Name: Uma Introdução ao Lab Worm: de Worms Cultivar a mutagênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a cultivar Pristionchus pacificus e realizar mutagênese por EMS e TMP/UV para identificar genes envolvidos em processos biológicos. Este método auxilia pesquisadores em estudos genéticos.

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Este trabalho foi financiado pela NSF conceder IOB # 0615996.

Parte 1: Preparando o crescimento da mídia nematóide (NGM) placas de Petri Nematóides experimentais como C. elegans e P. pacificus são normalmente cultivadas em laboratório em 6 placas de Petri contendo meio centímetro Nematóides do Crescimento (NGM) 1. Worms são mantidos a 20 ° C, mas pode ser incubado a uma gama de temperaturas (entre 4 ° C - 25 ° C), dependendo da espécie de nematóides e design experimental. Para preparar pratos com NGM, standard técnicas estéreis devem ser utilizados para evitar a contaminação por fungos e bactérias. Segue-se o protocolo para preparar placas NGM: <ol><li> Pesar 15 g de ágar, 2,4 g NaCl, 2 g Triptona, e 2,72 g KH 2 PO 4 em 2 L frasco cônico, fazer volume até 1 L com autoclave, água e deixe-o esfriar até 60 ° C em banho-maria. </li><li> Adicione 0,8 ml cada, de 1 M CaCl 2, colesterol (5 mg / ml em etanol) e 1 M MgSO 4. Para evitar a contaminação por fungos e bactérias, 1 estreptomicina ml (100 mg / ml) e nistatina 1ml (10 mg / ml) podem ser adicionados a cada litro de meio. </li><li> Usando uma máquina Unispense e manter condições estéreis, despeje a mídia nas placas desejado. As placas devem ser preenchidos para cerca de 2 / 3 rd completo. Um padrão de 60 mm de diâmetro placa requer cerca de 10 ml dos meios de comunicação. Não mova as placas até que o ágar esteja completamente gelified, caso contrário haverá uma superfície irregular de agar, o que torna difícil se concentrar worms na estereomicroscópio. </li><li> Depois de secas, as placas podem ser semeadas imediatamente ou armazenados a 4 ° C até a semeadura com bactérias. </li></ol> Parte 2: Preparando OP50 bactérias e semeadura placas NGM Petri P. pacificus é cultivado em laboratório, alimentando a tensão OP50 E.coli. OP50 tem um crescimento limitado em placas NGM, formando um gramado fino que facilita a visualização dos worms 1. A crescer uma cultura de OP50, use o caldo LB: <ol><li> Adicionar 5 g bactotryptone, 2,5 g de extrato de levedura e 2,5 g de NaCl para um frasco de 500 ml tampa de rosca, faça aumentar o volume para 500 ml com água destilada e autoclave. </li><li> Inocular o caldo com uma única colônia de OP50 da placa de cultura em condições estéreis e deixá-lo crescer overnight a 37 ° C. </li><li> LB-OP50 está pronto para ser usado e pode ser armazenado a 4 ° C durante vários meses, se a esterilidade é mantida. Sempre que as placas precisam ser semeados, despeje uma pequena quantidade do caldo em um copo pequeno estéril e isso vai ajudar a evitar a contaminação da cultura estoque. </li><li> Para placas de semente, dispensar 100-120 mL da OP50 para a 60 mm de diâmetro NGM placa de Petri e agite para espalhá-lo. </li><li> Incubar estas placas semeadas durante a noite a temperatura ambiente para o relvado a crescer. Estas placas semeadas agora podem ser armazenados a 4 ° C por até 3 semanas. Armazenando-os em uma posição invertida ajuda a evitar uma secagem rápida. </li></ol> Parte 3: Fazendo uma picareta Nesta seção descrevemos como fazer uma escolha para vermes. A picareta é usado para transferir worms de um local para outro. A escolha é feita de 30 a 90% fio de platina irídio calibre 10%, embora alguns pesquisadores podem preferir composições de metal ligeiramente diferente: <ol><li> Cortar cerca de 3-4 cm de fio, coloque 0,5 cm