Name: A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprenda a formar biofilmes de Candida albicans em placas de microtitulação de 96 poços para testar a susceptibilidade antifúngica. Este método colorimétrico reprodutível e de baixo custo permite avaliar a atividade metabólica e determinar a concentração inibitória mínima.

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Biofilme relacionadas ao trabalho no laboratório é financiado por verbas numeradas e R21DE017294 R21AI080930 do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial e do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (para JLL-R.). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIDCR, o NIAID ou o NIH.

1. Preparação de C. albicans C. albicans é um microorganismo 1/BSL1 Risk Group. Lembre-se sempre ao bom uso de técnicas assépticas / estéril para trabalhar com este microorganismo e seguir os procedimentos institucionais para o descarte adequado de materiais de risco biológico. <ol><li> Prepare uma cultura overnight de C. albicans em YPD médio (Yeast peptonada Dextrose) líquido através da inoculação de uma única colônia de C. albicans em 25 mL de YPD. </li><li> Incubar a cultura em um shaker orbital (cerca de 180 rpm) a 30 ° C durante a noite. Mais C. albicans cepas vai crescer como células de levedura sob essas condições. </li><li> Centrifugar as culturas durante a noite (cerca de 3.000 rpm, 5-10 minutos), lave as células duas vezes com PBS estéril, e ressuspender o sedimento final em cerca de 20-25 mL de meio RPMI 1640 tamponado com 165 mM de ácido morpholinepropanesulfonic a 7,0 pH e pré-aquecido a 37 ° C (a partir de agora este meio é referido simplesmente como "RPMI 1640"). </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitômetro. Após a contagem, prepare uma suspensão de células em uma densidade final de 1,0 x 10 6 células / mL em RPMI 1640. Nota: Como as células têm uma tendência a se agregar, é importante vortex vigorosamente entre as lavagens e antes de pipetar. </li></ol> 2. Configurando o de 96 poços da placa de microtitulação para a formação do biofilme <ol><li> Usando uma pipeta multicanal adicionar 100 mL de C. albicans suspensão em poços selecionados dos 96 poços da placa de microtitulação (-s). Não adicione células para poços na coluna 12, como estes servirão como controles negativos. </li><li> Cobrir a placa de microtitulação inteiro com sua tampa original, vedação com parafilme, coloque dentro de uma incubadora e incubar por 24 horas a 37 ° C. A duração da incubação pode ser adaptado para o projeto experimental específico. Por exemplo, é possível examinar a cinética de formação de biofilme ao longo de um período de 24-48 horas de semeadura placas múltiplas e processamento de cada placa em momentos diferentes (ie 2, 4, 8, 12, 24 e 48 h) </li><li> Após a formação de biofilme, usando uma pipeta multicanal aspirar o meio com cuidado de não tocar e interromper os biofilmes que se formaram em cada um dos poços. </li><li> Usando uma pipeta multicanal placas lavar três vezes em PBS estéril (200 mL por poço). Alternativamente, use uma lavadora automática de microtitulação. Entre as lavagens, e particularmente após a última lavagem, escorrer as placas em posição invertida por blotting com toalhas de papel para remover qualquer PBS residual. Neste ponto biofilmes formados no fundo dos poços deve ser claramente visível mesmo a olho nu e também pode ser visualizado através de um microscópio invertido (Figura 1). Biofilmes está agora pronto para ser processada para os testes de testes de susceptibilidade antifúngica. (Se o principal objetivo do experimento é avaliar a extensão da formação de biofilme, as placas estão prontas para serem processadas utilizando o método colorimétrico. Para isso, o reagente XTT / menadiona (consulte a Etapa 3 abaixo) pode ser adicionado ea cor resultante ler usando um leitor de placas de microtitulação). </li></ol> 3. Testes de Susceptibilidade antifúngica de Biofilmes <ol><li> A partir de soluções estoque ou em pó, prepare uma solução de trabalho em meio RPMI 1640 de cada antifúngico a ser testado. Típico altas concentrações são 1.024 mcg / mL para fluconazol, e 16 mcg / mL para ambos anfotericina B e caspofungina. Outras concentrações podem ser usados ​​para diferentes agentes. </li><li> Usando uma pipeta multicanal, adicione 200 mL da alta concentração de trabalho de antifúngicos aos poços correspondentes na coluna 1 de cada placa de microtitulação contendo biofilmes de fungos. </li><li> Adicionar 100 mL de RPMI 1640 em cada poço nas colunas 2 a 10. </li><li> Adicionar 100 mL de RPMI 1640 para poços na coluna 11. </li><li> Remover 100 mL de agente antifúngico dos poços da coluna 1 e adicione aos poços adjacentes na coluna 2 (já contendo 100 mL de meio). </li><li> Misture o conteúdo bem pipetando cima e para baixo para realizar uma diluição de duplicação de série, e retire as pontas. </li><li> Repita se movendo para a direita até os poços da coluna 10, após o qual o volume de 100 mL finais dos poços da coluna 10 após a mistura é descartado. Desta forma, uma série de diluições de seu agente (-s) de interesse foram criados, a partir de mais concentrada em poços da coluna 1 para o menos concentrado