Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

O objetivo geral deste procedimento é registrar a ativação do canal BK sob voltagem controlada, ao mesmo tempo em que se controla a solução intracelular. Isso é realizado primeiramente pela expressão de canais BK em ovócitos de Xenopus por meio da injeção com mRNA do canal BK. O segundo passo do procedimento é preparar o sistema de perfusão.

O terceiro passo do procedimento é formar um selo giga entre a membrana do ovócito e a pipeta de grampo. O passo final do procedimento é excisar o fragmento de membrana. Em última análise, os resultados obtidos utilizando a tecnologia de grampo de patch acoplada a um sistema de perfusão mostram que os canais BK são ativados por alterações na voltagem e na concentração de cálcio.

Olá, sou Jin Cho Young do laboratório da Dra. Jamie Zu na Universidade de Washington. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência, incluindo questões sobre o mecanismo molecular da ativação de canais iônicos. Então, vamos começar.

O primeiro passo do procedimento começa alguns dias antes do patch clamping e utiliza mRNA do canal BK transcrito in vitro. Após coletar os ovócitos de Xenopus Lavu na fase cinco a seis, injete de 0,05 a 50 nanogramas de mRNA do canal BK em um ovócito. Utilize um nano-injetor automático de nanolitros.

Repita a injeção em uma dúzia de ovócitos para cada mRNA após a injeção. Lave os ovócitos duas vezes usando solução ND 96. Em seguida, coloque os ovócitos em uma placa de cultura e incube-os a 18 graus Celsius por dois ou mais dias para permitir tempo suficiente para que os ovócitos expressem o canal BK.

Após dois a cinco dias de incubação, os ovócitos devem estar expressando canais BK e, portanto, já estão prontos para o patch clamping. Antes de manipular os ovócitos, prepare todo o resto de que você precisará para o patch clamping, começando pelo sistema de perfusão. O sistema mostrado aqui é o automate valve link.

O sistema de profusão 16 utiliza nitrogênio pressurizado para empurrar as soluções de profusão para fora dos reservatórios de solução, através dos tubos de profusão e até a caneta e ponta de profusão. O fluxo de cada corrente de solução de profusão é controlado por uma válvula do reservatório e uma válvula eletrônica. Neste protocolo, um dos reservatórios não é pressurizado e funciona como coletor de resíduos, bem como um mecanismo de liberação de pressão.

Podem ser preparadas previamente soluções de perfusão com diferentes concentrações de cálcio ou magnésio. Adicione as soluções de perfusão aos reservatórios e rotule cada um para indicar a concentração de cálcio ou magnésio. Para montar o sistema de perfusão inicialmente, conecte os tubos ao lápis de perfusão.

Em seguida, ligue o controlador de válvula eletrônico e abra as válvulas eletrônicas para garantir que os tubos e o lápis de perfusão estejam livres de obstruções e bolhas de ar. Passe água desionizada por cada tubo usando uma seringa cheia de água desionizada. Neste momento, conecte os tubos aos reservatórios de solução e abra a válvula do cilindro de gás para aplicar pressão com nitrogênio.

Abra uma válvula do reservatório para encher o tubo com uma das soluções do reservatório. Se necessário, clique na válvula do reservatório para remover bolhas da solução. Feche a válvula do reservatório após o tubo estar cheio com a solução, encha a ponteira de perfusão com água e rosqueie-a no lápis de perfusão.

Tenha cuidado para não aprisionar bolhas. Ao conectar a ponta, fixe o lápis de perfusão ao estágio do banho usando massa de modelar e certifique-se de que a ponta de perfusão esteja no espaço do banho. O sistema de perfusão está agora montado.

Neste momento, adicione água desionizada ao banho. Certifique-se de que a ponta de perfusão esteja submersa na água. Verifique se cada solução de perfusão sai corretamente pela ponta de perfusão.

Feche a válvula eletrônica conectada ao tubo do coletor de resíduos e abra a válvula para uma das soluções de perfusão. Sob o microscópio, observe o jato de fluido de perfusão saindo da ponta de perfusão. Feche a válvula para essa solução de perfusão e abra a válvula para o coletor de resíduos.

O jato de perfusão deve quase desaparecer. Repita o mesmo teste para cada uma das soluções de perfusão. Após verificar que todas as soluções de perfusão fluem corretamente, substitua a água desionizada no banho pela solução de banho desejada.

Agora é a hora de montar o equipamento de gravação. Você deve revestir novamente o eletrodo de prata com cloreto de prata antes de cada sessão de patch clamping. Primeiro, remova o fio do eletrodo do suporte da pipeta e submerja a metade da ponta do fio do eletrodo em um frasco contendo água sanitária fresca por pelo menos 15 minutos.

Isso deposita uma camada de cloreto de prata sobre o fio. Enxágue o fio do eletrodo com água desionizada e seque com papel absorvente. Em seguida, reinstale o eletrodo de prata/cloreto de prata no porta-pipeta.

