Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

O objetivo geral deste procedimento é registrar a ativação do canal BK sob tensão controlada, ao mesmo tempo em que controla a solução intracelular. Isso é feito expressando primeiro os canais BK em Xenopus Cytes, injetando-os com o mRNA do canal BK. A segunda etapa do procedimento é preparar o sistema de perfusão.

A terceira etapa do procedimento é formar uma giga vedação entre a membrana do oócito e a pipeta de remendo. A etapa final do procedimento é extirpar o adesivo de membrana. Em última análise, os resultados obtidos usando a tecnologia patch clamp acoplada a um sistema de profusão mostram que os canais BK são ativados por mudanças na voltagem e na concentração de cálcio.

Olá, sou Jin Cho Young do laboratório Dr.Jamie Zus na Universidade de Washington. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, incluindo questões relativas ao mecanismo molecular para a ativação do canal iônico. Então vamos começar.

A primeira etapa do procedimento começa alguns dias antes do clampeamento do adesivo e usa o mRNA do canal BK que foi transcrito in vitro. Após a colheita do estágio cinco a seis de Xenopus Lavu Cytes, injete 0,05 a 50 nanogramas de mRNA do canal BK em um cite. Usando um injetor nano de dois nanolitros automáticos.

Repita a injeção em uma dúzia de oócitos para cada mRNA após a injeção. Enxágue os oócitos duas vezes com a solução ND 96. Em seguida, coloque os oócitos em uma placa de cultura e incube-os a 18 graus Celsius por dois ou mais dias para dar tempo para que os oócitos expressem o canal BK.

Após dois a cinco dias de incubação, os oócitos devem estar expressando canais BK e, portanto, já estão para clampeamento do patch. Antes de manusear os oócitos, configure tudo o mais que você precisa para o clampeamento do adesivo, começando com o sistema de perfusão. O sistema mostrado aqui é o link da válvula de automação.

16 Sistema de profusão O nitrogênio pressurizado empurra as soluções de profusão para fora dos reservatórios de solução através dos tubos de profusão e para o lápis e a ponta de profusão. O fluxo de cada fluxo de solução de profusão é controlado por uma válvula reservatório e uma válvula eletrônica. Nesse protocolo, um dos reservatórios não é pressurizado e funciona como coletor de resíduos, além de mecanismo de liberação de pressão.

Podem ser preparadas soluções de perfusão com diferentes concentrações de cálcio ou magnésio antes das experiências. Adicione as soluções de perfusão aos reservatórios e rotule cada um para indicar a concentração de cálcio ou magnésio. Para configurar o sistema de profusão primeiro, conecte os tubos ao lápis de profusão.

Em seguida, ligue o controlador eletrônico da válvula e abra as válvulas eletrônicas para garantir que os tubos e o lápis de profusão estejam livres de entupimentos e bolhas de ar. Empurre a água deionizada através de cada tubo usando uma seringa cheia de água deionizada. Neste ponto, conecte as tubulações aos reservatórios de solução e abra a válvula do cilindro de gás para aplicar pressurizado ao nitrogênio.

Abra uma válvula do reservatório para encher a tubulação com uma das soluções do reservatório. Se necessário, clique na válvula do reservatório para remover as bolhas da solução. Feche a válvula reservatório depois que a tubulação estiver cheia de solução, encha a ponta de perfusão com água e aparafuse-a no lápis de perfusão.

Tenha cuidado para não prender bolhas. Ao conectar a ponta, fixe o lápis de perfusão no estágio do banho usando massa de modelar, certifique-se de que a ponta de profusão esteja no espaço do banho. O sistema de profusão está agora configurado.

Neste ponto, adicione água deionizada ao banho. Certifique-se de que a ponta de profusão esteja submersa na água. Teste se cada solução de perfusão sai da ponta de perfusão corretamente.

Feche a válvula eletrônica conectada à tubulação do coletor de resíduos e abra a válvula para uma das soluções de profusão. Sob o microscópio, observe o jato de fluido profundido saindo da ponta de perfusão. Feche a válvula para essa solução de profusão e abra a válvula para o coletor de resíduos.

O jato de profusão deve quase desaparecer. Repita o mesmo teste para cada uma das soluções de perfusão. Depois de verificar que todas as soluções de perfusão fluem corretamente, substitua a água deionizada no banho pela solução de banho desejada.

Agora é hora de configurar o aparelho de gravação. Você deve revestir o eletrodo de gravação de prata com cloreto de prata antes de cada sessão de fixação do remendo. Primeiro, remova o fio do eletrodo do porta-pipeta e mergulhe a metade da ponta do fio do eletrodo em um frasco contendo alvejante fresco por pelo menos 15 minutos.

Isso deposita uma camada de cloreto de prata no fio. Enxágue o fio do eletrodo com água deionizada e seque. Em seguida, instale o eletrodo de cloreto de prata e prata de volta no suporte da pipeta.

