Agar-Microcosmos Bloco de decomposição controlada de Tecidos Vegetais por fungos aeróbicos

O objetivo geral deste procedimento é inocular um fungo aeróbio degradador da madeira em um microcosmo de placa de Petri onde a umidade da madeira e os substratos exógenos são rigidamente controlados. Isso é feito primeiro preparando microcosmos com volumes exatos de edia conhecidos. Em seguida, a madeira a ser degradada e quaisquer substratos sólidos exógenos são montados em cima de uma grade de plástico na superfície agrícola sem permitir o contato entre os substratos.

O microcosmo é então inoculado e incubado com o fungo de teste. Após a incubação, as xilogravuras são colhidas para determinar a perda de massa e preparar os tecidos para análises. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o grau de biodegradação da madeira e o papel das fontes de elementos exógenos por meio de medições de perda de massa, observações da morfologia micelial e análises elementares direcionadas, como espectroscopia de plasma indutivamente acoplado.

Olá, meu nome é Brooke Jacobson, do laboratório do Dr. Jonathan Schilling no Departamento de Bioprodutos e Engenharia de Biossistemas da Universidade de Minnesota. Hoje vamos mostrar um procedimento para usar placas de Petri como microambientes para a decomposição do tecido vegetal por fungos aeróbios. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar os mecanismos de decomposição da lignocelulose fúngica.

A lignocelulose é o tecido vegetal composto por lignina, celulose e hemicelulose. O tecido que estudamos com mais frequência é a madeira, com os aspectos menos técnicos do projeto do bloco helicoidal são as causas mais comuns de falha e as principais fontes de variabilidade entre os estudos, tornando útil a publicação em vídeo de nossa configuração de bloco helicoidal. Sabemos por experiência que este procedimento produz resultados de alta qualidade e baixa variabilidade.

Então vamos começar. Para esses experimentos, use placas de Petri que são um centímetro mais profundas do que as placas de Petri típicas para aumentar o espaço acima da xilogravura. No microcosmo.

Comece a preparação do microcosmo fazendo um edia suficiente para 20 mililitros por placa de Petri para cálcio e ferro livres. Digite um ágar a 15 gramas de ágar para um balão volumétrico de 500 mililitros contendo aproximadamente 400 mililitros de água deionizada alterada com suplementos. Use soluções de estoque previamente preparadas para adicionar micronutrientes à mistura.

Uma vez adicionados os nutrientes, encher o balão volumétrico até à linha de 500 mililitros. Em seguida, transfira a mídia para um frasco de 1000 mililitros. A autoclave a 121 graus Celsius e 16 PSI por 20 minutos.

Tome cuidado para não exceder um volume de 500 mililitros por frasco para evitar que o agri solidifique antes da administração das placas de teste. Após a autoclavagem, deixe a mídia esfriar ao toque para minimizar a condensação. Minimizar a umidade é fundamental nesses experimentos, pois o teor de umidade ou mc.

Mais de 80% causará anóxia nos tecidos. Limite a decomposição por fungos aeróbicos e aumente a variabilidade uma vez. Fresco. Use um auxiliar de pipeta portátil e pipetas de poliestireno estéreis de 10 mililitros para assepticamente.

Transfira o ágar para uma pilha alta de placas em um gabinete de biossegurança. Em seguida, corte generosamente as grades de malha de plástico para caber dentro do fundo da placa. Depois de cortar e lavar bem as grades com água e sabão, prepare as grades de malha para secagem e autoclavagem para esta demonstração.

O pinheiro amarelo do sul ou SYP é usado porque representa uma importante fonte de madeira serrada. Em residências residenciais nos EUA, use madeira não tratada e corte blocos sem nós de 19 por 19 milímetros a partir de um único corte longitudinal ao longo do grão. Corte esse comprimento em blocos cúbicos de 19 milímetros.

Divida os blocos cúbicos de 19 milímetros ao meio ao longo do grão usando um cinzel e um martelo em vez de uma serra. Isso faz com que uma borda áspera do bloco fique voltada para baixo na malha de plástico no microcosmo do bloco agrícola e uma borda superior lisa para rotular. Rotule a borda lisa dos blocos com um lápis, corte blocos suficientes para satisfazer os tratamentos, bem como os controles não inoculados que servirão como monitores de contaminação e como amostras de dados de linha de base condicionadas em paralelo para material seco em estufa, coloque amostras em panelas de soro de leite de alumínio e em um forno de convecção a 100 graus Celsius por 48 horas.

Transfira as amostras do forno para um desidratador para resfriá-las uma vez. Fresco. Pese previamente as amostras para determinar o peso seco inicial do forno. Por fim, prepare as amostras, incluindo grades de plástico e madeira para autoclave, embrulhando firmemente com papel alumínio para minimizar o umedecimento.

Isso não requer que cada amostra seja embalada individualmente, mas que a exposição ao vapor seja baixa e consistente. Autoclave as amostras rotuladas a 121 graus Celsius e 16 PSI por uma hora. Em um gabinete de biossegurança estéril, monte AEs vazios, uma placa de origem para materiais exógenos de substrato vegetal de malha de inóculo, tiras paraformes sharpie, pinças e ferramentas de transferência.

O próximo passo da inoculação é adicionar os itens ao agri, conter placas de Petri para minimizar o risco de contaminação. Ferramentas de transferência de chama e pinças com 95% de etanol à medida que são usadas. Primeiro, adicione a malha de plástico à placa de Petri.

