Name: Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-22T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda a transduzir retroviralmente receptores de células T em linfócitos de camundongo para imunologia e terapia do câncer. Este método eficiente expressa TCRs funcionais específicos de antígenos em células T murinas.

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Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (5U01CA137070) ea Sociedade Americana do Câncer (RSG-09-070-01-LIB), a Cancer Research Institute Investigator Award (MK), um American Heart Association comunhão pré-doutoramento (KM) e um Ministério espanhol da Educação e Ciência Fellowship (APG). Gostaríamos que a agradecer ao Dr. Nicholas Restifo e Dr. Zhiya Yu (NIH / NCI) para sugestões úteis para o protocolo.

1. Prepare Construct Retroviral <ol><li> Sub-clone do T-cell receptor gene (TCR) de interesse em um vetor retroviral (Figura 1, os vetores exemplo PMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs de Cellbiolabs). A TCR α e gene da cadeia β deve estar no mesmo vetor sob o controle do mesmo promotor para garantir a expressão igual. Se o TCR de interesse é humano, os domínios humanos constante necessidade de ser substituído por domínios do mouse constante 9. Nossa observação é que TCRs comprimento total humanos não expressar de forma estável no mouse células-T. </li><li> Prepare DNA de alta qualidade utilizando plasmídeo Maxi Kit Qiagen Prep ou produto similar. A concentração do plasmídeo deve ser em torno de 1 mg / mL. </li></ol> 2. Transfecção de células T e de isolamento Dia -1 (células embalagem Plate) <ol><li> Desalojar Platinum E-(Plat-E, Cellbiolabs) células embalagem retroviral com tripsina-EDTA e neutralizar com DMEM mídia. </li><li> Centrifugar as células a 1000 xg por 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em DMEM mídia. </li><li> Determinar o número de células e diluir as células de 0.6x10 6 mL /. ML placa, 10 de suspensão de células em uma placa de cultura 10 milímetros poli-lisina revestido de tecido e crescer durante a noite em uma cela incubadora a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> Dia 0 (transfecção) <ol start="4"><li> Na manhã seguinte, examine as células em um microscópio de luz. As células devem ser aproximadamente 80% confluentes. </li><li> Remova cuidadosamente os meios de comunicação da placa. Lave as células uma vez com PBS 1x e adicionar 10 mL pré-aquecido, fresca DMEM mídia sem penicilina-estreptomicina (Pen / Strep). (Nota: Pen / Strep podem interferir com a transfecção) </li><li> Prepare complexo transfecção. Preparar a mistura A e B da seguinte forma: <table border="0"><tbody><tr><td> Uma mistura: DNA plasmidial </td><td> 9 mg </td></tr><tr><td> PCL-Eco helper plasmídeo </td><td> 6,3 mg </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1,5 mL </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td> Mix B: Lipopfectime 2000 </td><td> 60 mL </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1,5 mL </td></tr></tbody></table> Incubar A e B separadamente por 5 minutos em temperatura ambiente Mix A e B juntos suavemente e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente para formar complexos transfecção. </li><li> Gotejamento lentamente a mistura (de 3 mL total) para as células Plat-E. Agite levemente o prato para trás e para distribuir a mistura de transfecção uniformemente. </li><li> Incubar as células a 37 ° CO C / 5 2% em uma incubadora de celular. </li><li> Depois de 6-8 horas, substituir média com 10 mL de meio DMEM fresco (com Pen / Strep) para a produção viral. </li></ol> Placa de revestimento com anticorpos <ol start="10"><li> Rato células-T precisam ser ativados antes de transdução viral. Há uma variedade maneiras para ativar as células-T. Aqui usamos placa ligado anticorpos anti-CD28 CD3e e anti-. Prepare uma mistura de anticorpos de 1 mg / mL de anti-CD3e e 2 mg / mL de anti-CD28 em PBS estéril. </li><li> Dispense 250 L da mistura de anticorpos em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços de tecido. A placa pode ser revestido durante a noite a 4 horas ou 2 ° C a 37 ° C. </li></ol> Preparação de uma única célula de suspensão de baço de rato <ol start="12"><li> Baço colheita mouse e transferência para meio RPMI. </li><li> Coloque o baço em um coador de celular. Mash o baço com um êmbolo da seringa em uma placa de cultura 5 centímetros de tecido. Enxágüe células fora do filtro de células com PBS esterilizado. </li><li> Centrífuga 1000 xg, 5 min. </li><li> Elimine o sobrenadante. Ressuspender pellet celular em tampão de lise ACK (2 mL por baço). Incubar 2-3 min à temperatura ambiente. Adicionar meio RPMI até 20 mL e centrifugar 1000 xg por 5 min. </li><li> Elimine o sobrenadante. Ressuspender celular em PBS estéril. Determinar o número de células e xg centrífuga 1000 para 5 min a 4 ° C. Proceder ao isolamento de células-T. </li></ol> Isolamento e ativação de células T do mouse <ol start="17"><li> Magneticamente rótulo as células de acordo com o manual do produto (CD8 + kit de isolamento de células T de Miltenyi Biotec). </li><li> Colocar uma coluna LS (Miltenyi Biotec), no magnetic campo. Aplicar suspensão de células marcado para a coluna. Colete de fluxo (enriquecido rato CD8 + T-cells). Lavar a coluna três vezes com 3 mL de tampão de acordo com o manual do produto e combinar com o anterior por escoamento. </li><li> Mancha as células com anticorpos anti-CD3e e anti-CD8a e analisar por citometria de fluxo (Figura 2a). Para uma separação típica, ~ 80-10% do total de células podem ser isoladas. ~ 90% das células CD8 + são isoladas células-T. </li><li> Centrifugar as células a 1000 xg, 5 min. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em meio RPMI com recombinante humana IL-2 (rhIL2, 20 ng / mL) em 1x10 6 / mL. </li><li> Pouco antes de adicionar as células, remoção da solução de anticorpos da placa (previamente preparado em 2.11). Enxágüe bem cada com PBS estéril e PBS remover. </li><li> Adicionar 1 mL da suspensão de células em cada poço. Colocar a placa a 37 ° C / 5% CO 2 em uma célula incubadora. </li></ol> 3. (Dia 2 e dia 3) Infecção de células T ativadas <ol><li> Após dois dias de produção de vírus, o meio na placa de células Plat-E deve tornar-se amarelo. Transfira o sobrenadante viral a um tubo de 15 mL cônico. Adicionar 10 mL de meio DMEM fresco para a placa para a produção viral mais (opcional). </li><li> Centrífuga sobrenadante vírus em 1000 xg por 5 min para remover detritos células. Transferir cuidadosamente o sobrenadante vírus para um novo tubo. Deixe um pouco de líquido na parte inferior do tubo e não perturbe os restos de células. </li><li> Coletar células T ativadas a partir da placa em um tubo cônico de 50 mL. Determinar o número de células. Salvar algumas células em um tubo separado para ser usado como controle (não-transduzidas) negativo. Centrifugar a 1000 xg por 5 min e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o pellet celular em vírus sobrenadante a 10 6 células por 1 mL com 20 ng / mL rhIL2 e 10 mcg / ml de sulfato de protamina. Adicionar 1 mL de suspensão de células em cada poço de uma placa de 24 poços. Ressuspender as células no tubo de controle em meio RPMI na densidade das células mesmo com a mesma quantidade de sulfato de protamina e rhIL2. Adicionar as células a mesma placa. </li><li> Embrulhe a placa com filme plástico. Centrifugar 90 minutos a 2000 xg, a 32 ° C, sem freio. </li><li> Após a centrifugação, remover o filme plástico. Adicionar 1 mL de meio RPMI fresco com 20 ng / mL rhIL2 a cada poço. Coloque a placa de volta para a incubadora. </li><li> (Opcional) Nível Superior expressão de TCR podem ser alcançados através da coleta do sobrenadante vírus e repetir o procedimento de infecção no dia 3. </li></ol> 4. Expansão das células e Avaliação da Eficiência Transdução <ol><li> Examine o transduzidas células T diariamente. Dividir as células em proporções 01:03, quando necessário, em meio RPMI rhIL2. Não deixe que a overgrow células (média fica amarelo). </li><li> No dia 6 ou 7 dias, mancha as células com o anticorpo e tetrâmero MHC específico para o TCR para avaliar a expressão da TCR em células T de superfície. Use o un-transduzidas células-T como controle (Figura 2c). </li><li> O transduzidas células-T estão prontos para novas aplicações a jusante. </li></ol> 5. Resultados representante Muitas vezes é vantajoso para purificar de células T subconjuntos antes de transdução embora esplenócitos pode ser transduzidas sem purificação. Alta pureza de células T subconjuntos pode ser obtida usando comercial esferas magnéticas (Figura 2a). Para avaliar o nível de expressão de TCRs sobre as células T, anticorpos específicos para TCR alfa ou beta cadeias podem ser usados. Tipicamente 30% a 80% das células podem expressar transduzidas TCR (Figura 2b), dependendo do genes TCR e os títulos de vírus. MHC específico tetrâmero para a TCR também pode ser usado para comprovar expressão funcional de TCRs (Figura 2c). <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Exemplo de células T do gene do receptor construir sub-clonado em um vetor retroviral. Alpha de comprimento total e genes de cadeia beta estão ligadas por uma auto-linker peptídeo clivável 2A 8. <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Exemplo de isolamento bem sucedido e transdução de células T do mouse. (A) células-T CD8 foram isoladas de esplenócitos usando CD8a + T Celular Isolation Kit (Miltenyi Biotec) e corados com anticorpos anti-CD3e e anti-CD8a. Isolado células-T CD8 foram transduzidas com R6C12 TCR específico para humanos gp100: 209 -217 peptídeo 4 e corados com anti-humano Vbeta 8 de anticorpos (b) e HLA-A2kb gp100 tetrâmero (c).