de la dentro a ponta de uma pipeta Pasteur (cuja ponta foi quebrada a um menor comprimento), e depois selá-la no vidro sobre um bico de Bunsen. O comprimento do fio saindo do vidro é de cerca de 3-3,5 cm, mas pode variar de acordo com as preferências individuais. </li><li> Achatar a extremidade do fio que está saindo com um martelo ou alicate. Em seguida, dobre para cima porção achatada para formar uma colher. </li><li> Suavizar as bordas afiadas da pick com uma lixa para evitar danos ao worm ou o ágar. </li></ol> Parte 4: worms Picking <ol><li> Para escolher worms, esterilizar o fio de platina em uma chama e arraste a ponta achatada da pick ao longo do gramado bacteriana para revestir a ponta com espessura bactérias pegajoso, tomando cuidado para não perfurar ou danificar a superfície do ágar. </li><li> Usando o estereomicroscópio, muito levemente a ponta da escova pegajosa contra os vermes worm / para ser escolhido até o worm varas para as bactérias na escolha. </li><li> Uma vez que o worm está na ponta da picareta, transferi-lo imediatamente para a nova placa tocando ou deslizando a ponta da picareta contra o gramado bacteriana da placa de novo, eo bicho deve rastrear off. Cuidados devem ser tomados para não danificar a superfície do agar na placa mais os vermes rastejam nos orifícios que torna difícil recuperá-los. Se o worm permanece na escolha por muito tempo, ele pode desidratar. </li></ol> Parte 5: EMS mutagênese Etílico metano sulfonato (EMS) induz a um amplo espectro de mutações no genoma do 2. Mutantes podem ser identificados por defeitos como a postura de ovos, defeitos muscularess, a determinação do sexo, formação Dauer, comportamento e formação das gônadas. O protocolo para EMS mutagênese é semelhante ao descrito para C. elegans 1. <ol><li> Prepare 500 ml (ou mais) de NaOH 1N. </li><li> Tome 4-5, 6 cm de diâmetro placas de Petri cheia de vermes, contendo algumas centenas de worms na terceira larval juvenil (J3) palco e lavar os worms fora de usar 2-3 ml de M9 estéril por placa. </li><li> Recolher todos os worms em uma estéril, descartável tubo de centrifugação de 15 ml. Centrifugar a 1500 xg por 5-7 minutos ou até que os vermes formam uma pelota. </li><li> Aspirar o líquido e usar 2 ml de M9 para re-suspender os vermes. Adicionar 20 mL EMS para um tubo contendo 2 ml de M9 e agite para dissolvê-lo. Em seguida, adicione esta solução EMS ao 2ml de suspensão worm e homogeneizar suavemente. A concentração final da EMS será 47 mM. Atenção: A EMS é um mutagênico muito forte e deve ser tratado em uma capela. Todos os materiais (luvas, pipetas, dicas) que entram em contato com este agente mutagénico deve ser tratada com NaOH 1N para inativo da EMS. Usar luvas duplo durante todo o procedimento mutagênese EMS. Descarte os resíduos perigosos de acordo com as diretrizes da instituição. </li><li> Coloque o tubo de centrifugação e cobrir a tampa com parafilme; colocá-lo horizontalmente no extractor de fumo e deixar as minhocas incubar por 3,5 horas. O tubo também pode ser colocado em um rocker de baixa velocidade. </li><li> Vire o tubo e cobrir a tampa com parafilme; lugar na posição vertical e incubar até que o dissipador worms. </li><li> Aspirar o sobrenadante e descartá-lo em um copo / frasco contendo NaOH 1N. Isto irá desativar o EMS. </li><li> Adicionar 5 ml M9 aos vermes, inverter o tubo 25-30 vezes para lavar os worms, centrifugar a 1500 xg por 5-7 minutos ou até que os vermes formam uma pelota. Aspirar o sobrenadante e descartar no copo NaOH 1N. </li><li> Repita o passo de lavagem, pelo menos, três vezes. </li><li> Após a lavagem final, re-suspender o worm sedimento em quantidade mínima (~ mL 500) de M9 e pipeta-los em placas NGM