um método simples para mudanças rápidas de solução em experimentos eletrofisiológicos com canais iônicos dependentes de ligantes.

Xenopus Oócitos: Métodos otimizados para microinjeção, remoção de camadas de células foliculares e rápidas mudanças Solução em experimentos eletrofisiológicos

Este artigo descreve um aumento da Fluorometria Voltagem-Clamp convencional (VCF) onde Fluorescente Aminoácidos Não-naturais (fUAA) são usados ​​em vez de corantes maleimida, para sondar rearranjos estruturais em canais iônicos. O procedimento inclui injeção de DNA de oócito de Xenopus , coinjeção de ARN / fUAA e medições simultâneas de corrente e fluorescência.

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Este é um guia para modificar a forma de micropipetas de vidro. Especificamente, usando calor e pressão de ar do cone é alargado, sem aumentar a abertura da ponta, levando a menor resistência da pipeta. Isto é fundamental para obter gravações de baixo ruído de pequenas células, mas é útil em muitas aplicações.

Pressão polimento Pipetas para Gravação de patch-clamp melhorada

Aprenda a registrar a ativação de canais BK em oócitos de Xenopus usando técnicas de grampo patch e sistema de perfusão. Este método permite estudar a dependência de voltagem e cálcio em canais iônicos.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

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