<ol><li>Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+T+cells+%27see%27+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">How T cells 'see' antigen.</a> Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).</li>
<li>Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen%2FMHC-specific+T+cells+are+preferentially+exported+from+the+thymus+in+the+presence+of+their+MHC+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand.</a> Cell. 58, 1035-1046 (1989).</li>
<li>Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poor+immunogenicity+of+a+self%2Ftumor+antigen+derives+from+peptide-MHC-I+instability+and+is+independent+of+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance.</a> J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).</li>
<li>Holst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).</li>
<li>Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+regression+in+patients+after+transfer+of+genetically+engineered+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes.</a> Science. 314, 126-129 (2006).</li>
<li>Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+retroviral+vectors+for+potential+use+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy.</a> Gene Ther. 1, 136-138 (1994).</li>
<li>Szymczak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+%27self-cleaving%27+2A+peptide-based+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).</li>
<li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+%28TCR%29+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR%2FCD3+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).</li>
<li>Letourneur, F., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+a+T+cell+hybridoma+variant+deprived+of+functional+T+cell+receptor+alpha+and+beta+chain+transcripts+reveals+a+nonfunctional+alpha-mRNA+of+BW5147+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin.</a> Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).</li>
<li>Bendle, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+graft-versus-host+disease+in+mouse+models+of+T+cell+receptor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy.</a> Nat. Med. 16, 565-570 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Várias etapas são fundamentais para alcançar ótimos resultados. Plat-E linhagem de células de embalagens deve ser mantido em condição saudável. Se necessário, as células podem ser várias passagens algumas vezes em meio DMEM com 1 mg / mL puromicina, 10 mcg / ml blasticidin para evitar a perda de expressão retroviral estrutura da proteína. No dia da transfecção, as células devem ser confluentes ~ 80%. Células muito poucos ou muitos podem reduzir o título de vírus. A qualidade do vírus pode ser verificado através de estudos com linhas celulares que podem ser facilmente transduzidas. Desde TCRs exigem CD3 complexos a ser expressa na superfície das células, que usam rotineiramente 58α-/β- células de hibridoma 10 (uma linhagem celular que não expressa endógena TCR α ou β da cadeia, mas se expressa complexo CD3). Obtemos quase 100% de eficiência de transdução de células de hibridoma quando transdução de células com 1 mL do sobrenadante vírus. Finalmente, as células-T precisam ser ativados e proliferando porque retrovírus só pode infectar células em divisão ativa. O método aqui apresentado para a produção de antígenos específicos de células T tem várias limitações. Primeiro, é difícil de alcançar eficiência de transdução de 100% para primário do mouse células-T. Uma parte das células não expressam o TCR de interesse. Segundo, o transduzidas TCR α e cadeias β pode mispair com TCRs endógena 9, que pode reduzir o nível de expressão da TCR de interesse. Além disso, o TCRs mispaired pode causar auto-imunidade in vivo 11. Finalmente, há apenas um prazo limitado a transduzidas células-T pode ser usado. Após cerca de uma semana, as células em apoptose não ser que seja re-estimulado. No entanto, as células podem tornar-se esgotado e perder funções com repetitivas re-estímulos.