Agora ligue o computador. Conecte a chave de hardware na porta da impressora do computador. A chave de hardware deve estar conectada para que você possa usar o software de aquisição de dados, que é o HEA pulse.

Ligue o amplificador e inicie o software de aquisição de dados. Pulso HEA. Carregue o arquivo do protocolo e ajuste as configurações de configuração, como a escala do estímulo.

O objetivo de ajustar as configurações de configuração é garantir que o potencial de teste seja exatamente igual ao potencial comandado. Agora estamos prontos para preparar os oócitos. Retire os oócitos do incubador.

Mergulhe o oócito na solução de remoção por cinco a 10 minutos. A solução de remoção desprende a membrana vitelina da membrana plasmática, o que torna possível remover a membrana vitelina. Após cinco a 10 minutos, remova cuidadosamente a membrana vitelina do oócito.

Usando duas pinças. Um local de divisão OC é extremamente frágil e, portanto, deve ser movimentado o mínimo necessário. Tendo cuidado para evitar expor o ovócito Devi ao ar ou a bolhas, utilize uma pipeta de vidro preenchida com solução suficiente para transferir o ovócito para o banho.

Os canais na membrana do oócito agora estão expostos e prontos para a pipeta de grampo. Puxe uma pipeta de grampo inserindo um tubo capilar de vidro no puxador de micropipetas. Observe as pipetas sob um microscópio para determinar a forma da ponta e o diâmetro da abertura.

O diâmetro da abertura deve ser de dois a quatro micrômetros para reduzir a corrente capacitiva durante a gravação e, para garantir uma ponta lisa, revestir a ponta com cera e depois aquecê-la. Polir sob um microscópio. Encher a ponta da pipeta colocando-a dentro da solução da pipeta e puxando o êmbolo.

Isso umedece a ponta da pipeta. Em seguida, encha a pipeta até um terço de sua capacidade com a solução para pipeta, utilizando uma seringa. Depois, coloque a pipeta no suporte de pipeta com o eletrodo de prata e cloreto de prata no interior.

Certifique-se de que o eletrodo de fio esteja em contato com a solução da pipeta. O próximo passo é excisar um remendo do tipo dentro para fora do oócito preparado. Primeiro, localize a borda clara do oócito sob o microscópio.

Usando o manipulador, mova a pipeta de gravação próximo ao ovócito, certificando-se de que esteja submersa. Na solução do banho, registre a resistência em série da pipeta. A resistência em série ideal da pipeta de gravação está entre um e 1,5 miliohms quando preenchida com a solução da pipeta e submersa na solução do banho.

Agora, empurre lentamente a pipeta contra o oócito até que sua resistência aumente aproximadamente duas vezes. Obtenha um selo em gigaohm aplicando sucção suave pela boca através de um tubo de sucção conectado ao suporte da pipeta. Após confirmar a formação de um selo em gigaohm, estabilize o patch mantendo-o a menos 30 milivolts por alguns minutos.

Para obter um remendo invertido, excise o remendo empurrando rapidamente a pipeta para dentro do local OO e, em seguida, puxando-a suavemente para fora. O remendo invertido está agora pronto para o patch clamping. Mova a pipeta que segura o remendo invertido para cerca de 100 micrômetros de distância da abertura da ponta de perfusão.

Feche a válvula eletrônica para coleta de resíduos e abra a válvula do reservatório para a solução de perfusão desejada. Inicie o registro das correntes através do patch. Altere a voltagem e as soluções de perfusão conforme desejado.

Quando terminar a gravação, limpe os tubos de perfusão, o lápis e a ponta empurrando água desionizada através deles para evitar entupimentos. Os registros de patch clamp obtidos aqui mostram que os canais BK do tipo selvagem em um remendo de membrana de oócito respondem tanto à voltagem quanto ao cálcio. Esta figura mostra um registro de remendo com cálcio nominalmente zero na solução de perfusão.

As ondas quadradas acima dos traçados de corrente indicam a voltagem aplicada ao patch. Foram aplicadas quatro voltagens variando de 50 milivolts a 200 milivolts em incrementos de 50 milivolts. A corrente máxima, aproximadamente dois nanoampères, foi obtida com a voltagem máxima de 200 milivolts.

Esse aumento na amplitude da corrente com o aumento da voltagem indicou que a probabilidade de abertura dos canais BK aumentou com a voltagem. Esta figura mostra a resposta do "patch" dentro-fora a diferentes voltagens. Quando havia um micromolar de cálcio na solução de perfusão, foram aplicados degraus de voltagem.

Como na figura anterior, a resposta ao degrau de tensão de 200 milivolts aumentou para aproximadamente três nanoampères quando havia cálcio na solução de perfusão, em comparação com dois nanoampères na ausência de cálcio. Isso indica que a probabilidade de abertura dos canais BK aumentou na presença de cálcio. Em resumo, este procedimento de grampo de membrana mostrou que os canais BK são dependentes de voltagem e cálcio.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como registrar a ativação do canal de ferro utilizando a técnica de patch clamp acoplada a um sistema de fornecimento de combustível. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.