contendo um gramado de OP50 bactérias. Neste ponto, você não precisa mais trabalhar no bairro química. </li><li> Deixe o líquido secar por alguns minutos e em seguida, escolher e transferência de aparência saudável J4 larvas de placas semeadas frescas. Descarte a placa original de acordo com as diretrizes da instituição resíduos perigosos. </li><li> Deixe o auto worms mutagenizados fertilizar. Usando um microscópio estereoscópico, a tela do fenótipos geração F2 para mutantes recessivos de interesse. </li></ol> Parte 6: Psoralen mutagênese Nesta seção, vamos descrever o processo de mutagênese com TMP em conjunto com comprimento de onda ultravioleta longo (UV). TMP / UV método de mutagênese é amplamente utilizado para induzir mutações exclusão dentro de um genoma 3. <ol><li> Coletar worms 4-5, 6 cm de diâmetro placas de Petri em um tubo de centrifugação de 15 ml, conforme descrito no procedimento anterior. </li><li> Adicionar 10 ml M9, inverter 20 vezes a lavar os worms, e centrifugar a 1500 xg por 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e repetir a lavagem para um total de 3 vezes. Aspirar o líquido e re-suspender a worms em cerca de 10 vezes o seu volume de M9 contendo 30 mg / ml de TMP. Pipeta mL 20 de TMP (3 mg / ml) em 2 ml de M9. Como EMS, TMP é um carcinógeno potente e deve ser tratada tomando medidas de segurança apropriadas. Para evitar de risco potencial do olho luz UV adequada usa deve ser usado. Os materiais descartáveis ​​devem ser descartados em sacos adequados biohazard. </li><li> Incubar o tubo no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente em um rocker de baixa velocidade (40 UPM). Definir o tubo coberto verticalmente por 10 minutos para deixar tudo afundar o worms. </li><li> Remover os vermes do fundo do tubo com uma pipeta Pasteur e transferi-los para uma placa NGM unseeded. Desprezar o sobrenadante seguir as diretrizes da instituição químicos perigosos. </li><li> Manter a placa no escuro até o TMP excesso é absorvido pela placa. </li><li> Usando um medidor de intensidade de UV, definir a distância entre a fonte de UV de onda longa ea placa de tal forma que a intensidade na placa é de 500 μW / cm 2 4. Remova a tampa de alumínio ea tampa e cobrir e expor a placa contendo os vermes TMP tratados à radiação UV de onda longa por 50 segundos. </li><li> Cubra e deixe os vermes no escuro por 5 horas em temperatura ambiente. </li><li> Escolha e transferência de aparência saudável J4 larvas de placas semeadas frescas. Descarte a placa original após as diretrizes da instituição químicos perigosos. </li><li> Usando um microscópio estereoscópico, a tela do fenótipos geração F2 para a mutação de seu interesse. </li></ol> Parte 7: Resultados Representante Alguns dos P. fenótipos pacificus mutante resultante da mutagênese (seja por EMS ou TMP / UV) são mostrados na Figura 1. Cada mutante tem um fenótipo característico que é facilmente distinguível do animal do tipo selvagem. Do wormsque foram tratados com o mutagênico, 30 larvas J3/J4 da geração parental (P0) foram colocados em pratos separados e permitiu a pôr ovos, que são a geração F1. Das placas que mostrou progênie F1 saudável, um total de 1000 F1s foram transferidos para placas individuais ea progênie F2 foi exibido para os fenótipos. Animais com Dumpy 5,6, 6 e 7 descoordenada Transformer fenótipos foram encontrados. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pristionchus tipo pacificus selvagens e animais mutantes. A. wt wt hermafrodita masculino B. C. D. DPY mutante unc mutante E. tra mutante. Top dois painéis mostrando tipo selvagem hermafrodita (esquerda) e macho (à direita) animais para comparar com os mutantes diferentes nos painéis restantes.