Media: DMEM (DMEM calor +10% inativado FBS + Pen / Strep + L-Glu + Piruvato de sódio + ácido não-aminoácidos essenciais). DMEM sem Pen / Strep (Same como meio DMEM, mas sem acrescentar Pen / Strep). Meio RPMI (RPMI calor +10% inativado FBS + L-Glu + ácido não-aminoácidos essenciais + β-Mercaphoethanol + Pen / Strep Piruvato de Sódio +).

transdução retroviral de receptor de células t no rato células t

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Receptores de células T (TCRs) desempenham um papel central no sistema imunológico. TCRs na T-cell superfícies podem especificamente reconhecer antígenos peptídeos apresentados por células apresentadoras de antígenos (APCs) 1. Este reconhecimento leva à ativação de células T e uma série de resultados funcionais (por exemplo, produção de citocinas, matando as células-alvo). Compreender o papel funcional de TCRs é fundamental para aproveitar o poder do sistema imunológico para tratar uma variedade de doenças relacionadas imunologia (por exemplo, câncer ou de auto-imunidade). É conveniente estudar TCRs em modelos de ratos, que pode ser feito de várias maneiras. Fazendo TCR modelos transgênicos do mouse é caro e demorado e, atualmente, existem apenas um número limitado deles disponíveis 2-4. Alternativamente, os camundongos com antígenos específicos de células T podem ser gerados pela medula óssea quimera. Este método também leva várias semanas e requer expertise 5. Transdução retroviral de TCRs em in vitro do mouse ativado células-T é um método rápido e relativamente fácil de obter células-T de especificidade desejada peptídeo-MHC. Antígeno-específica de células T podem ser gerados em uma semana e usado em todas as aplicações a jusante. Estudando transduzidas células-T também tem aplicação direta à imunoterapia humana, como a transferência adotiva de células T humanas transduzidas com antígeno específico TCRs é uma estratégia emergente para o tratamento do câncer 6. Aqui apresentamos um protocolo para a transdução retrovirally TCRs em in vitro do mouse ativado células-T. Ambos os genes humanos e do rato TCR podem ser usados. Retrovírus portadores de genes específicos TCR são gerados e usados ​​para infectar rato células T ativadas com anticorpos anti-CD3 e CD28-anti. Depois de na expansão in vitro, células-T transduzidas são analisados ​​por citometria de fluxo.

Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução retroviral

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

Os receptores de células T (TCRs) desempenham um papel central no sistema imunológico. Os TCRs nas superfícies das células T podem reconhecer especificamente antígenos peptídicos apresentados por antígenos...