em poços da coluna 10. Biofilmes incontestado na coluna 11 servirá como controle positivo, e poços vazios na coluna 12 servirão como controles negativos. </li><li> Cobrir as placas com suas tampas, vedação com parafilme e incubar por 24 -48 h a 37 ° C. </li><li> Após o período de incubação, lavar os pratos como na Etapa 2,4 antes (3 x PBS). </li><li> Usando uma pipeta multicanal adicionar 100 mL de XTT / menadiona solução para cada poço contendo um biofilme pré-lavados, bem como para poços de controlo negativo para a medição de fundo XTT-colorimétrico níveis. <ol><li> O XTT é preparado como uma solução saturada, 0,5 g / L de lactato Ringer estéril, a PBS ou salina, que precisa ser esterilizada por filtração, usando um filtro de 0,22 mM tamanho de poros. A solução XTT é sensível à luz, por isso deve ser coberto com papel alumínio durante a preparação. Depois de preparado e esterilizada por filtração, alíquota, em 10 mL volumes de trabalho, e armazenar a -70 ° C. Proteger os tubos de luz usando uma folha de alumínio. Descongele somente como tubos que forem necessárias para uma experiência especial pouco antes de usar. </li><li> Menadiona é preparado como uma solução estoque 10 mM em acetona 100%, aliquotado em volumes menores (cerca de 50 mL) e armazenados a -70 ° C. Prepare a solução XTT / menadiona pouco antes de usar, adicionando 1 mL da solução estoque de menadiona a um tubo contendo 10 mL da solução XTT descongelado. </li></ol></li><li> Cobrir as placas em papel alumínio e incubar no escuro por 2 h, a 37 ° C. </li><li> Descubra as placas. Usando uma pipeta multicanal remover 80 mL do sobrenadante resultante cor de cada bem e transferir para os poços correspondente de uma nova placa de microtitulação. </li><li> Leia a placa (-s) em um leitor de placas de microtitulação a 490 nm. </li><li> Calcular a concentração inibitória mínima sésseis SMIC50 e SMIC80, que são as concentrações antifúngicas em que uma diminuição de 50% ou 80% em leituras colorimétricas são detectados em comparação com o controle de biofilmes formados na ausência de drogas antifúngicas (neste caso, os valores para a coluna 11 , lembre-se também para subtrair valores de controles negativos de poços na coluna 12 XTT contendo apenas). SMIC resultados podem ser apresentados como uma tabela (ou seja, isola múltiplas contra antifúngicos múltipla) ou, alternativamente, os resultados individuais para cada fúngicas isolar uns contra os antifúngicos pode ser apresentado como um gráfico plotando inibição por cento versus concentração de antifúngico. </li></ol> Exemplo: Depois de subtrair os valores no controle negativo, o OD média de biofilmes controle formado na coluna 11 é 1.32. O SMIC50 é a menor concentração antifúngicos levando a uma redução&gt; 50% em leituras colorimétricas, neste caso, menos de 1,32 x 50/100 = 0,66. Da mesma forma, o SMIC80 é a menor concentração antifúngicos levando a uma redução&gt; 80% em leituras colorimétricas, neste caso, menos de 1,32 x 20/100 = 0,264. 4. Resultados representante A Figura 1 mostra uma microfotografia de um C. albicans biofilme formado no fundo de um poço em uma placa de microtitulação de 96 poços realizadas em microscópio invertido. A Figura 2 mostra XTT-colorimétrico leituras (OD 490 valores) para cada um dos 11 biofilmes de C. albicans cepa selvagem formado em cada uma das 8 linhas diferentes da mesma placa de microtitulação de 96 poços. A Figura 3 mostra a atividade de anfotericina B em diferentes concentrações contra C. albicans biofilmes; setas indicam SMIC50 e SMIC80 valores. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) Painel A mostra uma microfotografia tiradas com uma câmera acoplada a um microscópio invertido de um C. albicans biofilme formado no fundo do poço após a aspiração de meio RPMI e lavagens subsequentes com PBS. (B) A micrografia de um típico C. albicans biofilme visualizados através de microscopia eletrônica de varredura. Barras são 100 mm e 10 mm para os painéis A e B, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Formação de múltiplas equivalente C. albicans biofilmes em placas de 96 poços de microtitulação. leituras colorimétrico (OD 490 valores) de XTT-redução de ensaios de biofilmes formados por um C. albicans tipo selvagem em poços de placas de microtitulação. Os valores são de 11 biofilmes independente formada em cada uma das 8 linhas diferentes da mesma placa de microtitulação de 96 poços. Resultados para as linhas diferentes foram comparados por meio da análise de variância e pelo teste de Bartlett para homogeneidade de variâncias e comparação múltipla de Bonferroni pós-teste. Diferenças estatisticamente significativas foram observadas quando se comparam todos os pares de linhas entre si (P&gt; 0,05). <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Os resultados típicos dos testes de susceptibilidade antifúngica contra C. albicans biofilmes Gráfico. retratando os resultados típicos da eficácia de diferentes concentrações de anfotericina B contra biofilmes de C. albicans cepa selvagem. Os valores estão expressos em porcentagem média leituras colorimétrico para XTT redução de ensaios em relação ao controle de poços. SMIC50 e SMIC80 valores são indicados por setas.