<ol><li>Brenner, S. Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Anderson, P. Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li>
<li>Pires-daSilva, A. WormBook. , 1-1 (2005).</li>
<li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Mutagênese é uma técnica amplamente empregada para estudos genéticos em vários organismos modelo experimental. Experimentos de mutagênese são freqüentemente usados ​​para identificar a função de um gene 2. Os procedimentos de mutagênese descritos aqui podem ser usados ​​não apenas para P. pacificus, mas também para C. elegans e de outras espécies de nematóides relacionados. Aqui nós descrevemos dois métodos, EMS e TMP / UV mutagênese. EMS é uma substância química...

uma introdução ao lab worm: de worms cultivar a mutagênese

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Este protocolo descreve os procedimentos para manter a nematóides em laboratório e como induz mutações los usando dois métodos alternativos: o metano sulfonato de etila (EMS) e 4, 5, 8-trimethylpsoralen combinada com luz ultravioleta (TMP / UV). Nematóides são poderosos sistemas biológicos para estudos genéticos por causa de seu plano corporal simples e sistema de acasalamento, que é composto de auto-fertilização hermafroditas e homens que podem gerar centenas de descendentes por animal. Nematóides são mantidos em placas de ágar contendo um gramado de bactérias e podem ser facilmente transferidos de uma placa para outra usando uma picareta. EMS é um agente alquilante comumente usado para induzir mutações pontuais e pequenas deleções, enquanto TMP / UV induz principalmente exclusões. Dependendo da espécie de nematóide sendo usado, as concentrações de EMS e TMP terá que ser otimizado. Para isolar mutações recessivas do nematóide pacificus Pristionchus, os animais da geração F2 foram selecionados para fenótipos visualmente. Para ilustrar esses métodos, mutagenizados worms e olhou para a falta de coordenação (Unc), Dumpy (DPY) e Transformer (Tra) mutantes.

Triagem de mutantes com defeitos fenotípicos é um método simples para identificar genes que funcionam em um determinado processo biológico. Neste artigo vamos descrever como worms cultura livre vivos (por exemplo,<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) No laboratório e mostrar dois métodos diferentes mutagênese, EMS e TMP UV /.

Uma Introdução ao Lab Worm: de Worms Cultivar a mutagênese

Este protocolo descreve procedimentos para a manutenção de nematódeos em laboratório e como mutagenizá-los utilizando dois métodos alternativos: etilmetano...

O objetivo geral deste procedimento é realizar dois protocolos diferentes de mutagênese frequentemente utilizados para gerar mutantes e nematoides, como ceno, hepatitis elegance e prisca. A mutagênese por pacificus é uma ferramenta poderosa para revelar a função de genes. Isso é realizado primeiramente preparando culturas com grande número de vermes no último estágio larval antes da fase adulta, com os quais a mutagênese será realizada.O próximo passo é realizar mutagênese nos vermes utilizando dois procedimentos alternativos: tratamento com metano sulfonato de etila ou mutagênese por raios ultravioleta em conjunto com calor. O terceiro passo do procedimento consiste em transferir vermes com aparência saudável para placas de ágar, recentemente semeadas com bactérias, que constituem a fonte alimentar. O passo final do procedimento é realizar triagem para fenótipos mutantes de interesse na primeira, segunda ou terceira geração.Olá, sou Jore do laboratório do Dr. Andre Perez, o Silva do Departamento de Biologia da Universidade do Texas em Arlington. Os procedimentos de mutagênese T-M-P-U-V e EMS ajudam a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa genética, como quais genes estão envolvidos em processos biológicos que desempenham um papel importante durante o desenvolvimento. Olá, meu nome é Manish Phar. Embora os métodos de mutagênese demonstrados sejam para Pristi Onca S Pacificus, eles