O objetivo deste procedimento é expressar receptores de células T específicos por antígenos funcionais em células T de camundongo. Primeiro, transfecte uma linhagem celular produtora de retrovírus com um plasmídeo contendo o gene do TCR de interesse para empacotar o retrovírus que expressa o TCR. Em seguida, isole e purifique células T de baços de camundongo e infecte essas células T purificadas com o retrovírus produzido na primeira etapa.Por fim, expanda os linfócitos T transduzidos para expressar e obter níveis apreciáveis de receptor. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram a expressão de TCRs funcionais específicos por antígeno em linfócitos T de camundongo por citometria de fluxo. Olá, meu nome é Michelle Crow Guard.Estou no Instituto de Câncer da NYU na Escola de Medicina da NYU. Hoje vamos mostrar como transduzir linfócitos T primários; as pessoas que irão demonstrar esse procedimento serão Shiong, pós-doutoranda do laboratório, Kaleena Melek, aluna de pós-graduação do laboratório, e Arian Perez Garcia, pós-doutorando do laboratório. A principal vantagem dessa técnica em comparação com métodos existentes, como camundongos transgênicos, é que ela é muito menos demorada.Este método pode ajudar a responder perguntas imunológicas fundamentais, como qual TCR pode proporcionar melhor resposta contra antígenos. Esta técnica pode ser aplicada na terapia de transferência adotiva de linfócitos T, que tem demonstrado ser promissora para o tratamento de pacientes com câncer e consiste na modificação in vitro de linfócitos T humanos para garantir expressão igualitária das cadeias alfa e beta do receptor de células T. Subclone o gene de interesse no mesmo vetor retroviral sob controle do mesmo promotor.Prepare o DNA plasmídico de alta qualidade utilizando o kit Kyogen Maxi prep e faça um estoque de um micrograma por microlitro. Remova o meio do poço com células empacotadoras retrovirais do platina E e lave o poço uma vez com um XPBS. Solte as células adicionando tripsina EDTA e incube a 37 graus Celsius por alguns minutos.Neutralize as células desprendidas com meio DMEM e transfira para um tubo cônico. Em seguida, centrifugue as células a 1000 vezes G durante cinco minutos. Aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em meio DMEM.Determine o número de células e dilua as células a 0,6 vezes 10 à sexta por mililitro da placa. Adicione 10 mililitros de suspensão celular em uma placa de cultura de tecidos revestida com polilisina de 10 milímetros e cultive durante a noite em uma incubadora de células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, examine as células em um microscópio óptico para verificar uma confluência aproximada de 80%.Remova cuidadosamente o meio da placa. Lave as células uma vez com PBS 1X e adicione 10 mililitros de meio DMEM fresco pré-aquecido, sem penicilina nem estreptomicina. Para o complexo de transfeção lipídico, prepare duas misturas: uma de opti-MEM com DNA e outra de reagente lipofectâmico, equilibrando-as separadamente por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, misture suavemente e incube por 20 minutos. À temperatura ambiente, adicione gota a gota a mistura nas células E de platina. Agite suavemente a placa para frente e para trás para distribuir uniformemente a mistura de transfeção.Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma estufa celular. Após seis a oito horas, substituir o meio por 10 mililitros de meio DMEM fresco para produção viral. Coletar o baço de um camundongo e transferi-lo para meio RPMI.Coloque o baço em um filtro celular. Macere o baço com o êmbolo de uma seringa em uma placa de cultura de tecidos de cinco centímetros. Lave as células do filtro celular com PBS estéril para colher as células e centrifugue a 1000 vezes G durante cinco minutos.Descarte o sobrenadante. Prossiga ressuspendendo o pellet celular em um tampão de lise CK. Adicione dois mililitros por baço e incube por dois minutos.À temperatura ambiente. Adicione meio RPMI até 20 mililitros e centrifugue a 1000 ×g por cinco minutos. Por fim, ressuspenda o pellet celular em PBS estéril.Determine o número de células e centrifugue a 1000 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Para ativar os linfócitos T de camundongo antes da transdução viral, recubra as placas com anticorpos ativadores, nomeadamente anti-CD3 épsilon e anti-CD28. Prepare uma mistura de anticorpos contendo um micrograma por mililitro de anti-CD3 épsilon e dois microgramas por mililitro de anti-CD28 em PBS estéril, distribua 250 microlitros da mistura de anticorpos em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços e incube por duas horas a 37 graus Celsius.Rotule magneticamente as células do baço de acordo com o manual do produto. Coloque uma coluna LS no campo magnético. Aplique a suspensão de células rotuladas na coluna.Coletar o fluxo proveniente de células T CD8+ enriquecidas de camundongo. Lavar a coluna três vezes com três mililitros de tampão e combinar com o fluxo anterior. Marcar as células com anticorpos anti-CD3 épsilon e anti-CD8 alfa e analisar por citometria de fluxo.Em seguida, centrifugue as células a 1000 vezes G durante cinco minutos e re-suspenda o pellet celular em 1 milhão de células por mililitro em meio RPMI com IL-2 humana recombinante. Remova a solução de anticorpo da placa de ativação. Enxágue cada poço com PBS estéril.Adicione um mililitro da suspensão celular a cada poço e coloque a placa a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, em um incubador de células. Após dois dias de produção do vírus, o meio na placa de células platinum ESE deve ficar amarelo.Transfira o sobrenadante viral para um tubo cônico de 15 mililitros para remover os detritos celulares. Centrifugue o sobrenadante do vírus S a 1000 ×g durante cinco minutos. Transfira cuidadosamente o sobrenadante viral para um novo tubo.Deixe um pouco de líquido no fundo do tubo e não perturbe os detritos celulares. Colete os linfócitos T ativados da placa em um tubo cônico de 50 milímetros. Determine o número de células.Guarde algumas células em um tubo separado para serem usadas como controle negativo; centrifugue a 1000 vezes G durante cinco minutos e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular no sobrenadante viral a 10⁶ células por mililitro com 20 nanogramas por mililitro de interleucina-2 humana recombinante e 10 microgramas por mililitro de sulfato de proteína.Adicione um mililitro de suspensão celular a cada poço da placa de 24 poços para o tubo controle. Resuspenda as células em meio RPMI na mesma densidade celular com a mesma quantidade de proteína recombinante humana, interleucina dois e sulfato de proteína. Adicione as células à mesma placa.Cubra a placa com filme plástico e centrifugue por 90 minutos a 2000 vezes G a 32 graus Celsius sem interrupção. Após a centrifugação, remova o filme plástico. Adicione um mililitro de meio RPMI fresco contendo 20 nanogramas por mililitro de interleucina-2 humana recombinante a cada poço e coloque a placa de volta no incubador.É importante examinar diariamente as células T transduzidas. Divida as células em proporções de um para três quando necessário. Não permita que as células se sobreponham nem que o meio fique amarelo no sexto ou sétimo dia.Marque as células com anticorpo e tetramero de MHC específico para o TCR para avaliar a expressão do TCR na superfície das células T. Utilize as células T UNSD como controle. Essas células T transduzidas estão agora prontas para aplicações downstream adicionais.Antes da transdução viral, é vantajoso obter subpopulações de linfócitos T com alta pureza utilizando microesferas magnéticas comerciais para avaliar o nível de expressão dos TCRs em linfócitos T. Podem ser utilizados anticorpos específicos para as cadeias alfa ou beta do TCR.Normalmente, de 30% a 80% das células podem expressar o TCR transduzido, dependendo dos genes do TCR e da titulação viral. O tetrâmero de MHC específico para o TCR também pode ser usado para verificar ainda mais a expressão funcional dos TCRs. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em uma semana, se executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as células em boas condições de saúde após seguir este protocolo. Outros métodos, como ensaios de liberação de citocinas ou de citotoxicidade ácida, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a especificidade e a sensibilidade da transdução dos TCRs.Depois de assistir a este vídeo, você deverá ser um especialista em transduzir seu TCR favorito em linfócitos T primários. Até logo no laboratório.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Esta técnica demonstra uma forma eficiente de preparar replicação defeituosa stocks retroviral codificação de um oncogene humano, e posteriormente utilizado para indução de doença mieloproliferativa no modelo de mouse.

Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

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Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T...

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Apresentamos um protocolo rápido e flexível para um único sistema de expressão in vivo baseado em receptor de células T (TCR) retroviral.  Vetores retrovirais são usados para transduzir células progenitoras da medula óssea para estudar o desenvolvimento de células T e a função de um único TCR in vivo como uma alternativa aos camundongos transgênicos TCR.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

Descreve-se aqui um novo método para gerar receptores de células T específicas para o antigénio (TCR) por emparelhamento a TCRα ou TCRβ de um TCR existente, possuindo a especificidade do antigénio de interesse, com hemichain complementar do repertório do receptor de células T periféricas. Os TCRs gerados de novo manter-antigénio com especificidade uma afinidade variável.

Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

Muitos sistemas experimentais foram utilizados para compreender os mecanismos de regulação do desenvolvimento e função de células T numa resposta imunitária. Aqui uma abordagem genética utilizando transdução retroviral é descrito, que é económico, eficiente tempo, e, o mais importante, altamente informativos na identificação de vias reguladoras.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

O atual combina de protocolo único celular emparelhado humana TCR alfa e beta cadeia sequenciamento com simplificada geração de vetores retrovirais compatíveis com expressão de TCR in vitro e in vivo .

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Delineamos um protocolo de 9 dias para a transdução e expansão de células mononucleares periféricas rhesus macaque que produz células com excelente co-expressão dos genes de interesse em número suficiente para estudos de infusão da eficácia celular.

Transdução e expansão de células T primárias em nove dias com manutenção do fenótipo da memória central

Aqui descrevemos um método de superexpressão retroviral e transferência adotiva de células murine B-1a para examinar a migração e localização celular in vivo B-1a. Este protocolo pode ser estendido para diversos ensaios funcionais a jusante, incluindo quantificação da localização celular do doador B-1a ou análise de fatores secretos derivados de células doadoras pós-transferência adotiva.

Superexpressão retroviral de CXCR4 em células Murine B-1a e transferência adotiva para migração de células B-1a direcionadas para a produção de medula óssea e igM

O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Apresentamos protocolos aprimorados para transdução retroviral de receptores de tráfego e homing competitivo para estudar o posicionamento de linfócitos específicos de órgãos e microambientes mediados por receptores. Este método oferece informações valiosas sobre os mecanismos de tráfego de células imunes e tem aplicações potenciais em futuras pesquisas básicas e terapêuticas.

Transdução retroviral eficiente e homing competitivo para investigar a localização de células T mediadas por GPCR em diversos microambientes teciduais

Aprenda a transduzir retroviralmente receptores de células T em linfócitos de camundongo para imunologia e terapia do câncer. Este método eficiente expressa TCRs funcionais específicos de antígenos em células T murinas.

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

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