Agora ligue o computador. Conecte a chave de hardware à porta da impressora do seu computador. A chave de hardware deve ser conectada para que você use o software de aquisição de dados, que é o pulso HEA.

Ligue o amplificador e inicie o software de aquisição de dados. Pulso HEA. Carregue o protocolo file e ajuste as definições de configuração, como a escala de estímulo.

O objetivo de ajustar as definições de configuração é garantir que o potencial de teste seja exatamente igual ao potencial de comando. Agora estamos prontos para preparar os oócitos. Recupere os oócitos da incubadora.

Mergulhe o oócito em solução de remoção por cinco a 10 minutos. A solução de decapagem separa a membrana viel da membrana plasmática, o que torna possível descascar a membrana vitel. Após cinco a 10 minutos, retire suavemente a membrana vitel do oócito.

Usando duas pinças. Um site divi OC é extremamente frágil e, portanto, deve ser movido o mínimo necessário. Tomando cuidado para evitar expor o oócito Devi ao ar ou bolhas, use uma pipeta de vidro cheia de solução suficiente para transferir o oócito para o banho.

Os canais na membrana do oócito estão agora expostos e prontos para a pipeta de remendo. Puxe uma pipeta de remendo inserindo um tubo capilar de vidro no extrator de micropipeta. Observe as pipetas ao microscópio para determinar a forma da ponta e o diâmetro de abertura.

O diâmetro de abertura deve ser de dois a quatro micrômetros para reduzir a corrente capacitiva durante a gravação e, para garantir uma ponta lisa, cubra a ponta com cera e depois acenda. Poli-lo sob um microscópio. Encha a ponta da pipeta colocando a ponta da pipeta dentro da solução da pipeta e puxando o êmbolo.

Isso molha a ponta da pipeta. Em seguida, encha a pipeta até um terço com solução de pipeta usando uma seringa. Em seguida, coloque a pipeta no porta-pipetas com o eletrodo de prata e cloreto de prata dentro.

Certifique-se de que o eletrodo de arame esteja em contato com a solução de pipeta. O próximo passo é extirpar um adesivo de dentro para fora do oócito preparado. Primeiro, encontre a borda clara do oócito sob o microscópio.

Usando o manipulador, mova a pipeta de adesivo para perto do oócito, certificando-se de que esteja submerso. Na solução do banho, registre a resistência em série da pipeta. A resistência ideal da série da pipeta de remendo é entre um a 1,5 mili ohms quando preenchida com solução de pipeta e submersa em solução de banho.

Agora, empurre lentamente a pipeta contra o oócito até que sua resistência dobre aproximadamente. Obtenha uma vedação de giga ohm aplicando uma sucção suave por via oral através de um tubo de sucção conectado ao porta-pipeta. Depois de confirmar que um giga selo foi formado, estabilize o adesivo segurando-o a menos 30 milivolts por alguns minutos.

Para obter um adesivo de dentro para fora, excise o adesivo empurrando rapidamente a pipeta para dentro do local OO e, em seguida, puxando-a suavemente para fora. O patch de dentro para fora agora está pronto para fixação de patch. Mova a pipeta segurando o adesivo de dentro para fora a cerca de 100 mícrons de distância da abertura da ponta de perfusão.

Feche a válvula eletrônica para coleta de resíduos e abra a válvula reservatório para a solução de profusão desejada. Comece a registrar as correntes em todo o patch. Altere as soluções de tensão e profusão conforme desejado.

Quando terminar de gravar, limpe o lápis e a ponta dos tubos de profusão empurrando a água deionizada para evitar entupimentos. As gravações de grampo de adesivo obtidas aqui mostram que os canais BK do tipo selvagem em um adesivo de membrana de oócito respondem tanto à voltagem quanto ao cálcio. Esta figura mostra um registro de adesivo com cálcio zero nominal na solução de perfusão.

As ondas quadradas acima dos traços de corrente indicam a tensão aplicada ao patch. Quatro tensões foram aplicadas variando de 50 milivolts a 200 milivolts em incrementos de 50 milivolts. A corrente máxima, aproximadamente dois nano amperes, foi obtida com a tensão máxima de 200 milivolts.

Esse aumento na amplitude da corrente com o aumento da tensão indicou que a probabilidade aberta dos canais BK aumentou com a tensão. Esta figura mostra a resposta do patch de dentro para fora a diferentes tensões. Quando havia um cálcio micromolar na solução de perfusão, foram aplicados escalões de voltagem.

Como na figura seguinte, a resposta ao passo de tensão de 200 milivolts, a resposta superior aumentou para aproximadamente três nano amperes quando havia cálcio no Perfu oito em comparação com dois nano amperes sem cálcio. Isso indica que a probabilidade aberta dos canais BK aumentou na presença de cálcio. Em resumo, este procedimento de patch clamping mostrou que os canais BK eram dependentes de voltagem e cálcio.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gravar a ativação do Canal de Ferro usando a técnica de patch clamp acoplada a um sistema de abastecimento profissional. Agora. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.