podem ser muito comumente empregados em outros modelos experimentais, como o nematódeo C. elegans, e até em vertebrados como o peixe-zebra.Então vamos começar. Nosso instrumento para transferir vermes de um local para outro é feito de fio de 30 graus, com 90% de platina e 10% de irídio. Embora alguns pesquisadores possam preferir composições metálicas ligeiramente diferentes para fabricar um instrumento, uma pipeta de Pasteur também é utilizada para segurar o instrumento.Comece quebrando a ponta alongada da pipeta de pasteur até o comprimento desejado. Corte cerca de três a quatro centímetros de fio e coloque 0,5 centímetros dele dentro da ponta da pipeta de pasteur. Sobre um bico de Bunsen, feche o fio no interior do vidro da ponta.O comprimento do fio que sobressai do vidro é de cerca de três a três e meio centímetros, mas pode variar de acordo com as preferências individuais. Aplane a extremidade do fio saliente usando alicate. Em seguida, dobre a parte aplanada para cima, formando uma espécie de concha.Por fim, alise as bordas afiadas do pinça com lixa para evitar danificar o verme ou o ágar. Para coletar vermes, esterilize o fio da pinça em uma chama e, em seguida, arraste a ponta achatada ao longo de um gramado bacteriano em uma placa NGMP para revestir a ponta com bactérias espessas e adesivas. Tenha cuidado para não perfurar ou danificar a superfície do ágar, utilizando um microscópio estereoscópico com muita leveza.Passe a ponta adesiva contra o verme que será coletado até que o verme adira às bactérias na alça. Uma vez que o verme esteja na ponta da alça, transfira-o imediatamente para a nova placa tocando ou deslizando a ponta da alça sobre o gramado bacteriano da nova placa. É necessário ter cuidado para não danificar a superfície de ágar da placa, onde os vermes podem entrar nos orifícios e se tornar difíceis de recuperar.O verme deve sair do palito quando você tocar ou deslizar a ponta do palito contra o gramado bacteriano. O verme não deve permanecer no palito por muito tempo, pois pode dessecar. Demonstraremos a mutagênese com EMS em quatro a cinco placas de Petri de seis centímetros de diâmetro com vermes de prisca pacificus no terceiro estágio larval juvenil.Lave os vermes de cada placa usando dois a três mililitros de M nove estéril por placa. Deve haver algumas centenas de vermes. Colete os vermes em um tubo cônico estéril descartável de 15 mililitros.Centrifugue a 1500 Gs durante cinco a sete minutos ou até que os vermes formem um pellet. Aspire o líquido e use dois mililitros de M nove para ressuspender os vermes, usando luvas duplas e trabalhando em uma capela de exaustão. Adicione 20 microlitros de EMS a um tubo contendo dois mililitros de M nove e agite para dissolver. Em seguida, adicione esta solução a dois mililitros de suspensão de vermes e misture suavemente com movimentos de rotação.A concentração final de EMS será de 47 milimolar. Coloque o tubo de centrífuga com paraform em um agitador de baixa velocidade na capela e deixe os vermes incubarem por três horas e meia. Ao final da incubação de três horas e meia, coloque o tubo na posição vertical e incube até que os vermes sedimentem; em seguida, aspire o sobrenadante e descarte-o em um béquer contendo hidróxido de sódio 1 N para inativar o EMS no sobrenadante.Cada vez antes de retirar as mãos da cabine de segurança, certifique-se de também enxaguá-las em hidróxido de sódio um normal. Para inativar o EMS, adicione cinco mililitros de M nove aos vermes. Inverta o tubo de 25 a 30 vezes para lavar os vermes e centrifugue a 1500 Gs por cinco a sete minutos ou até que os vermes formem um pellet após a centrifugação, aspire o sobrenadante e descarte-o no béquer contendo hidróxido de sódio um normal.Repita esta etapa de lavagem, adicionando M nove centrifusão e removendo o sobrenadante, pelo menos três vezes. Após a lavagem final, ressuspenda o pellet de vermes em uma quantidade mínima de M nove, pipete a suspensão de vermes em placas NGM contendo