<ol><li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).</li>
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<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pharmacodynamic+properties+of+three+antifungal+agents+against+preformed+Candida+albicans+biofilms+determined+by+time-kill+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+endpoint+determination+system+for+antifungal+susceptibility+testing+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).</li>
<li>Nett, J., Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+development%2C+modeling+a+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).</li>
</ol>

JLL-R possui capital em MicrobeHTS Technologies, Inc., que está desenvolvendo antifúngicos. MicrobeHTS Technologies, Inc. não forneceu apoio financeiro para estes estudos.

Aqui nós descrevemos um método simples, rápido, econômico e altamente reprodutível 96 modelo da placa de microtitulação bem para a formação de biofilmes de Candida juntamente com um método colorimétrico que mede a atividade metabólica de células dentro do biofilme usando XTT. Este modelo de 96 placa de microtitulação bem para a formação de biofilme foi originalmente desenvolvido para C. albicans, mas pode ser usado para outras Candida spp. e facilmente adaptado para outros organismos fúngicos....

<table><tbody><tr><td>Ágar Sabouraud-dextrose</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>Para preparar placas para subculturas frescas de isolados fúngicos</td></tr><tr><td>YPD: Extrato de levedura, peptona e dextrose</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>Meio para propagação de culturas líquidas de crescimento noturno</td></tr><tr><td>RPMI-1640 sem bicarbonato de sódio suplementado com L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>Meio líquido para formação de biofilmes</td></tr><tr><td>Ácido morfolinopropanossulfônico (MOPS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>Para tamponar o RPMI 1640</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tampão para lavagens</td></tr><tr><td>Sal sódico de XTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>Ver acima as instruções de preparação</td></tr><tr><td>Lactato de Ringer&amp;rsquo;s</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>Para preparação da solução de XTT</td></tr><tr><td>Menadiona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>Atenção: perigoso por contato dérmico, inalação ou ingestão</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de centrífuga de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de centrífuga de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Placas de microtitulação de 96 poços: Poliestireno, fundo plano, tratadas para cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal e ponteiras</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estufa de incubação</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leitora de placas de microtitulação</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a 96 bem microtitulação método da placa com base para a formação monitoramento e teste de susceptibilidade antifúngica de candida albicans biofilmes