Em seguida, adicione o substrato de madeira aqui. Dois blocos de madeira são adicionados ao longo do comprimento da malha para que os dados possam ser emparelhados das colheitas iniciais e tardias. Esses blocos são adicionados lado a lado com o grão e voltados para o ponto da fonte de inóculo fúngico.

Em seguida, adicione os materiais exógenos. Aqui. O papel do gesso está sendo testado na decomposição por um fungo filamentoso. Portanto, o fungo deve encontrar esses discos de gesso antes de chegar à madeira.

Um disco de gesso é adicionado entre cada bloco e ponto de inóculo no topo da malha. Tome cuidado para evitar o contato entre os discos na madeira, mantendo-os próximos. Para o inóculo fúngico, use um Boer de cortiça número quatro com sete milímetros de diâmetro para fazer plugues de culturas de duas semanas cultivadas em 20 mililitros de ágar.

Isso ajuda a controlar o volume do inóculo. Para controles não inoculados, é melhor adicionar um tampão de uma placa estéril. Não permita o contato entre o inóculo e os substratos exógenos ou a madeira, mas coloque-os próximos.

Use um tampão de inóculo por bloco. Sele os pratos com o parâmetro que foi cortado com uma navalha, segure as placas horizontalmente e enrole o prato em um movimento suave e contínuo. Por fim, rotule as tampas dos pratos usando um marcador resistente ao álcool que rotula os números dos blocos diretamente sobre os respectivos substratos.

Desenhe também círculos sobre os discos de gesso. Transfira as placas com cuidado para uma incubadora biológica para evitar empurrar o conteúdo e minimizar a condensação devido às flutuações de temperatura. As condições usadas aqui são de 20 graus Celsius e, no escuro, realizam colheitas de séries temporais assepticamente, exceto na última colheita.

No ponto de colheita da semana cinco, remova todo o lote de tratamento. Pulverize cada fundo e topo com 70% de etanol e use uma pinça flamejada para remover o material dentro do gabinete de biossegurança. Tire fotos antes de destruir as placas agri, focando em qualquer morph F ou melão.

Em seguida, remova os blocos a serem tratados. Role o excesso de pha, mas tome cuidado para não perder o material deteriorado do forno. Seque os blocos em panelas de alumínio e determine a perda de massa usando os pesos fresco e seco dos controles para monitorar a absorção excessiva.

Os dados de perda de massa ajudam a avaliar o progresso do decaimento e são dados importantes. Se as concentrações elementares tiverem de ser calculadas com base em gramas de peso, os dados percentuais devem ser normalizados. Para obter estatísticas, rotule e rastreie quaisquer blocos marrons escuros, que estão claramente encharcados.

Por fim, destrua as culturas em sacos autoclaváveis, economizando malha plástica de suporte e quaisquer outros componentes que possam ser reciclados para uso em experimentos futuros. Usando a configuração do microcosmo do bloco agrícola, os blocos de madeira de pinho repousam sobre malha plástica para elevar os blocos acima do contato agrícola. Circular Crains cresceu em contato direto com as superfícies de gesso e nos blocos de madeira.

Este micélio representa uma importante conexão entre a madeira e as fontes de elementos nutrientes exógenos. No controle dessas fontes de materiais exógenos no ágar ou em materiais sólidos, há uma vantagem fundamental de um projeto de bloco agrícola versus projeto de bloco de solo perda percentual média de peso como medida da extensão da decomposição da madeira pelo sermão após cinco e 15 semanas. A incubação com pinheiros em microcosmos de blocos agrícolas é mostrada aqui.

Os tratamentos não foram nenhum. Cinco milimolares de cloreto de cálcio adicionados ao ágar maior que 99% de gesso puro ou 1% de gesso alterado com ferro para cada barra de colheita sob a mesma letra não são significativamente diferentes. Com as barras de erro representando o desvio padrão, mais de 60% de perda de peso foi observada nos blocos de pinho marrom podre de controle, o que satisfaz a meta padrão da American Society for Testing and Materials de maior que 50% de decaimento.

O coeficiente médio de variação no decaimento foi de 0,055 na semana 16. Além da baixa variabilidade, foi observado um efeito do tratamento. A decomposição fúngica foi inibida com adições de cálcio, seja ao ágar como cloreto de cálcio ou como gesso puro.

Curiosamente, as taxas de decaimento se recuperam com a adição de ferro ao gesso. Sugerir ferro, não cálcio, é fundamental para observar as cinco repetições na semana 15 de decaimento. Pela mesma podridão parda, fungo de teste, laminas circulares, a cor do micélio revela mein.

Diferenças nas hifas externas entre os tratamentos, os blocos foram removidos e secados. Revelando a falta de meína no tratamento sem cálcio. O amarelecimento nos tratamentos de cálcio puro e o aparecimento de ferrugem no tratamento de ferro corrigido.

O controle representa blocos não inoculados para comparação. Curiosamente, os efeitos mein são perdidos usando um meio com alto teor de ferro. Coletivamente, sugere que esse fungo utiliza ferro, não cálcio.

Nesses materiais, acabamos de mostrar como usar uma configuração de bloco helicoidal para testar com sucesso a biodegradação de tecidos vegetais por fungos filamentosos aeróbicos. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de evitar que os substratos entrem em contato uns com os outros, especialmente o tecido vegetal e a broca, minimizar o teor de umidade da broca e das plaquetas e verificar novamente se o conteúdo de cada placa não mudou antes da incubação. Tendo essas variáveis em mente, você pode controlar o ambiente de decomposição muito melhor do que ao usar uma configuração de bloco de solo.

Você pode gerar dados com um poder estatístico necessário para responder às suas perguntas de pesquisa. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.