um gramado de bactérias OP 50. Após deixar o líquido secar por alguns minutos, selecione e transfira larvas J quatro com aparência saudável para placas frescas semeadas.Deixe os vermes mutagênicos se autofertilizarem cerca de oito a dez dias depois; use um microscópio estereoscópico para analisar os fenótipos da geração F2 em busca de mutantes excessivos de interesse. Este procedimento de mutagênese será demonstrado em vermes de ppac pacificus de quatro a cinco placas de Petri com diâmetro de seis centímetros, coletados em um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione 10 mililitros de M nove ao pellet de vermes.Inverta 20 vezes para lavar os vermes e centrifugue a 1500 Gs por cinco minutos. Descarte o sobrenadante após a centrifugação. Repita a lavagem dos vermes com M nove por um total de três vezes; após a lavagem final, aspire o líquido e ressuspenda os vermes em aproximadamente 10 vezes seu volume de M nove.Em seguida, adicione 4 5 8 trimetil SOREIN ou TMP a partir de um estoque de três miligramas por mililitro para obter uma concentração final de 30 microgramas por mililitro. Incube o tubo no escuro, em temperatura ambiente, em um agitador de baixa velocidade durante 15 minutos. Após a incubação, posicione o tubo verticalmente por 10 minutos para permitir que todos os vermes afundem. Neste vídeo, o tubo é mostrado descoberto, mas a solução de TMP não deve ser exposta à luz.Como este produto químico é sensível à luz, use uma pipeta Pasteur para remover os vermes do fundo do tubo e transferi-los para uma placa NGM não selada. Mantenha a placa no escuro até que o excesso de TMP seja absorvido pela placa. Uma vez que o TMP tenha sido absorvido pela placa, os vermes podem ser tratados com luz ultravioleta.Um dos passos mais críticos no procedimento de neurogênese TMP UV é ter a distância correta entre a fonte de UV de onda longa e a placa. Portanto, precisamos ajustar a distância algumas vezes para obter a intensidade correta de luz UV incidindo sobre a placa. A intensidade deve ser registrada pelo medidor de intensidade e deve ser de 500 micro watts por centímetro quadrado.Óculos de proteção adequados devem ser usados durante este passo devido ao risco potencial da luz UV. Utilizando um medidor de intensidade UV, determine a distância da fonte de luz UV de onda longa que resultaria em uma intensidade de 500 micro watts por centímetro quadrado.Em seguida, remova o papel alumínio e a tampa e posicione a placa contendo os vermes tratados com TMP a uma distância da lâmpada de modo que a intensidade na placa seja de 500 micro watts por centímetro quadrado. Exponha a placa à radiação UV de onda longa por 50 segundos, cubra-a e deixe os vermes no escuro por cinco horas à temperatura ambiente. Após cinco horas, selecione e transfira larvas J4 com aparência saudável para placas frescas com meio semeados.Por fim, examine a geração F1, F2 ou F3 em busca de fenótipos de interesse utilizando um microscópio estereoscópico. Aqui são mostrados alguns dos fenótipos mutantes de ppac pacificus identificados na geração F2 após mutagênese com EMS ou T-M-P-U-V. Os dois painéis superiores nessas imagens são exemplos de uma hermafrodita selvagem e de um macho selvagem.Cada mutante apresenta um fenótipo característico facilmente distinguível do animal selvagem. O painel C é um exemplo de um mutante dumpy. O painel D mostra um mutante não coordenado e o painel E é de um mutante transformer. Após dominar a técnica, a mutagênese com EMS pode ser realizada em quatro horas e meia, e a mutagênese com TMP uuv pode ser feita em cinco horas e meia, se realizada corretamente.Este período também inclui o tempo de incubação. Não se esqueça de que EMS e TMP são extremamente perigosos e que, ao trabalhar com eles, devem-se sempre tomar precauções, como usar um jaleco de laboratório, luvas duplas, capela de exaustão e óculos de proteção. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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