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans continua a ser a causa mais freqüente de infecções fúngicas em uma população em expansão de pacientes comprometidos e candidíase é agora o terceiro mais comum de infecção nos hospitais dos EUA. Diferentes manifestações da candidíase são associados com a formação de biofilme, tanto em tecidos do hospedeiro e / ou dispositivos médicos (cateteres, por exemplo). Formação de biofilme carrega negativas implicações clínicas, como as células dentro do biofilme estão protegidos das respostas imune do hospedeiro e da ação de antifúngicos. Nós desenvolvemos um modelo simples, rápido e robusto in vitro para a formação de C. biofilmes albicans utilizando 96 poços de microtitulação-pratos, que também pode ser usado para testes de susceptibilidade antifúngica do biofilme. A leitura deste ensaio é colorimétrico, baseado na redução de XTT (um sal de tetrazólio) por células metabolicamente ativas biofilme fúngicas. Um experimento típico dura cerca de 24 h para a formação de biofilme, com 24 h adicionais para testes de susceptibilidade antifúngica. Devido à sua simplicidade e à utilização de materiais de laboratório comumente disponíveis e equipamento, esta técnica democratiza pesquisa biofilme e representa um passo importante para a padronização dos testes de susceptibilidade antifúngica de biofilmes de fungos.

Nós descrevemos um método simples, rápido e robusto para a formação de<em&gt; Candida albicans</em&gt; Biofilmes usando 96 placas de microtitulação bem e sua utilidade em testes de susceptibilidade antifúngica de células dentro de biofilmes.

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

A *Candida albicans* continua a ser a causa mais frequente de infeções fúngicas numa população crescente de doentes comprometidos, e a candidíase é agora a terceira...

O objetivo geral deste procedimento é formar biofilmes de Candida albicans e examinar sua suscetibilidade a agentes antifúngicos. Isso é realizado primeiramente formando esses biofilmes fúngicos nos poços de placas de microtitulação de 96 poços; em seguida, antifúngicos são adicionados aos biofilmes pré-formados e incubados por 24 a 48 horas após essa incubação.Um método colorimétrico que mede a atividade metabólica de células dentro dos biofilmes é utilizado para avaliar a atividade desses antifúngicos, com o objetivo de determinar a concentração inibitória mínima de antifúngicos contra biofilmes. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a capacidade de formação de biofilmes e a realização de testes de suscetibilidade antifúngica por meio de um método simples e fácil baseado em placas de microtitulação de 96 poços, acoplado a leitura colorimétrica. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, relativamente barata, altamente reprodutível e permite a formação de múltiplos biofilmes equivalentes.Além disso, é compatível com a tecnologia de plataforma de 96 poços comumente disponível na maioria dos laboratórios de pesquisa e clínicos. As implicações desta técnica estendem-se à terapia de canídeos. Uma vez que, com muita frequência, essas infecções estão associadas à formação de biofilme.Utilizando técnicas apropriadas de manipulação microbiológica, retire um alça cheia de células de uma subcultura fresca de albicans em placa de cobre dextrose SAU Alan e inocule em um frasco erlenmeyer de 125 mililitros contendo 25 mililitros de caldo peptona dextrose levedura. Coloque a cultura em um agitador orbital ajustado a 180 RRM e 30 graus Celsius, e incube durante a noite. Após a incubação noturna, despeje as culturas de levedura em tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue a 3000 RMB por cinco a 10 minutos. Descarte o sobrenadante e vortex.Agite vigorosamente o pellet para desagregar as células. Em seguida, adicione PBS estéril para lavar antes de centrifugar novamente as culturas. Repita este passo de lavagem mais uma vez antes de ressuspender as células.Em cerca de 20 mililitros de RPMI 1640, meio tamponado a pH 7,0. Usando uma solução de mops 165 milimolar e pré-aquecida a 37 graus Celsius a partir desta suspensão, prepare uma diluição de um para 100 usando um hemocitômetro padrão e um microscópio de campo claro. Conte as células.Em seguida, prepare uma suspensão final de células a uma concentração de um vezes 10 elevado a seis por mililitro em RPMI 1640 tamponado e aquecido. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros da suspensão de *C. albicans* aos poços selecionados de uma placa estéril de 96 poços com fundo plano. Deixe os poços da coluna 12 vazios, pois eles servirão como controles negativos.Após cobrir e selar a placa com paraform, incubar a 37 graus Celsius por 24 horas para permitir a formação dos biofilmes. Após a incubação, aspirar suavemente e descartar o meio de cada poço, tomando cuidado para não perturbar os biofilmes formados no fundo.Para lavar, adicione 200 microlitros de PBS em cada poço e remova o líquido invertendo cuidadosamente a placa e pressionando-a sobre uma pilha de toalhas de papel. Repita este passo de lavagem três vezes. Neste momento, os biofilmes são detectáveis a olho nu e podem ser visualizados usando um microscópio invertido com MEV.Pode-se observar que os biofilmes consistem em uma mistura entrelaçada de filamentos e células leveduriformes. Uma vez verificada a formação do biofilme, pode-se iniciar os testes com agentes antifúngicos utilizando meio RPMI 1640 tamponado; prepare soluções estoque em alta concentração dos agentes antifúngicos a serem testados. Concentrações típicas elevadas são 1024 microgramas por mililitro para fluconazol e 16 microgramas por mililitro para anfotericina B e CASPO fungi beri.Em seguida, adicione 200 microlitros de soluções antifúngicas aos poços da coluna um e 100 microlitros de meio RPMI 1640 tamponado aos poços das colunas dois até onze. Realize uma série de diluições sucessivas de duplicação transferindo 100 microlitros das soluções antifúngicas de alta concentração dos poços da coluna um para os poços da coluna dois.Após pipetar suavemente para cima e para baixo para misturar, pipete 100 microlitros dos poços da coluna dois para os da coluna três e assim por diante até a coluna 10. Não adicione qualquer solução antifúngica à coluna 11, pois ela servirá como controle positivo, e descarte os últimos 100 microlitros dos poços da coluna 10. Todos os poços, exceto os da coluna 12.Deve-se agora ter um volume final de 100 microlitros. Cubra a placa, feche-a com parafilm e incube-a a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas para permitir a ação dos antifúngicos após a incubação. E depois de lavar a placa três vezes em PBS conforme descrito anteriormente, adicione 100 microlitros de solução de XTT medion por poço a todos os poços, incluindo os poços de controle negativo.Na coluna 12. Cubra a placa, envolva-a em papel alumínio para protegê-la da luz e incube-a a 37 graus Celsius por duas horas. Após a incubação, para permitir o desenvolvimento da cor, desenrole a placa.A solução inicialmente clara de XTT terá se tornado laranja após ser processada por células metabolicamente ativas. Transfira 80 microlitros dos sobrenadantes coloridos para uma nova placa de microtitulação com fundo plano. Utilize um leitor de placas de microtitulação colorimétrico ajustado em um comprimento de onda de 490 nanômetros para ler a placa conforme mostrado aqui. Na ausência de antifúngicos, as leituras colorimétricas não foram tratadas.Os biofilmes do candidato SEA em diferentes linhas são equivalentes. Para avaliar primeiro o efeito dos compostos antifúngicos testados, subtraia um valor médio de fundo obtido das cavidades do controle negativo na coluna 12 de todos os outros valores. Em seguida, calcule a porcentagem de inibição utilizando os controles positivos na linha 11.Como valores máximos, as concentrações antifúngicas nas quais é detectada uma redução de 50% ou 80% nas leituras colorimétricas são conhecidas como concentrações inibitórias mínimas de Cecil. Esses valores são tipicamente usados como medida de referência da potência de um composto. Utilizando este método simples de alto rendimento, biofilmes fúngicos podem ser formados in vitro em 24 horas, e compostos selecionados podem ser testados quanto à atividade antifúngica após seu desenvolvimento inicial.Essa técnica abriu caminho para que pesquisadores na área da micologia médica explorassem a formação de biofilmes e examinassem a atividade de agentes antifúngicos. Novamente, as células em biofilmes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O ensaio descreve um meio rápido de medir a formação de biofilme no início de bactérias e fungos. Este método utiliza uma placa de microtitulação, como o substrato para formação de biofilme microbiano, e do biofilme é visualizada utilizando cepa cristal violeta. O ensaio fornece tanto um ensaio qualitativo ou quantitativo para a formação de biofilme cedo.

Dish microtitulação Assay formação de biofilme

Nós desenvolvemos uma plataforma de microarray de alta densidade que consiste em 3D nano-biofilmes...

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para rastrear compostos antifúngicos usando um ensaio de microdiluição em caldo. Os compostos de teste são diluídos em série em uma placa de microtitulação e incubados com um inóculo fúngico. Após a incubação, a placa é examinada em busca de poços sem crescimento fúngico visível para avaliar o potencial antifúngico dos compostos de teste e sua concentração inibitória mínima (CIM).

Um ensaio de microdiluição em caldo in vitro para a triagem de compostos antifúngicos

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estudar o efeito de anticorpos em biofilmes fúngicos. O fungo patogênico Candida tropicalis secreta um fator de virulência secretado pela aspartil proteinase 2 (Sap2), facilitando a formação de biofilme. Após a introdução de um soro inativado pelo calor contendo anticorpos específicos para Sap2 que inibem a maturação do biofilme, a viabilidade das células fúngicas é avaliada por meio de um ensaio cromogênico.

Um ensaio in vitro para avaliar o efeito de anticorpos no biofilme de Candida tropicalis

Apresentamos um procedimento experimental de desenvolvimento de biofilme de Candida albicans em um modelo subcutâneo de camundongo. Os biofilmes fúngicos foram quantificados pela determinação do número de unidades formadoras de colônias e por uma imagem de bioluminescência não invasiva, onde a quantidade de luz produzida corresponde ao número de células viáveis.

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

Este protocolo descreve o uso de um dispositivo personalizável microfluidic automatizado para visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans sob condições fisiológicas do hospedeiro.

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Um fácil e adaptável como caldo para a seleção de extratos e compostos antifúngicos.

Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos

Aqui, apresentamos um protocolo gradual para investigar a respiração mitocondrial e função glicolítico em Candida Albicans usando um analisador de fluxo extra.

Investigação de bio-energética de Candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise

Para visualizar e quantificar as características internas dos biofilmes candida albicans, preparamos amostras intactas fixas que são esclarecidas pela correspondência de índice simétrico. Em seguida, a microscopia de secção óptica pode ser usada para obter dados de imagem tridimensionais, embora a espessura total do biofilme.

Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

Este protocolo descreve um método para a obtenção de dados quantitativos sobre a atividade antifúngica de peptídeos e outros compostos, como agentes antifúngicos de moléculas pequenas, contra Candida albicans. Seu uso de densidade óptica em vez de contar unidades formadoras de colônias para quantificar a inibição do crescimento economiza tempo e recursos.

Quantificando a atividade antifúngica de peptídeos contra Candida albicans

Um protocolo baseado em placa de microtitulação de 96 poços usando um ensaio de redução de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilidade-2H-tetrazólio (XTT) é descrito neste documento, para estudar os efeitos de anticorpos em biofilmes formados por C. tropicalis. Este protocolo in vitro pode ser usado para verificar o efeito de potenciais novos compostos antifúngicos sobre a atividade metabólica de células de espécies de Candida em biofilmes.

Um ensaio de redução solúvel à base de tetrazólio para avaliar o efeito de anticorpos em biofilmes de Candida tropicalis

Aprenda a formar biofilmes de Candida albicans em placas de microtitulação de 96 poços para testar a susceptibilidade antifúngica. Este método colorimétrico reprodutível e de baixo custo permite avaliar a atividade metabólica e determinar a concentração inibitória mínima.

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes (Vídeo) | JoVE Journal

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

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